白肋煙煙葉氮同化能力及其對硝酸鹽積累的影響

李亞飛，常棟，馮雨晴，楊惠娟，王景，王俊，史宏志

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，鄭州文化路95號 450002；

2 河南省煙草公司平頂山市公司，河南省平頂山市建設(shè)路西段263號 467002

白肋煙是一種典型的葉色黃綠突變的煙草類型，是由Yb基因突變引起的葉綠素缺乏表型，其煙葉色素含量僅為普通綠葉煙草的1/3左右[1]。白肋煙在混合型卷煙的葉組配方中約占30%，對調(diào)控其感官質(zhì)量和吸食品質(zhì)均具有重大貢獻[2]。白肋煙煙葉硝酸鹽明顯較其它煙草類型高，但其積累原因不明，對提高煙葉安全性十分不利。

在生產(chǎn)中，白肋煙施氮量較烤煙高3～5倍，但煙葉產(chǎn)量卻未有顯著差異[3-4]。白肋煙煙葉硝酸鹽含量高，氮效率和氮素利用率低，易造成環(huán)境問題和資源浪費[5]。Lewis等[6]研究指出白肋煙Yb基因突變與煙葉硝酸鹽和TSNA積累存在密切關(guān)系。硝酸鹽是煙葉TSNA形成的重要前體物[7-8]。Fischer等[9]研究認為煙葉硝酸鹽含量水平是TSNAs的一個重要指示物，硝酸鹽還原形成亞硝酸鹽過程可能是限制TSNAs積累的重要環(huán)節(jié)。因此，在現(xiàn)階段，降低煙葉硝酸鹽是降低TSNAs的有效方法。硝酸鹽同化作用受品種、施肥、光照、土壤條件等因素影響，與硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（GDH）等密切相關(guān)，其中NIA和GS1基因過表達能夠明顯提高氮同化作用和作物產(chǎn)量[10-14]。目前，關(guān)于煙葉硝酸鹽的研究，多集中在對TSNA形成的影響上，而針對其在白肋煙煙葉中的積累原因研究較少。

前期研究發(fā)現(xiàn)，通過比較白肋煙和烤煙煙葉轉(zhuǎn)錄組差異，兩者氮代謝差異主要集中在硝酸鹽還原同化相關(guān)基因表達上[15]。在此基礎(chǔ)上，對兩類型間煙葉色素含量、氮同化關(guān)鍵酶活性及相關(guān)基因表達情況、碳水化合物含量、硝酸鹽代謝過程產(chǎn)物和硝酸鹽積累等差異進行分析，尋找影響硝酸鹽同化利用的主要因素為今后進行品種改良和調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養(yǎng)

選用品種，烤煙：紅花大金元（HD）和中煙100（Z100），白肋煙：TN90和TN86。試驗所用材料在國家煙草生理生化研究基地人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。氣候室條件設(shè)置：溫度為22～28 ℃，每12 h晝夜交叉光照（白天時間段設(shè)置為7：00-19：00），光照800 μmol m-2s-1，濕度85 %。

煙草種子在2 %次氯酸鈉中消毒2次，每次5 min，隨后將其播種在填滿基質(zhì)的200孔育苗盤中。待煙苗長至4～5片真葉（苗齡40 d左右）時，選取長勢均勻一致的壯苗，用去離子水將根系沖洗干凈后，將其移栽到小花盆中，1株/盆，用石英砂固定煙苗進行水培。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置6個處理：①4 mmol/L，HD；②4 mmol/L，Z100；③4 mmol/L，TN90；④4 mmol/L，TN86；⑤24 mmol/L，TN90；⑥24 mmol/L，TN86。在前期氮水平試驗（0，4，12，20，24，28，32，36 mmol/L中，確定了白肋煙和烤煙葉片生物量相同時的施氮水平，即白肋煙施氮量24 mmol/L時，與烤煙施氮量4 mmol/L時的葉片生物量相似。本試驗在此基礎(chǔ)上，分別在相同供氮條件和相同葉片生物量積累條件下，對白肋煙和烤煙煙苗碳氮代謝差異進行研究。營養(yǎng)液采用霍格蘭氏法配置，NO3-N：NH4-N = 3：1[15]。在營養(yǎng)液中通入空氣泵，以保持根系具有良好的通氣環(huán)境。待煙草種子萌發(fā)后，每2 d換一次營養(yǎng)液。

