云南劍川海門口遺址飽水古木降解的微觀構(gòu)造分析

高景然，邱 堅，邱冬妮，金潤授

(1． 西南林業(yè)大學(xué)，云南昆明 650224； 2． 高麗大學(xué)，韓國首爾 530-839； 3． 全南國立大學(xué)，韓國光州 500-757)

0 引 言

海門口遺址是目前發(fā)現(xiàn)的中國境內(nèi)最大的“水濱木構(gòu)干欄式建筑聚落遺址”，在世界上也極為罕見，為研究中國史前聚落類型提供了寶貴實例。遺址所反映的歷史信息涉及了農(nóng)、林、牧、副、漁及上層建筑領(lǐng)域的諸多方面，對研究云南社會發(fā)展史及民族史具有十分重要的意義。遺址被評為“2008年全國考古十大發(fā)現(xiàn)”之一。

在遺址已發(fā)掘的探方中發(fā)現(xiàn)了大量的木樁柱，共清理出4 000多根，95%以上材種為云南松(Pinusyunnanensis)。目前相關(guān)學(xué)者[1]認(rèn)為大部分木樁柱為房子的基礎(chǔ)：柱身上大多有人工加工的痕跡；木樁柱的長度從幾十厘米到2 m多不等；直徑約5～40 cm。由于發(fā)掘遺址濱臨海尾河，因此古木呈飽水狀態(tài)，降解十分嚴(yán)重，甚至少部分古木已發(fā)生斷裂。

遺址總面積超過50 000 m2，其中有木樁分布的面積約20 000～25 000 m2，已發(fā)掘面積1 395 m2[2]，遺址中還有大量的古木未被發(fā)掘。對海門口遺址飽水古木降解程度及機(jī)理的分析，可為后續(xù)的加固保護(hù)提供科學(xué)有效的理論基礎(chǔ)和參考數(shù)據(jù)。

1 試驗材料和與方法

1．1 飽水古木及現(xiàn)代健康材

用于本試驗的飽水古木采自海門口遺址探坑AT2001，中間直徑12．7 cm，長度62 cm，質(zhì)量7．9 kg，樹種為云南松。腐朽程度中等。對海門口遺址飽水古木具有代表性。

作為對比樣的云南松現(xiàn)代健康材采自云南省普洱市。樹高1．3 m處胸徑18 cm。

1．2 透射電鏡(TEM)微觀構(gòu)造試驗步驟

1．2．1試劑配制

1) 緩沖液配制。先用超純水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%二甲胂酸鈉溶液200 mL；再用超純水配制0.1 mol/L鹽酸溶液400 mL；最后用上述兩種溶液配制緩沖液，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的二甲胂酸鈉溶液200 mL+0．1 mol/L鹽酸溶液33．6 mL。溶液配好后置于4 ℃冰箱冷藏。

2) 固定液配制。固定液的配比為:體積分?jǐn)?shù)50%戊二醛溶液∶緩沖液=8∶92。溶液配好后置于4 ℃冰箱冷藏。

3) 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%鋨酸溶液配制。將0．5 g四氧化鋨加入24．5 g超純水中，放置于磁力攪拌器上，加速溶解。

4) 乙醇溶液配制。用超純水分別配制體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%、95%的乙醇溶液。

5) 混合樹脂配制。為了防止混合樹脂過于黏稠，要現(xiàn)用現(xiàn)配。體積比：ERL4206∶DER736∶NSA∶S-1=10∶6∶26∶0．4。其中：ERL4206中文名稱為3-環(huán)氧乙烷基7-氧雜二環(huán)[4．1．0]庚烷的均聚物；DER736中文名稱為聚乙二醇環(huán)氧樹脂；NSA中文名為壬烯基琥珀酸酐；S-1中文名為二甲氨基乙醇。

1．2．2取樣 從飽水古木髓心至圓盤邊部平均取樣，分別標(biāo)識ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。試樣長度1 cm(沿木材順紋方向)，端面邊長1 mm。將試樣放入上述固定液中。

1．2．3試樣固定和脫水

1) 用上述緩沖液清洗試樣3次，每次20 min。期間要將試樣置于4 ℃冰箱冷藏。

2) 用上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%鋨酸溶液在室溫下浸泡試樣2 h。

3) 再用上述緩沖液清洗試樣3次，每次20 min。期間要將試樣置于4 ℃冰箱冷藏。

4) 乙醇溶液梯度脫水。分別用體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%、95%乙醇溶液對試樣逐級梯度脫水，每個級別30 min。最后將試樣置于100%乙醇中過夜。

