鎘脅迫對東營野生大豆幼苗抗氧化系統(tǒng)及可溶性蛋白的影響

尚玉坤，劉思凱，陳楊晗，劉 鱺，唐學博，秦宗志，廖進秋

（四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，四川 雅安625014）

2014年四川省環(huán)保廳和國土廳聯(lián)合發(fā)布《四川省土壤污染狀況調(diào)查公報》[1]中指出四川省由于工業(yè)的快速發(fā)展以及農(nóng)業(yè)中化肥的不合理使用，土壤環(huán)境污染狀況形勢嚴峻，攀西地區(qū)、成都平原區(qū)和川南地區(qū)等部分地區(qū)土壤重金屬污染問題較突出，其中Cd是主要污染物。土壤中的Cd主要來自成土母質(zhì)，含量范圍一般為0.01～2 mg/kg[2]。土壤中Cd含量增加，嚴重威脅人們的食品安全。Cd污染地區(qū)種植水稻和小麥等農(nóng)產(chǎn)品的Cd含量容易超標[3-4]。當Cd2+在植物體內(nèi)富集到一定程度時，會影響植物體的生長，從而使植物表現(xiàn)出植株矮小、生長遲緩、產(chǎn)量下降等癥狀[5-7]。相關(guān)研究表明：小麥籽粒、花生幼苗和大豆中Cd含量與土壤中Cd含量呈正相關(guān)[8-9]。而大豆不同部位對Cd的吸收能力存在差異，表現(xiàn)為根＞莖＞葉＞籽粒[10]。

四川省栽培大豆缺乏優(yōu)良種質(zhì)資源，加上無選擇性的引種，經(jīng)常會因為不適宜本地區(qū)的土壤和環(huán)境特征而減產(chǎn)，甚至絕收，給大豆相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[11-12]。野生大豆是大豆種質(zhì)資源庫中很重要的組成部分，是栽培大豆的近緣祖先種，常見的栽培大豆有些性狀不能滿足人們的需求，如抗逆性差。而野生大豆在長期的自然選擇過程中形成了較為豐富的變異類型，如攜帶抗病蟲害、抗旱、抗寒、耐鹽堿、結(jié)莢多而密等有利基因，是栽培大豆遺傳育種的重要資源，也是大豆起源、演化、生態(tài)、分類、生理等研究不可多得的育種材料，可以通過野生大豆資源進行栽培品種的遺傳改良[13]。

高等植物可以耐受一定濃度的Cd脅迫，通過酶促系統(tǒng)降低重金屬對植物細胞的損害。例如：低濃度Cd脅迫條件下，玉米幼苗可通過本身的調(diào)節(jié)機制，增強抗氧化酶活性，從而促進玉米幼苗生長，而高濃度則表現(xiàn)為抑制作用[14]。另外，棉花可以忍受Cd的長期毒害而不會大幅度減產(chǎn)，這意味著棉花具有較強的耐鎘脅迫能力[15]。小麥幼苗在Cd脅迫條件下，SOD、CAT均失去活性而POD活性隨處理濃度增加而增加，表明POD積極參與了脅迫條件下活性氧的清除[16]。在逆境下還可以通過可溶性蛋白滲透調(diào)節(jié)適應環(huán)境的改變，增強細胞的保水能力，對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用[17]。但過量的Cd會通過損傷植物細胞結(jié)構(gòu)、破壞酶活性、抑制根系生長、抑制水分和養(yǎng)分的吸收等方式抑制植物生長甚至導致死亡[18]。不同植物富集鎘的能力不同[19]，不同植物對鎘脅迫的耐受能力差異較大[20-21]，大豆是我國居民日常生活中食用油和蛋白質(zhì)的主要來源，在農(nóng)作物中具有較高經(jīng)濟價值，但是會在籽粒中積累Cd[22]。因此，研究大豆耐Cd脅迫能力，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

