閩北十縣市鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量比較研究

江 芳，郭 娜，謝茹勝

閩北十縣市鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量比較研究

*江 芳1,2，郭 娜1,2，謝茹勝1,2

（1. 福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建，福州 350007；2. 福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院院士專家工作站，福建，福州 350007））

通過比較分析福建閩北地區(qū)十縣市的鉤藤資源中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量情況，為篩選閩北地區(qū)良好的鉤藤種質(zhì)資源提供依據(jù)。采用高效液相色譜方法測(cè)定不同種質(zhì)資源鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量。不同種質(zhì)資源的鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量差異性較大，其中鉤藤堿與異鉤藤堿含量最高的是武夷山的鉤藤，含量最低的是松溪縣的鉤藤。不同種質(zhì)來源的鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量差異較大，提示引種閩北各縣市鉤藤時(shí)應(yīng)注意不同種質(zhì)資源來源，同時(shí)為福建閩北本土的鉤藤引種提供依據(jù)。

種質(zhì)資源；鉤藤；鉤藤堿；異鉤藤堿；比較分析

鉤藤為中醫(yī)臨床常用中藥，中國藥典規(guī)定為茜草科（Rubiaceae）鉤藤屬（Uncaria）植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤和無柄果鉤藤（白鉤藤）的帶鉤莖枝，其中福建地區(qū)有分布的是鉤藤及大葉鉤藤兩種。鉤藤入藥有著悠久的歷史，具有清熱平肝、息風(fēng)定驚等功效[1]。藥理實(shí)驗(yàn)表明：鉤藤具有很好的降壓作用，而且研究也主要集中在鉤藤堿和異鉤藤堿成分。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)在同一生態(tài)環(huán)境條件下種植、采收時(shí)間和加工方法相同、種質(zhì)資源不同的閩北鉤藤進(jìn)行鉤藤堿與異鉤藤堿的含量進(jìn)行測(cè)定，開展有效成分鉤藤堿與異鉤藤堿的品質(zhì)評(píng)價(jià)，為鉤藤在閩北本土良種篩選、引種提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

日本島津LC-2030C分析型高效液相儀，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器；Lab-solution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；色譜柱：Gracesmart RP18柱（5 μm，250 mm × 4.60 mm）；AL204電子分析天平，水為超純水（明澈TM-D 24UV超純水機(jī)）；乙腈，色譜純，德國Merk公司。其他試劑均為分析純，國藥化試。對(duì)照品鉤藤堿購自aladdin（批號(hào)：K1510037），異鉤藤堿購自中檢所（批號(hào)：111927-201403）。

鉤藤種質(zhì)資源幼苗均于2016年3月分別采自福建閩北地區(qū)的邵武、光澤、建陽、建甌、武夷山、浦城、松溪、順昌、政和、南平十縣市，挑選各地野生、根系完整新鮮、無機(jī)械損傷的幼苗，與貴州省引種的鉤藤品種共同在福建邵武的南武夷藥博園培育種植，經(jīng)過近一年的培育，于當(dāng)年11月采集新鮮帶鉤莖枝晾曬而得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水（含1 mL·L-1三乙胺，冰醋酸調(diào)節(jié)pH 7.5）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～20 min，40%A→ 50%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量為20 μL。對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1、圖2。

圖1 異鉤藤堿與鉤藤堿混合對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 供試品HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鉤藤堿11.76 mg、異鉤藤堿12.28 mg，加入乙腈配制成濃度分別為47.04 μg·mL-1，49.14 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取樣品中粉約2.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入氨水2 mL，悶潤(rùn)30 min，加密加入乙腈50 mL，稱定重量，加熱回流提取2 h，冷卻，再稱定重量，用乙腈補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1下的鉤藤堿、異鉤藤堿對(duì)照品溶液配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的混合對(duì)照品溶液，其中鉤藤堿的濃度分別為0.0470、0.2352、1.1760、2.3520、4.7040、9.4080、18.8160 μg·mL-1，異鉤藤堿的濃度分別為0.0491、0.2457、1.2286、2.4572、4.9144、9.8288、19.658 μg·mL-1。按2.1色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定色譜峰面積。以進(jìn)樣濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A= 42497C-590.11，r = 0.9999；異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A= 44708C+ 931.1，r = 1.0000。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果鉤藤堿、異鉤藤堿峰面積的RSD（= 6）分別為0.13%、0.08%。表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果鉤藤堿、異鉤藤堿峰面積的RSD（= 6）分別為0.21%、0.17%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的（貴州）鉤藤粗粉6份，約1.0 g，精密稱定，分別精密加入鉤藤堿、異鉤藤堿對(duì)照品溶液0.5、2.5 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL測(cè)定，計(jì)算鉤藤堿、異鉤藤堿的回收率，平均回收率分別為100.9 %、100.3%。結(jié)果見表1、表2。

表1 鉤藤堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）

表2 異鉤藤堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）

2.4 樣品測(cè)定

精密稱取貴州及閩北十縣市的鉤藤樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算鉤藤堿、異鉤藤堿的含量。測(cè)定結(jié)果見表3 。

表3 鉤藤樣品中鉤藤堿、異鉤藤堿的含量

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生物堿類是鉤藤中含量較多的成分，帶鉤莖枝總堿含量高（平均為0.22%），多為吲哚類生物堿，其中含量較高的成分是鉤藤堿和異鉤藤堿[2]，是鉤藤類藥材中的共有成分，具有較高的專屬性和明確的生物活性，因此選擇鉤藤堿與異鉤藤堿作為測(cè)定的指標(biāo)成分。鉤藤生物堿多采用溶劑提取法，提取之前多采用濃氨水悶潤(rùn)藥材，而后可選用氯仿、苯、乙醚、乙醇、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑提取。有文獻(xiàn)報(bào)道鉤藤堿、異鉤藤堿在極性溶劑中易發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[3]，因此，可選擇同時(shí)測(cè)定鉤藤堿、異鉤藤堿的含量或者兩者之和來評(píng)價(jià)閩北十縣市不同種質(zhì)資源的鉤藤樣品的優(yōu)劣。

