溫敏型淀粉酶產生菌的分離、分子生物學鑒定及特性研究

閆 麗

(首都博物館文物保護修復中心生物實驗室，北京 100045)

董 振，劉偉杰

(江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州 221116)

0 引 言

淀粉酶是一種生物催化劑，可以用于人造棉、高質絲綢、化學纖維退漿等紡織品工業(yè)[1]；在洗滌劑工業(yè)中，用于制成多酶洗衣粉等，具有非常廣泛的用途。此外，作為一種生物酶，淀粉酶具有催化效率高，活性好和底物專一性的優(yōu)點。

我國有大量珍貴的書畫文物，在修復過程中選擇的保護方法一定要盡量減少對書畫文物的損傷，延長書畫文物的壽命[2-3]。近年來，淀粉酶開始應用于古代文物書畫的修復中。揭展是書畫重新裝裱過程中最重要的一環(huán)。在裝裱過程中所用的漿糊往往與畫心、命紙很難分離，導致揭展過程復雜，且容易造成古書畫的損毀。傳統(tǒng)的揭取方法是用水長時間悶潤書畫以降低漿糊的黏性，然后用手指輕輕地捻搓命紙，使舊命紙和漿糊從畫心背面剝離，此方法對于難揭展的紙質畫心極易揭晃。而利用淀粉酶制備生物揭展劑，作用于模擬材料(兩張宣紙用漿糊粘結起來，然后老化)[4-6]，利用酶的高效催化功能，將漿糊等膠黏劑的大分子分解，而且由于酶的催化選擇作用[7]，不產生對文物的破壞作用。前期研究工作利用淀粉酶已可以高效地揭展古書畫，并取得了良好的揭展效果[5]。然而該技術還存在技術難點，揭展后殘留的淀粉酶會影響二次裝裱，因此迫切需要開發(fā)一種溫度敏感性淀粉酶，在揭展完成后，利用微熱溫度使殘留的淀粉酶失活，避免淀粉酶對再次裝裱的影響。

本研究從土壤中分離獲得一株產溫度敏感型淀粉酶的菌株，對菌株進行了分子生物學鑒定，確定了其種屬分類地位，并分析了所產生淀粉酶的酶活特性，為古代字畫文物的低損傷修復提供了良好的溫度敏感型淀粉酶資源。

1 材料和方法

1．1 材料與試劑

為了篩選產溫度敏感型淀粉酶的菌株，從東北寒地土壤中采集樣品，用于菌株分離。實驗過程中所用的酸水解酪蛋白購自上海藍季科技發(fā)展有限公司，碘化鉀購自連云港貝爾化學試劑有限公司，檸檬酸三鈉購自無錫市亞盛化工有限公司，其他所用藥品購自國藥集團化學試劑有限公司。

1．2 培養(yǎng)基

篩選確定培養(yǎng)基：1)可溶性淀粉6 g/L，胰蛋白胨2 g/L，酸水解酪蛋白2 g/L，K2HPO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母粉2 g/L，瓊脂粉20 g/L。2)LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，瓊脂粉20 g/L(制備固體平板時加入)。以上培養(yǎng)基均115 ℃滅菌30 min。

1．3 菌株篩選[8-9]

將少許取自東北寒地的土壤樣品放入EP管中，加入滅過菌的生理鹽水，然后混勻并進行梯度稀釋，稀釋成濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液；將濃度為10-3、10-4、10-5的稀釋液用涂布棒涂布在固體分離培養(yǎng)基上；倒置于恒溫培養(yǎng)箱(蘇州培英實驗設備有限公司)，28 ℃培養(yǎng)24 h；將初篩選菌種，通過四區(qū)劃線的方法進行多次分離純化，吸取3 mL碘液于分離培養(yǎng)基平板中，染色10 min。倒去染料后，用細流水進行沖洗，直至沖洗下的水透明，觀察平板中形成的透明圈，最終得到純種菌種，用20%的甘油管保種備用。

1．4 菌株鑒定[10]

分析菌株的16S rRNA確定其種屬地位。用移液槍(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)吸取50 μL的菌液置于EP管中，以10 000 r/min的條件，離心5 min，去上清，將50 μL無菌水加入EP管中，將菌懸液在沸水浴煮沸3 min；然后冰水浴2 min，沸水浴和冰浴重復兩次；然后10 000 r/min離心，取1 μL上清液作為擴增模板。采用16S rRNA基因的通用引物配成50 μL體系進行PCR反應，PCR儀購于卡優(yōu)迪生物科技有限公司。上游引物(1492R)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，下游引物(27F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’。PCR擴增條件為95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電泳儀購于北京六一生物科技有限公司。PCR產物送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序，結果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，并利用MEGA 5軟件計算出序列的系統(tǒng)進化距離，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株BWL1025的種屬發(fā)育地位。