1.3 測定項目與內(nèi)容

1.3.1 煙株干物質(zhì)積累

試驗取樣和測定在移栽后10 d上午（10 ：00）進行。選擇長勢均勻一致的煙株，將各處理煙苗平均分成3份，分別用于新鮮樣本檢測、新鮮樣本保存（超低溫冰箱-80℃中保存）和殺青樣本保存。在樣本分組后，把各處理每份中煙苗的根、莖和葉分離，并用去離子水清潔干凈，待用吸水紙吸干后，進行測定和樣本保存。殺青樣本的制作方法：將各處理樣本根、莖和葉清潔干凈后，置入烘箱中105 ℃殺青20 min，60 ℃烘干至恒重，稱重，磨碎，過60目篩子后，保存。

1.3.2 煙葉硝酸還原酶活性（NRA）和谷氨酰胺合成酶活性（GSA）、色素和可溶性蛋白質(zhì)含量測定

選取各處理煙苗最大功能葉6～8支脈之間葉肉，用剪刀將其剪成2 mm × 5 mm條狀，混勻后，應(yīng)用D O'Neal等[16]方法測定煙葉GS活性，色素含量采用95 %乙醇提取法測定，NR活性采用活體法測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定，具體方法均參照李合生[17]植物生理生化實驗指導(dǎo)說明書進行。

1.3.3 NH4-N、NO3-N、總氮、總糖和還原糖含量測定

煙葉NH4-N含量采用茚三酮比色法測定[18]。煙葉NO3-N含量采用濃H2SO4-水楊酸法測定[19]，煙葉總氮、總糖和還原糖含量按照國家煙草行業(yè)標準YC/T161，159-2002在流動分析儀上完成檢測[15]。

整株氮素積累量計算方法：

氮素積累量=（根總氮含量×根干重）+（莖總氮含量×莖干重）+（葉總氮含量×葉干重）

1.3.4 目標基因qRT-PCR測定

根據(jù)GenBank中nitrate reductase [NADH]1 [Nicotiana tabacum（common tobacco） ]（NIA1，Gene ID: 107823732）、nitrate reductase [NADH]2[Nicotiana tabacum（common tobacco） ]基因（NIA2，Gene ID: 107785409）序列、glutamate dehydrogenase A [Nicotiana attenuata]（GDHA_1，Gene ID:109225747）序列和glutamine synthetase-like [Nicotiana tomentosiformis]（GS1，Gene ID: 104119270）序列，分別設(shè)計特異性引物，具體如表1。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈, 以cDNA 為模板, 按SYBR Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）說明書進行qRTPCR。反應(yīng)體系含QuantiFast? SYBR? Green PCR Master Mix （2 ×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μM × ） 0.2 μL、PCR Reverse Primer（10 μM × ）0.2 μL、Nuclease-free H2O 0.4 μL、cDNA 模板1 μL。反應(yīng)程序為，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60℃退火及延伸30 s，40個循環(huán)，每個處理3次重復(fù)，每個反應(yīng)3次重復(fù)。根據(jù)擴增曲線確定每個基因的響應(yīng)Ct 值，以L25為內(nèi)參矯正PCR 模板的拷貝數(shù)，采用2–ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2016和Origin pro 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和制圖；使用SPSS 17.0軟件進行方差分析和相關(guān)性分析，以2種類型不同品種的平均值為兩個獨立樣本，用獨立樣本T檢驗法對煙株干物質(zhì)積累量、色素、NRA、GSA、硝酸鹽、總氮等指標進行方差齊性檢驗和T檢驗，對煙葉硝酸鹽含量、硝酸鹽同化過程產(chǎn)物和干物質(zhì)積累與氮代謝酶活性和碳水化合物含量間進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理煙株干物質(zhì)積累比較