王英峰等[4]研究表明，溶劑極性越大則總堿中鉤藤堿含量越低，異鉤藤堿含量越高。李思蒙等通過對(duì)比不同的提取方法[5]，發(fā)現(xiàn)鉤藤經(jīng)氨水堿化后用乙腈直接回流提取，異鉤藤堿的提取率可達(dá)到95%，并且可以直接進(jìn)樣用于HPLC和UPLC分析。從最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，異鉤藤堿的含量比鉤藤堿的含量高，是鉤藤堿含量的4~5倍，說明鉤藤經(jīng)氨水堿化后采用極性較大的乙腈作為提取溶劑回流提取，更有利于異鉤藤堿的提取溶出，因此其含量更高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。

同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法測(cè)定鉤藤堿或異鉤藤堿含量的方法，主要選用了兩種流動(dòng)相[5-6]，一種是以乙腈為流動(dòng)相A，以水（含1mL·L-1三乙胺，冰醋酸調(diào)節(jié)pH 7.5）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~20 min，40%A→ 50%A）；另一種是以甲醇-水（70 : 30）（含0.01 mol·L-1三乙胺，冰醋酸調(diào)節(jié)pH 7.5），實(shí)驗(yàn)對(duì)比了該兩種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)前者分離效果更佳，因此本實(shí)驗(yàn)選用前者方法。

閩北十縣市不同種質(zhì)資源的鉤藤樣品均于同一時(shí)期采集、引種，經(jīng)過相同培育時(shí)間，同時(shí)期采收新鮮帶鉤莖枝晾曬而得。與引種自貴州的鉤藤品種相比較，閩北十縣市不同種質(zhì)資源的鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量差異性較大，其中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量最高的是武夷山的鉤藤，可能與武夷山優(yōu)越的自然生態(tài)環(huán)境有關(guān)；含量最低的是松溪縣的鉤藤。武夷山、光澤鉤藤樣品中含有的鉤藤堿及異鉤藤堿的含量較貴州省品種高，而其他地區(qū)的樣品中其含量都更低。所以在引種閩北鉤藤品種時(shí)，提示引種閩北各縣市鉤藤時(shí)應(yīng)注意不同種質(zhì)資源來源，注重生態(tài)環(huán)境對(duì)種質(zhì)資源的影響，同時(shí)為福建閩北本土的鉤藤良種篩選、引種提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì). 中國植物志[M]. 北京:科學(xué)出版社,1999:255.

[2] 王瑞儉,孫廣仁,孫寶民. 鉤藤堿提取工藝研究[J]. 吉林林學(xué)院學(xué)報(bào),1998,14(2): 109-111.

[3] 原田正敏. 日本常用中藥的定量分析-防己、鉤藤[J]. 國外醫(yī)藥－植物藥分冊(cè),1991,6(5): 219.

[4] 王英峰,魏璐雪,王保中. 高效液相色譜法測(cè)定鉤藤中鉤藤堿、異鉤藤堿含量[J]. 藥物分析雜志,1999,19(1): 56-57.

[5] 李思蒙,侴桂新. 鉤藤藥材中異鉤藤堿含量的超高效液相色譜和高效液相色譜法測(cè)定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010, 21(12): 3195-3197.

[6] 王曉穎,劉永靜,陳丹,等. HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地鉤藤中鉤藤堿的含量分析[J]. 中國中醫(yī)藥科技,2011,18(3): 215-216.

RHYNCHOPHYLLINE AND ISORHYNCHOPHYLLINE CONTENTS INOF VARIOUS GERMPLASM RESOURCES IN NORTHERN FUJIAN: A COMPARATIVE STUDY

*JIANG Fang1,2, GUO Na1,2, XIE Ru-sheng1,2

(1. Fujian Vocational College of Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350007, China; 2. Academician Expert Workstation, Fujian Vocational College of Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350007, China)

To investigate the rhynchophylline and isorhynchophylline contents inof various germplasm resources.Rhynchophylline and isorhynchophylline contents inof various germplasm resources were determined using high-performance liquid chromatography (HPLC).There weregreat differences about rhynchophylline and isorhynchophylline contents among various germplasm resources, the highest contents were determined in the sample from Wuyishan, the lowest from Songxi.The significant differences among various germplasm resources ofsuggested that attention should be paid to different sources of germplasm resources when the introduction was carried out, and the results could provide theoretical basis for the introduction of localin northern Fujian.

germplasm resource;; rhynchophylline; isorhynchophylline; comparative analysis

1674-8085(2019)01-0103-04

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.01.020

2018-09-11；

2018-11-16

福建省教育廳計(jì)劃項(xiàng)目（JAT171013）；福建省教育廳健康平臺(tái)運(yùn)行及項(xiàng)目建設(shè)（2017CZ05-2）

*江芳(1982-），女，福建邵武人，講師，碩士，主要從事中藥化學(xué)及中藥制劑分析研究(E-mail:67282313@qq.com);

郭娜(1986-），女，福建龍巖人，講師，碩士，主要從事植物資源與植物生態(tài)研究(E-mail:348103196@qq.com);

謝茹勝(1978-），女，福建漳州人，副教授，碩士，主要從事分析化學(xué)與海洋活性成分研究(E-mail:429457438@qq.com).