野生大豆是大豆種質(zhì)資源優(yōu)良的基因庫[23-24]，不同大豆品種耐鎘差異及抗鎘毒害效應差異較大。例如，Cd處理條件下，綜合考慮相對生物量和籽粒干重指標，桂夏豆2號、巴西3號是耐性品種。相同Cd脅迫條件下巴西10號、福豆234、華夏4號和中黃24表現(xiàn)出對Cd脅迫較為敏感的特征[25]。2.50 mg/L Cd脅迫條件下，湘春豆13、沔1101大豆株高及生物產(chǎn)量比對照組下降較少，是抗Cd脅迫能力較強的品種[26]。盡管如此，仍有很多優(yōu)良基因還未被發(fā)掘。因此，對野生大豆進行研究，對合理的利用和保護野大豆基因資源具有非常重要的意義[27]。本試驗采用的野生大豆采自山東省東營市的鹽堿地，生存環(huán)境惡劣。為評價該野生大豆種質(zhì)資源的耐鎘能力，通過在不同濃度Cd脅迫條件下，對野生大豆的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、丙二醛（MDA）及可溶性蛋白（soluble protein）含量的變化情況進行測定，以期為四川地區(qū)鎘污染土壤栽培大豆的安全生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為山東東營（東經(jīng)118°5'，北緯38°15'）野生大豆。

1.2 試驗方法

挑選飽滿、成熟度一致的東營野生大豆種子，用砂紙摩擦破皮后，用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，用去離子水反復沖洗，再將種子放入去離子水中于25℃恒溫培養(yǎng)箱中浸種12 h。然后播種于標準大培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿播種50顆，置于光照培養(yǎng)箱（MLR-352H-PC，日本松下）（光照14 h，溫度25.0℃，黑暗10 h，溫度20.0℃、濕度65%）至展開一對子葉。挑選長勢一致的幼苗移栽至裝滿蛭石的圓柱形塑料桶（直徑28 cm、深17 cm）中，每桶4株于植物培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，光照強度350μmol/（m2·s），光照時間12 h；晝、夜溫度分別為25.0℃和20.0℃；相對濕度65%～70%。利用營養(yǎng)液1/2 Hoagland配制Cd2+處理溶液：0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L。每3天定期向每桶注入500 mL的Cd2+處理溶液，每個濃度處理3次重復。在Cd脅迫處理45天時開始收集樣品，之后每隔7天收集一次樣品，連續(xù)收集4 w。采集東營野生大豆頂端倒數(shù)第5、6、7片長勢一致的葉片，去葉脈后約0.5 g，進行相應指標的測定。

1.3 測定方法

每個處理取0.5 g新鮮葉片于預冷的研缽中，加2 mL磷酸緩沖液研磨成漿，加緩沖液使終體積為10 mL，于10 000 r/min下離心10 min，上清液即為提取液，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

SOD活性測定采用氮藍四唑光化還原法[28]，以抑制NBT光還原的50%為1個酶活性單位（U/min·g）。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[29]，以每分鐘內(nèi)A470變化0.1為1個酶活性單位（U/min·g）。SOD和POD均采用可見光分光光度計（日本，島津，UV-1760）檢測。

CAT活性測定采用紫外吸收法[30]，以每分鐘內(nèi)A240減少0.1為1個酶活單位（U/min·g）。可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[31]。丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[32]，稱取不同處理濃度的野生大豆鮮葉1 g于預冷的研缽中，加入2mL 10%TCA研磨至勻漿，再加8mL TCA進一步研磨，于4 000 r/min離心10 min，上清為樣品。4℃下保存?zhèn)溆?。以上?shù)據(jù)均采用雙光束紫外可見分光光度計（A560型，翱藝，UTA13L0006）進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用Microsoft Excel 2010整理試驗數(shù)據(jù)，用Origin 9進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理及圖表制作，用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，采取Duncan's multiple angetest法進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對野生大豆葉片抗氧化酶活性的影響

當用Cd處理濃度分別為0.5、2.0、4.0和8.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第45天時，野生大豆SOD活性顯著增加了12.7%，43.3%、49.0%、49.7%。當Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第52天時，SOD活性顯著增加了10.5%、43.1%、46.7%、45.2%。當Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第59天時，SOD活性顯著增加了11.6%、16.0%、56.5%、62.1%、57.1%。當Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第66天時，SOD活性顯著增加了12.7%、17.1%、46.9%、49.8%、41.7%。當Cd脅迫濃度為16.0 mg/L時，野生大豆各個處理時間段的SOD活性相比于對照分別顯著性降低了20.7%、14.7%、17.3%、26.2%。在不同濃度Cd處理條件下，隨著處理時間的延長SOD活性均呈顯著性增加的趨勢（見表1）。