由圖1可知，在相同供氮條件下，白肋煙煙株根、莖、葉和整株干物質(zhì)積累數(shù)量明顯低于烤煙品種，差異達極顯著水平，而白肋煙在增加5倍供氮量后，其煙株干物質(zhì)積累與烤煙相近，未達到顯著差異，說明白肋煙氮效率和肥料利用率較烤煙低。

圖1 不同類型間煙株干物質(zhì)積累的差異Fig.1 Differences of dry matter accumulation in different types tobacco leaf

2.2 不同處理煙葉色素含量比較

由圖2可知，在相同氮素供應(yīng)（4 mmol/L）條件下，與烤煙相比，白肋煙煙葉葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和色素總含量相對較低，兩品種（TN90和TN86）平均值分別較烤煙（HD和Z100）低41.58 %、45.08 %、30.77 %和41.72 %，差異達極顯著水平，說明白肋煙煙葉葉綠素a、葉綠素b含量和色素總含量較低是該煙草類型的固有特性，可能對煙葉碳氮代謝造成不同程度的影響。在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉葉綠素a、葉綠素b含量和色素總含量與烤煙相似。

圖2 不同類型間煙葉色素含量差異Fig.2 Differences of pigment content in different types tobacco leaf

2.3 不同處理煙葉氮素還原同化關(guān)鍵酶活性和基因表達情況

由圖3和圖4可知，在相同施氮條件或相同葉片生物量積累條件下，白肋煙各品種煙葉硝酸還原酶活性/施氮量、谷氨酰胺合成酶活性/施氮量均較烤煙低，差異達極顯著水平，且白肋煙煙葉氮同化基因GDHA_1、GS1、NIA1和NIA2表達水平均較烤煙低；另外，增施氮肥，白肋煙煙葉NRA和GSA有升高趨勢，但增施氮肥后煙葉NRA仍低于烤煙，與基因NIA1和NIA2表達情況較為一致，說明NR可能是限制氮素還原同化的關(guān)鍵因素。在相同施氮量條件下，白肋煙各品種煙葉NRA和GSA均較烤煙低，差異達極顯著水平，且對應(yīng)硝酸鹽還原同化基因（NIA1、NIA2和GS1）表達趨勢一致，說明白肋煙煙葉硝酸鹽還原同化能力相對較弱，是其煙葉硝酸鹽大量積累的一個重要原因；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙各品種煙葉NRA較烤煙低，GSA較烤煙高，差異達顯著或極顯著水平。

圖3 不同類型煙葉NRA和GSA差異Fig.3 Differences of NRA and GSA in different types tobacco leaf

圖4 煙葉氮代謝相關(guān)基因表達情況Fig.4 Expression of genes correlated with nitrogen metabolism in tobacco leaf

2.4 不同處理煙葉NH4-N和可溶性蛋白質(zhì)含量比較

由圖5可知，不同處理各品種煙葉NH4-N含量/施氮量和可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)不同，其中在相同施氮條件和相同葉片生物量積累條件下，白肋煙各品種煙葉NH4-N含量/施氮量和可溶性蛋白質(zhì)含量均明顯較烤煙低，差異達極顯著水平，這與白肋煙煙葉NRA和GSA較低表現(xiàn)一致，即白肋煙煙葉氮素還原同化能力相對較弱，對應(yīng)氮素還原同化產(chǎn)物形成數(shù)量較少。

圖5 不同類型間煙葉NH4-N和可溶性蛋白質(zhì)含量差異Fig.5 Differences of NH4-N and soluble protein content in different types tobacco leaf

2.5 不同處理煙葉總氮和氮素積累量比較

由圖6可知，相同施氮條件下，白肋煙煙葉總氮含量較烤煙高，差異達顯著水平，而根、莖和葉氮素積累量明顯均較烤煙低，白肋煙兩品種整株氮素積累量的平均值較烤煙低43.33 %，差異達極顯著水平，說明白肋煙煙葉總氮含量偏高不是由其氮素積累量引起的；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉總氮含量和氮素積累量均較烤煙高，差異達極顯著水平，說明白肋煙增施氮肥會加劇煙葉總氮含量偏高的現(xiàn)象。