1．2．4試樣包埋

1) 將試樣置于乙醇丙酮溶液(乙醇∶丙酮=1∶1)中浸泡30 min。

2) 將試樣置于丙酮中浸泡30 min。

3) 將試樣浸泡于混合樹脂丙酮溶液(混合樹脂∶丙酮(體積比)=1∶3)中4 h，置于振蕩器上。震蕩頻率為100次/min。

4) 將試樣浸泡于混合樹脂丙酮溶液(混合樹脂∶丙酮(體積比)=1∶1)中4 h，然后置于振蕩器上。

5) 將試樣浸泡于純混合樹脂中，并置于振蕩器上過夜。

6) 將試樣放入專用模具中用混合樹脂包埋，在70 ℃烘箱中過夜固化。將固化的樹脂塊編號、封存、備用。

1．2．5切片、染色及觀察 用配有鉆石刀的超薄切片機(jī)切片。將超薄切片用飽和醋酸鉛溶液染色著色10～20 min。用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1．2．6試驗設(shè)備 日本電子株式會社(JEOL)生產(chǎn)的透射電子顯微鏡，型號JEM-1011。

1．3 掃描電鏡(SEM)微觀構(gòu)造試驗步驟

1．3．1冷凍干燥法試樣制備

1) 取樣。從古木外部到內(nèi)部平均取樣，分別標(biāo)識SS1、SS2、SS3、SS4、SS5。試樣規(guī)格5 mm×5 mm×5 mm。

2) 試樣固定。參照透射電鏡試樣固定。

3) 乙醇梯度脫水。分別用25%、50%、75%、95%乙醇溶液對試樣逐級梯度脫水，每個級別30 min。

4) 叔丁醇置換乙醇。將試樣在乙醇叔丁醇溶液(95%乙醇∶叔丁醇(體積比)=1∶1)中浸泡1 h。然后將試樣置于100%叔丁醇中浸泡3次，每次1 h。

5) 將2 mL叔丁醇和古木試樣一起放入冷凍干燥器的托盤內(nèi)，再將托盤放入冷凍室開始冷凍干燥。干燥完成后將試樣按編號放在小玻璃瓶內(nèi)備用。

1．3．2試驗設(shè)備 日本日立公司生產(chǎn)掃描電子顯微鏡，型號S-3000N；日本日立公司生產(chǎn)冷凍干燥機(jī)，型號ES-2030。

1．3．3測量步驟 將干燥好的試樣分三切面固定在樣品托盤上，對試樣進(jìn)行表面噴金處理，最后用掃描電鏡對樣品進(jìn)行觀察。加速電壓為15．0 kV。

2 試驗結(jié)果與討論

2．1 掃描電鏡(SEM)微觀構(gòu)造分析

固定試樣并真空冷凍的干燥方法，可以最大限度地保留古木內(nèi)部的微生物，更有利于古木降解機(jī)理的分析。從飽水古木冷凍干燥試樣的SEM觀察可以發(fā)現(xiàn)，古木同時存在真菌降解和細(xì)菌降解。

通過試樣SS1到SS5的觀察發(fā)現(xiàn)，在SEM下古木內(nèi)外微觀構(gòu)造及腐朽程度差異不大。

2．1．1古木的細(xì)菌降解 大氣環(huán)境下的木材通常只受真菌降解。只有在接近無氧的環(huán)境下，木材才會遭受細(xì)菌降解。海門口遺址飽水古木常年淹埋地下，從其SEM圖(圖1)中可見明顯的細(xì)菌腐朽痕跡。

圖1c為貯存在古木中的細(xì)菌菌群。從圖中可以看出這類細(xì)菌呈球體顆粒狀，從外觀不能確定其菌種。事實上，飽水古木內(nèi)的細(xì)菌菌種十分豐富，僅根據(jù)外觀確定其菌種是很困難的，需通過分子生物技術(shù)等方法識別鑒定[3]。Landy等[4]利用DNA技術(shù)對26個遺址的飽水古木細(xì)菌種類進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)這些侵蝕細(xì)菌主要來自于噬細(xì)胞菌屬和黃桿菌屬以及一些未知菌種。這類細(xì)菌主要降解纖維素和半纖維素，也可以降解少量木質(zhì)素。木材次生壁的多糖類物質(zhì)含量相對較多，而胞間層木質(zhì)素含量相對較多。從圖1a可以看出古木胞間層保存相對完好，而次生壁降解相對嚴(yán)重，冷凍干燥后仍能使其產(chǎn)生嚴(yán)重收縮。這說明海門口遺址飽水古木纖維素和半纖維素降解相對嚴(yán)重，而木質(zhì)素降解相對較少，因此可以推測海門口遺址飽水古木中細(xì)菌種類也在上述Landy等鑒定的菌種范圍之內(nèi)。