當用含Cd濃度為4.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第45天時，POD的活性顯著增加了31.2%；當用含Cd濃度為2.0、8.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第66天時，POD的活性顯著降低了27.3%，24.8%。當Cd脅迫濃度為16.0 mg/L時，野生大豆各個處理時間段的POD活性相比于對照分別顯著性降低了30.0%、44.2%、53.3%、44.5%。隨著脅迫時間延長，當Cd處理濃度為1.0 mg/L時，POD的活性相比于對照有顯著性增加，而當Cd處理濃度分別為0.25、0.5、8.0、16.0 mg/L時，POD的活性相比于對照都沒有顯著性變化（見表2）。

表1 不同濃度鎘脅迫下野生大豆葉片SOD活性Table 1 SOD activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

表2 不同濃度鎘脅迫下野生大豆葉片POD活性Table 2 POD activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第45天時，CAT活性顯著增加了50.3%、41.2%、93.9%、77.6%。當用Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第52天時，CAT活性顯著增加了28.0%、42.9%、77.4%、93.5%、89.3%；當用Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第59天時，CAT活性顯著增加了31.5%，41.5%、72.5%、81.5%、4.5%。當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第66天時，CAT活性顯著增加了26.8%、24.7%、46.8%、46.8%，而當Cd濃度為16.0 mg/L時，CAT活性顯著降低了13.6%。當Cd處理濃度為16.0 mg/L時，隨處理時間的延長CAT活性呈先顯著降低再顯著增加的趨勢，而其他處理濃度則呈顯著性增加的趨勢，如表3所示。

表3 不同濃度鎘脅迫下野生大豆CAT活性Table 3 CAT activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

2.2 Cd2+對野生大豆葉片丙二醛含量的影響

當用Cd濃度為8.0和16.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第45天時，MDA含量顯著增加了21.8%、37.1%。當用Cd濃度為1.0、2.0、8.0和16.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第52天時，MDA含量顯著增加了6.5%、9.5%、14.9%、18.5%。當用Cd濃度為4.0、8.0和16.0 mg/L營養(yǎng)液處理幼苗第59天時，MDA含量顯著增加了16.4%、22.2%、31.6 %；當用Cd濃度為4.0、8.0和16.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第66天時，MDA含量顯著增加了18.2%、22.2%、48.3%，而當Cd處理濃度為0.25和0.5 mg/L時，MDA含量顯著降低了10.2%、9.7%（見圖1A）。當Cd處理濃度為0、4.0 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈顯著增加的趨勢。當Cd處理濃度為0.25、0.5 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈顯著降低的趨勢。當Cd處理濃度為1.0 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈先顯著增加后顯著降低的趨勢。當Cd濃度為16.0 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈先顯著降低后顯著增加的趨勢（見圖1B）。

2.3 Cd2+對野生大豆葉片可溶性蛋白含量的影響

當用Cd濃度為4.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第45天時，可溶性蛋白含量顯著增加了76.2%，而Cd處理濃度為0.5和16.0 mg/L時，可溶性蛋白含量顯著降低了4.8%、11.9%。當用Cd濃度為1.0、2.0和4.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第52天時，可溶性蛋白含量顯著增加了23.5%、28.4%、64.2%，而Cd處理濃度為16.0 mg/L時，可溶性蛋白含量顯著降低了16.0%。當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第59天時，可溶性蛋白含量顯著增加了26.0%、27.3%、92.2%、18.2%。當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L的營養(yǎng)液處理幼苗第66天時，可溶性蛋白含量顯著增加了15.9%、14.6%、84.1%、13.4%（見圖2A）。當Cd處理濃度大于等于1.0 mg/L時，隨處理時間的延長可溶性蛋白含量沒有顯著性變化。當Cd處理濃度為0和0.25 mg/L時，隨處理時間的延長可溶性蛋白含量呈顯著性降低的趨勢（見圖2B）。

3 討論與結(jié)論

Cd是植物的非必需元素，土壤或水體中過量的Cd被植物吸收后會對植物產(chǎn)生一系列的毒害作用[33]。正常情況下植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，不會影響植物正常生長。受Cd2+脅迫后，活性氧在植物體內(nèi)的動態(tài)平衡被破壞，導致植物體的自由基代謝失衡，產(chǎn)生諸如O2-（超氧陰離子）和H2O2等大量活性氧[34]。O2-和H2O2的積累能夠氧化生物分子，打破活性氧代謝平衡導致膜脂過氧化進而破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。丙二醛則是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，它的積累能夠反映植物體內(nèi)自由基的活動狀態(tài)，其含量越高反應植物膜脂過氧化程度越高[35]。本研究中，隨著Cd處理濃度的增加，MDA的含量呈顯著增加的趨勢，表明野生大豆植物體內(nèi)活性氧大量積累，并激活了植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，誘導抗氧化酶活性發(fā)生了改變[36-37]。

SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)存在的一組有效清除細胞內(nèi)活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)。SOD、POD、CAT這3種酶活性峰值所對應的處理時間和濃度不同，說明它們通過不同的耐脅迫機理共同協(xié)作清除植物體內(nèi)氧化物，減輕不利的生長條件下帶來的氧化傷害[38]。SOD能夠催化O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，POD和CAT能夠?qū)2O2分解為無毒的水，三者共同作用能夠在一定程度上緩解或防御鎘脅迫的傷害，對保護細胞膜的完整性和防御活性氧對細胞膜的傷害有重要作用[39-40]。本試驗中，當Cd濃度小于等于8.0 mg/L時，SOD、CAT活性升高，這與棉花、擬南芥等作物在Cd2+脅迫下的反應一致[41-42]。盡管在該濃度范圍內(nèi)MDA含量增加，但受SOD、POD、CAT的保護作用，降低了植物受到的過氧化損傷。在東營野生大豆抗氧化酶系統(tǒng)中可能主要由SOD和CAT清除活性氧帶來的傷害，POD起輔助作用，此調(diào)節(jié)機制能使植物適應并抵抗一定程度的傷害。

圖1 鎘脅迫下野生大豆的MDA含量Figure 1 The MDA content of wild soybean under Cd stress

重金屬離子進入植物體后，與其他化合物結(jié)合成金屬絡合物或螯合物，抑制植物各種代謝活動尤其是蛋白質(zhì)的合成。因此，可溶性蛋白質(zhì)含量是衡量植物是否發(fā)生重金屬脅迫的重要指標[43]。低濃度的Cd溶液會導致可溶性蛋白含量增加，而可溶蛋白質(zhì)含量的提高很可能是植物抵抗鎘毒害的一種解毒機制，例如鎘能誘導產(chǎn)生鎘結(jié)合蛋白，而降低鎘的毒性?？扇艿鞍踪|(zhì)含量的提高，還會增加細胞滲透濃度和功能蛋白的數(shù)量，有助于維持細胞正常代謝[44]。本研究中，當Cd濃度小于等于8.0 mg/L時，可溶性蛋白含量呈顯著增加的趨勢，表明東營野生大豆緩解了Cd脅迫帶來的不利影響，降低了Cd脅迫帶來的危害。

當Cd處理濃度為16.0 mg/L時，SOD、POD、CAT活性顯著低于對照，MDA含量升高，可溶性蛋白含量降低，說明在此濃度處理下植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡被打破，活性氧自由基大量產(chǎn)生導致細胞膜脂過氧化加劇，野生大豆的抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)受到損傷[45-46]。高濃度Cd會加速原有蛋白質(zhì)的分解以及破壞合成蛋白質(zhì)的細胞器抑制蛋白質(zhì)合成從而對細胞產(chǎn)生毒害作用[47]。在該濃度條件下，可溶性蛋白含量顯著降低表明野生大豆中Cd進入細胞后很可能促進了蛋白水解酶的活性，加強了原有蛋白質(zhì)分解，或者使蛋白質(zhì)合成的相關(guān)細胞器受到損傷，抑制了新蛋白的合成[48]。本研究結(jié)果表明，當Cd處理濃度為16.0 mg/L時，野生大豆無法通過自身調(diào)節(jié)抵消Cd脅迫帶來的危害，生長明顯受到抑制。

圖2 鎘脅迫下野生大豆的可溶性蛋白含量Figure 2 The soluble protein content of wild soybean under Cd stress

綜上所述，當Cd脅迫濃度小于等于8.0 mg/L時，野生大豆植株通過激活抗氧化酶系統(tǒng)以及可溶性蛋白含量的變化防御不同濃度鎘脅迫帶來的氧化傷害，減輕或緩解鎘脅迫帶來的不利影響，東營野生大豆能正常生長。東營野生大豆為抗Cd能力較強的種質(zhì)資源。利用東營野生大豆優(yōu)良基因資源，可豐富生產(chǎn)實踐過程中的大豆基因庫，為四川地區(qū)栽培大豆在鎘污染地區(qū)的安全生產(chǎn)提供種質(zhì)資源。