圖6 不同類型間煙葉總氮和氮素積累量差異Fig.6 Differences of total nitrogen content and nitrogen accumulation in different types tobacco leaf

2.6 不同處理煙葉NO3-N含量和NO3-N/TN比較

由圖7可知，相同施氮條件下，白肋煙葉NO3-N含量平均值較烤煙高103.36 %，差異達顯著水平；結(jié)合白肋煙煙葉總氮含量和氮素積累情況可知，白肋煙煙葉硝酸鹽大量積累不是由于其氮素積累量所決定，可能與其氮素同化能力密切相關(guān)；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙兩品種煙葉NO3-N含量平均值較烤煙高875.09 %，差異達極顯著水平。在相同施氮條件或相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉NO3-N/TN均較烤煙高，呈現(xiàn)顯著或極顯著差異。由此說明，白肋煙整株和煙葉氮素積累量相對較低，但煙葉硝酸鹽含量普遍偏高，與其硝酸鹽未被還原同化利用密切相關(guān)。

圖7 不同處理煙葉NO3-N和NO3-N/TN差異比較Fig.7 Differences of NO3-N content and NO3-N content / total nitrogen content in different types tobacco leaf

2.7 不同處理煙葉總糖和還原糖含量比較

由圖8可知，在相同氮素條件下和相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉總糖和還原糖含量明顯較烤煙低，且差異均達極顯著水平。其中，在相同氮素供應(yīng)條件下，白肋煙兩品種煙葉總糖和還原糖含量的平均值分別較烤煙低43.89 %和42.89 %；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙兩品種煙葉總糖和還原糖含量的平均值分別較烤煙低36.46 %和64.40 %。由此可知，白肋煙煙葉碳水化合物含量較低，可能會引起碳骨架和能源物質(zhì)供應(yīng)不足的現(xiàn)象。

圖8 不同類型煙葉總糖和還原糖含量差異Fig.8 Differences of total sugar and reducing soluble sugar content in different types tobacco leaf

2.8 相關(guān)性分析

在相同施氮條件下，白肋煙和烤煙煙葉總氮和NO3-N含量與煙葉NRA、GSA、總糖和還原糖含量均呈現(xiàn)負相關(guān)，其中NO3-N含量與煙葉NRA、GSA、總糖和還原糖含量的相關(guān)系數(shù)均達極顯著水平；煙葉NH4-N、可溶性蛋白質(zhì)、葉干重和地上部分干重均與煙葉NRA、GSA、總糖和還原糖含量均呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均達極顯著水平（見表2）。由此說明，煙葉硝酸鹽同化活動與氮代謝酶活性和糖類物質(zhì)含量關(guān)系密切，即提高煙葉氮代謝酶活性和糖類物質(zhì)供應(yīng)有利于降低煙葉NO3-N含量。

表2 煙葉硝酸鹽同化過程物質(zhì)與氮代謝酶活性和碳水化合物間相關(guān)性分析Tab.2 Correlation coefficients between nitrate assimilation products and activities of enzymes relative with nitrogen metabolism and carbohydrates in leaves

3 討論

白肋煙調(diào)制后煙葉硝酸鹽較烤煙高幾倍甚至幾十倍，對提高氮效率和降低TSNA形成十分不利[20,21]。在煙葉發(fā)育過程中，對白肋煙和烤煙煙葉硝酸鹽積累進行了研究，得出白肋煙煙葉硝酸鹽含量明顯較烤煙高，且類型間差異在苗期已存在[15,22]。在本試驗中，相同施氮條件下，白肋煙葉NO3-N含量較烤煙高103.36 %；白肋煙較烤煙增施5倍氮素后，其干物質(zhì)積累與烤煙相近，但其硝酸鹽含量較烤煙高875.09%。在前期，對白肋煙和烤煙煙葉轉(zhuǎn)錄組進行分析，得出類型間差異主要集中在糖類物質(zhì)合成和氮同化方面[15]；在此基礎(chǔ)上，本文通過分析白肋煙硝酸鹽同化過程產(chǎn)物及其影響因素，探索白肋煙硝酸鹽積累的生理原因。