圖1b為放大4 000倍的晚材細(xì)胞端面。細(xì)胞次生壁已經(jīng)收縮并與胞間層脫離，但次生壁上的空隙仍很明顯，這些空隙是細(xì)菌啃噬的典型特征。細(xì)胞腔內(nèi)填滿了細(xì)菌代謝物。

圖1d為從早材縱切面觀察古木內(nèi)壁降解情況?？梢悦黠@看出古木細(xì)胞壁S3層已經(jīng)遭到破壞，內(nèi)壁表層出現(xiàn)裂隙或小孔，細(xì)胞壁呈松散狀。這些都是典型的細(xì)菌腐朽特征[5]。從整體來看，古木內(nèi)部這種形式的降解非常普遍。這說明海門口遺址飽水古木主要是受細(xì)菌降解。從圖1d還可以看出，由于試樣采用真空冷凍干燥，干燥應(yīng)力相對較小，紋孔膜雖遭到一定程度破壞，但未脫落，部分與紋孔相連。

2．1．2古木的真菌降解 前人通過研究發(fā)現(xiàn)，飽水古木中發(fā)現(xiàn)的真菌絕大多數(shù)屬于軟腐真菌。由于古木樹種以及淹埋環(huán)境等因素的不同導(dǎo)致菌種存在差異，因此不同飽水古木的軟腐形式也各不相同。前人在飽水古木中發(fā)現(xiàn)的軟腐真菌目前已達(dá)444種[6-7]。通常這類真菌穿透能力差，其穿透多數(shù)僅發(fā)生在木材表面，使木材變色，但降解嚴(yán)重時也會使木材變軟。腐真菌都屬于微型真菌，其子實體在肉眼下不可見[8-10]。

圖1a箭頭所指為貯存在射線薄壁組織中的真菌菌絲。試樣中貯存在射線薄壁細(xì)胞中的真菌菌絲通常聚集成群。由于射線薄壁細(xì)胞含有相對豐富的抽提物及淀粉等物質(zhì)，因此這類真菌主要降解淀粉、抽提物等物質(zhì)。另外在射線薄壁細(xì)胞內(nèi)壁并未發(fā)現(xiàn)真菌侵蝕的坑道，故推測這類真菌對纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)的降解較少。從圖1a還可看出胞間層保存較完好，呈連續(xù)網(wǎng)狀，這是古木在飽水狀態(tài)下能夠保持原來形狀的主要原因。

圖1f兩個箭頭所指為貯存在古木管胞中的真菌菌絲。古木管胞中的真菌通常單個出現(xiàn)，且主要通過紋孔侵入管胞內(nèi)部，如圖1e所示。這說明此類真菌對多糖類及木質(zhì)素的降解能力差，不易穿通細(xì)胞壁。

海門口遺址飽水古木中的真菌菌絲主要出現(xiàn)在試樣SS1、SS2中，也就是說這類真菌菌絲主要出現(xiàn)在古木外部。圖2為用于真空冷凍干燥法制備SEM試樣的木塊。該木塊材質(zhì)疏松，用手輕輕按壓即有明顯壓痕。其內(nèi)部(淺色部分)和外部(深色部分)材質(zhì)的疏松程度在感官上差異不大，主要是顏色上存在差異。真菌菌絲主要出現(xiàn)在外部深色部分。這說明古木中的真菌主要使木材變色，而對細(xì)胞壁實質(zhì)物質(zhì)降解很少，故應(yīng)屬軟腐真菌。