1．5 菌株BWL1025產酶及酶學特性分析

1．5．1淀粉酶活性的測定 采用DNS顯色法[11]分析淀粉酶酶活。取1 mL菌液于EP管中，以8 000 r/min的條件，離心5 min，取上清用作粗酶液；在150 μL的1%淀粉溶液中加入50 μL的上清菌液作為實驗組；在加入150 μL的1%淀粉溶液中加入50 μL沸水浴30 min后的上清菌液作為對照組；將實驗組和對照組放入水浴中保溫30 min；加入150 μL的DNS和100 μL的NaOH溶液，沸水浴5 min；定容至1 mL，用空白組調零后，測OD540的值，并取平均值。以50 μL的去離子水替代反應體系中的酶液的體系作為空白對照組用于OD540調零。淀粉酶酶活的表示：在特定條件下，1 min內將淀粉底物轉化為1微摩爾葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位。

1．5．2pH對酶活性的影響 將淀粉底物分別溶解在pH為4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液中，與粗酶液混合后，37 ℃水浴中反應30 min，測定淀粉酶活性，確定最佳反應pH。將粗酶液置于pH 4.0～11.0的緩沖液中處理30 min，然后在最佳pH和37 ℃的條件下反應30 min，確定淀粉酶酶活的穩(wěn)定性。

1．5．3溫度對酶活性的影響 將粗酶液、淀粉底物混合后，分別置于25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴中反應30 min，測定淀粉酶活性，確定最低失活溫度。

1．5．4淀粉酶最短失活時間的測定 根據(jù)1．5．3的實驗結果，將粗酶液、淀粉底物混合后，在最低失活溫度下，在不同的處理時間(0、5、10、15、20、25、30 min)測量酶活性，確定淀粉酶的最短失活時間。

1．5．5氮源對酶活性的影響 以葡萄糖為碳源，分別以酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酸水解酪蛋白、尿素、硝酸銨、硝酸鉀作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，然后按照1%的接種量，以28 ℃、180 rpm的條件培養(yǎng)24 h，通過測淀粉酶的酶活確定最佳氮源。

1．5．6碳源對酶活性的影響 以酵母粉為氮源，分別以羧甲基纖維素鈉、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，按照1%的比例接種菌液，以28 ℃、180 rpm的條件培養(yǎng)24 h，通過測淀粉酶的酶活確定最佳碳源。

2 結果與討論

2．1 產淀粉酶菌的篩選及形態(tài)學分析

如圖1所示，菌落呈圓形，濕潤，不透明，呈乳白色。如圖2所示，經革蘭氏染色后，發(fā)現(xiàn)菌株BWL1025為革蘭氏陽性菌，桿狀。如圖3所示，將分離培養(yǎng)基平板利用碘液染色后，可以很清楚的看出透明水解圈，說明菌株BWL1025具有較強的淀粉酶酶活。

2．2 菌株鑒定

對菌株BWL1025的16S rRNA序列進行擴增后，測序獲得長1 328 bp的目標序列，將目標序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫并進行BLAST比對，并利用MEGA5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)菌株BWL1025與Bacillussubtilis的同源性最高，綜合形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育分析確定菌株BWL1025屬于枯草芽孢桿菌。

2．3 淀粉酶的酶學性質研究

2．3．1pH對酶活性的影響 由于古代文物字畫會出現(xiàn)酸化現(xiàn)象，為了更好地指導該淀粉酶在文物修復中的應用，本研究分析了pH對菌株BWL1025產生淀粉酶的活性及穩(wěn)定性的影響。如圖5所示，酶活隨著pH值的升高呈先上升后下降的趨勢，菌株BWL1025所產生的淀粉酶的最適pH值為6.0，此時酶活最高。在pH 4.5～5.0時，有所下降，但酶活依然能達到最高酶活的60%以上。此外該淀粉酶的酶活穩(wěn)定性也是隨著pH值的升高呈先上升后下降的趨勢，在pH6時酶活最穩(wěn)定，而在pH 4.5～5時，酶活能達到最高酶活的70%以上。