硝酸鹽被植物吸收后，需被進一步還原和同化后才算是真正利用。NR是植物硝酸鹽代謝途徑上的限速酶，具有將硝酸鹽還原成為亞硝酸鹽的作用，其活性易隨施氮量增加而升高[23]。GS能夠?qū)o機氮轉(zhuǎn)化成為有機氮，是氮素同化的關(guān)鍵酶[24]。一般情況下，硝酸鹽積累的本質(zhì)原因是由硝酸鹽吸收作用大于其相對同化作用造成的[25]。Lu等[26]采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對氮同化途徑多個基因進行過表達，煙株35S:S523D-NR煙葉硝酸鹽和TSNA含量明顯下降，但缺乏氮同化酶活性對氮同化過程和硝酸鹽積累的影響研究。在相同氮素供應(yīng)條件下，白肋煙煙葉NIA1、NIA2、GS1和GDHA_1等氮素還原同化相關(guān)基因的表達水平較烤煙低，且NRA和GSA均較烤煙低，尤其是白肋煙在增施5倍氮肥后，其煙葉NRA仍低于烤煙，說明白肋煙煙葉氮素還原同化作用相對較弱，且其NRA偏低可能與能源物質(zhì)供應(yīng)不足有關(guān)，這對促進硝酸鹽同化利用有負面影響。在相同氮素供應(yīng)條件下，白肋煙煙葉氮素積累量明顯較烤煙低，但硝酸鹽含量較烤煙高。由此說明，白肋煙煙葉輸入的硝酸鹽未被充分還原同化引起其在葉中大量積累。因此，白肋煙煙葉氮素還原同化作用較弱，是其煙葉硝酸鹽積累的重要原因。

碳氮代謝是植物活體的基礎(chǔ)代謝，兩者密切相關(guān)。氮代謝活動為煙株碳代謝提供氨基酸、酶蛋白和光合色素，是優(yōu)質(zhì)煙葉形成的基礎(chǔ)[27,28]。白肋煙屬于黃綠葉色煙草，其煙葉色素含量低，煙葉總糖和還原糖等碳水化合物形成較少，對硝酸鹽還原同化作用有負面影響。在相關(guān)性分析中，煙葉硝酸鹽還原同化過程中NH4-N和可溶性蛋白質(zhì)含量與煙葉總糖和還原糖含量均呈現(xiàn)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達極顯著水平。韓錦峰等[29]研究指出，在煙葉發(fā)育過程中，碳氮比與NRA、蛋白酶活性、可溶性蛋白質(zhì)和還原糖含量關(guān)系密切。因此，白肋煙煙葉色素含量低，碳骨架供應(yīng)和能源物質(zhì)形成較少，這可能是其硝酸鹽積累的根本原因。另外，有研究指出，硝酸鹽一旦積累就易出現(xiàn)難以再利用的現(xiàn)象[30]，可能會加劇硝酸鹽積累問題，這有待于進一步研究。

4 結(jié)論

在相同供氮條件下，白肋煙煙株干物質(zhì)積累明顯較烤煙低，差異達極顯著水平；在白肋煙較烤煙增施5倍氮素后，兩類型間煙葉干物質(zhì)積累相近。在相同供氮條件下，白肋煙煙葉氮素積累數(shù)量較低，但總氮和硝酸鹽含量較高，煙葉氮還原同化酶活性（NRA和GSA）和氮同化相關(guān)基因（NIA1、NIA2、GS1、GDHA_1）表達水平均較烤煙低，氮還原同化作用相對較弱，是引起白肋煙煙葉硝酸鹽積累的直接原因；白肋煙煙葉色素含量低、總糖和還原糖形成較少，為氮代謝活動提供碳骨架和能源物質(zhì)不足，可能是白肋煙硝酸鹽積累的根本原因。