2．2 透射電鏡(TEM)微觀構(gòu)造分析

圖3a為云南松現(xiàn)代健康材管胞在TEM下放大10000倍微觀構(gòu)造。圖中管胞壁結(jié)構(gòu)完整，表面平滑。S3層及胞間層顏色偏深。

圖3b標(biāo)識“D”的區(qū)域為古木細(xì)胞壁降解(degradation)區(qū)域，標(biāo)識“UD”的區(qū)域為未降解區(qū)域。降解區(qū)域顏色偏淺，呈淺灰色；未降解區(qū)域顏色偏深。從該圖可以看出，相鄰的三個細(xì)胞，有的發(fā)生了降解，而有的則保存完好。發(fā)生降解的兩段細(xì)胞壁降解程度也不相同。甚至在同一細(xì)胞內(nèi)，部分細(xì)胞壁降解，部分細(xì)胞壁未降解。從降解痕跡看，主要為細(xì)菌降解。但不能排除木材細(xì)胞壁化學(xué)成分發(fā)生水解或光解的可能性。因此，海門口遺址飽水古木主要以細(xì)菌為主，同時在一定程度上也受到其它因素的影響。從圖3b還可以看出胞間層保存完好。即使是在圖3e和圖3f降解較嚴(yán)重的細(xì)胞中，胞間層仍保存完好。由于細(xì)胞壁胞間層木質(zhì)素含量最高，說明細(xì)菌對木質(zhì)素的降解能力有限，使得古木胞間層得以保存。

除了胞間層外，通常細(xì)胞壁S3層是木質(zhì)素含量相對較高的部位。從圖3e和圖3f可以看出，二者細(xì)胞壁S2層降解都很嚴(yán)重。不同之處在于圖3e中左上角細(xì)胞S3層未降解，保存基本完好，而圖3f中右上角和左下角細(xì)胞壁S3層已不存在，右下角細(xì)胞壁S3層部分發(fā)生降解。圖3f中箭頭所指為典型的細(xì)菌空穴腐朽模式[11]，即細(xì)菌在細(xì)胞腔內(nèi)壁首先分解S3層，然后侵入S2層。

圖3d更加清楚地展示了相鄰的細(xì)胞有的被嚴(yán)重腐朽，有的保存完好。圖中淺色部分為發(fā)生降解的細(xì)胞壁，深色部分是未降解的細(xì)胞壁。圖中箭頭所指為已降解細(xì)胞和未降解細(xì)胞之間的紋孔。紋孔中的紋孔膜保存完好。由于紋孔膜木質(zhì)素含量相對較高，因此能夠在一定程度上阻止細(xì)菌在相鄰細(xì)胞間通過紋孔移動。但從前述SEM微觀圖中可知，古木紋孔被部分破壞。這為細(xì)菌通過紋孔侵入細(xì)胞壁內(nèi)部或相鄰細(xì)胞提供了更加便利的條件。

圖3c中箭頭所指為侵入細(xì)胞壁S2層的細(xì)菌。它可能是從紋孔侵入，也可能是從S3層侵入。通過圖3c右下角白色標(biāo)尺衡量可以大致估算，飽水狀態(tài)下古木細(xì)胞壁內(nèi)的孔隙尺寸大概在幾十甚至幾百納米之間。這些大尺寸空隙可以容納自由水。因此，海門口遺址飽水古木在干燥后重新吸水，木材雖然會濕脹，但恢復(fù)不到原來的尺寸[12]?，F(xiàn)代健康材在濕潤狀態(tài)下細(xì)胞壁內(nèi)孔隙約1～10 nm[13]。對于現(xiàn)代健康材，木材干燥后重新吸水，細(xì)胞壁內(nèi)的羥基會重新與水分子結(jié)合，使木材再恢復(fù)到原來的體積[14]。

3 結(jié) 論

通過SEM觀察可知，海門口遺址飽水古木細(xì)胞次生壁由于嚴(yán)重降解而發(fā)生收縮，并與胞間層分離。胞間層保存相對較好，呈連續(xù)網(wǎng)狀，這是古木在飽水狀態(tài)下能保持原來形狀的主要原因。古木內(nèi)細(xì)菌菌群及其代謝物較多，細(xì)胞壁上可見典型的細(xì)菌腐朽特征，說明飽水古木主要受到細(xì)菌降解。古木內(nèi)同時也可見真菌菌絲，但這類真菌主要降解蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)降解能力較差，其屬于軟腐真菌，主要使古木變色。

通過TEM觀察可知，古木內(nèi)細(xì)胞降解程度不同，即使是同一細(xì)胞內(nèi)，也存在部分降解但部分未降解的情況。細(xì)菌主要通過S3層侵入細(xì)胞壁內(nèi)部，并進(jìn)一步降解細(xì)胞壁S2層，但胞間層保存相對完好。細(xì)胞壁內(nèi)由于降解而產(chǎn)生的空隙大概在幾十到幾百納米之間。