2．3．2溫度對酶活性的影響 溫度對菌株BWL1025產生的淀粉酶酶活的影響如圖6所示，溫度對該淀粉酶的酶活影響很大，從25 ℃開始，隨著溫度的升高酶活升高，在40 ℃時，淀粉酶酶活達到最高0.839 IU/mL，表明該溫度為菌株BWL1025產淀粉酶的最適溫度；而在60 ℃及以上時，酶活基本消失，表明60 ℃為該淀粉酶的最低失活溫度。相比較其他淀粉酶的失活溫度來說，60 ℃為較低的失活溫度，表明菌株BWL1025可以產生溫度敏感型淀粉酶。

2．3．3淀粉酶最短失活時間的測定 由圖6所示，60 ℃為菌株BWL1025所產淀粉酶的最低失活溫度，因此在溫度60 ℃時，分析菌株BWL1025所產淀粉酶的最短失活時間。如圖7所示，隨著處理時間的延長，淀粉酶酶活力快速降低，并且在處理25 min后，酶活基本消失。由此可知，25 min為該淀粉酶在60 ℃的條件下最短失活時間。在已有報道中，能夠產生淀粉酶的芽孢桿菌屬菌株較多，但已報道淀粉酶的最適溫度多為60 ℃左右，熱穩(wěn)定性較好[12-13]，因此在書畫文物的修復中應用受到很大的限制。本研究從我國東北寒地土壤中取樣，從中分離溫度敏感性的淀粉酶，最適溫度為40 ℃，60 ℃加熱即可以實現(xiàn)對淀粉酶的失活，有利于解決淀粉酶揭展書畫文物后的酶殘留問題。

2．3．4氮源對酶活性的影響 氮源能夠提供給微生物氮素營養(yǎng)，其作用是供給微生物合成蛋白質和含氮物質的原料。對菌株BWL1025進行了發(fā)酵氮源優(yōu)化，選取了酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酸水解酪蛋白、尿素、硝酸銨、硝酸鉀八種氮源。如圖8所示，當以尿素、硝酸銨、硝酸鉀為氮源時，菌株BWL1025所產淀粉酶的酶活基本為零；當以蛋白胨和牛肉膏為氮源時，酶活較低；而以酵母粉、胰蛋白胨、酸水解酪蛋白為氮源時，酶活力較高；其中以酵母粉為氮源時，酶活力最高，達到1.306 IU/mL。因此選擇酵母粉為菌株BWL1025發(fā)酵的最佳氮源。

2．3．5碳源對酶活性的影響 碳源常通過影響微生物的糖代謝、呼吸、能量、生長及相關代謝而影響微生物的次生代謝產物的合成和分泌[14]。因此對菌株BWL1025發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源進行優(yōu)化，選擇了羧甲基纖維素鈉(CMC)、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、果糖、葡萄糖、鼠李糖九種碳源。如圖9所示，當以羧甲基纖維素鈉、乳糖、果糖、鼠李糖為碳源時，酶活力較低，不適合作為發(fā)酵碳源。而以木糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖為碳源時，酶活力較高；其中以木糖為碳源時，酶活力最高達到1.63 IU/mL。因此本研究選擇木糖作為菌株BWL1025的最佳發(fā)酵碳源。

圖9 碳源對菌株BWL1025所產淀粉酶酶活的影響

3 結 論

我國的博物館里有許多珍貴的書畫文物，在修復過程中，揭裱是一個難題。淀粉酶可以降解淀粉漿糊，提高揭裱效率，但揭裱后殘留的淀粉酶會影響后續(xù)的再次裝裱，因此揭裱后淀粉酶的失活問題亟待解決。本研究針對這個問題，利用碘液染色分離培養(yǎng)基平板的方法，從東北寒地土壤樣品中分離獲得一株產生溫度敏感型淀粉酶的功能菌株BWL1025。經過形態(tài)學和分子生物學鑒定發(fā)現(xiàn)菌株BWL1025為枯草芽孢桿菌。該菌株在40 ℃時，酶活達到最高值0.839 IU/mL；在60 ℃處理25 min后，酶活基本消失。在對菌株BWL1025的發(fā)酵碳氮源進行優(yōu)化時，發(fā)現(xiàn)木糖和酵母粉分別為最佳碳源和氮源，淀粉酶酶活最高達到1.63 IU/mL。本研究發(fā)現(xiàn)的菌株BWL1025產生的淀粉酶為溫度敏感型淀粉酶，在較低溫度下可失活，有效解決殘留淀粉酶對書畫文物再次裝裱的影響，在古代書畫文物的修復中具有很好的應用前景。