云南大理白族和漢族弱精子癥患者精子mtDNA 4977 bp缺失相關(guān)性研究

楊勇琴，肖 楊，自加吉，李素芬，于成和，張若鵬，熊 偉

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云南大理白族和漢族弱精子癥患者精子mtDNA 4977 bp缺失相關(guān)性研究

楊勇琴1,2，肖 楊1，自加吉1，李素芬1，于成和3，張若鵬3，*熊 偉1

（1. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南，大理 671000；2. 楚雄州中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科，云南，楚雄 675000；3. 大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南，大理 671000）

探討云南大理白族和漢族弱精子癥患者精子線粒體DNA(mtDNA) 4977 bp缺失的相關(guān)性。收集云南大理白族弱精子癥患者137例，漢族弱精子癥患者121例，正常對照組大理白族和白族精子活力正常人各120例，提取精液基因組DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)進行精子mtDNA 4977 bp缺失的研究。結(jié)果顯示,120例正常對照的大理白族精子活力正常人中有10例（8.33%）存在 mtDNA 4977 bp缺失；而137例大理白族弱精子癥患者中有89例(64.96%)存在mtDNA 4977 bp缺失。兩組4977 bp缺失頻率比較有極顯著性差異（< 0.01)。120例正常對照的漢族精子活力正常人中有7例（5.83%）存在 mtDNA 4977 bp缺失；121例大理白族弱精子癥患者中有85例 (70.25%)存在 mtDNA 4977 bp缺失。兩組4977 bp缺失頻率比較差異有極顯著性（< 0.01)。同時發(fā)現(xiàn)大理白族弱精子癥患者與漢族弱精子癥患者 mtDNA 4977 bp缺失頻率無顯著性差異（> 0.05)。大理白族和漢族人群mtDNA 4977 bp缺失與弱精子癥的發(fā)病有明顯的關(guān)聯(lián)，提示mtDNA 4977 bp缺失在弱精子癥的發(fā)生中可能起重要作用。

弱精子癥；線粒體DNA；4977 bp缺失；大理白族

男性不育癥是影響家庭和睦以及社會穩(wěn)定的全球性健康問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調(diào)查，有將近15%的育齡夫婦飽受著不育癥的困擾，男女雙方原因各占50%[1]。精子活力減低、數(shù)目減少是造成男性不育癥的重要原因之一[2]。近年來，線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)缺失、突變與疾病的相關(guān)性研究越來越受到人們的重視，尤其是在那些高需能的組織和器官，mtDNA結(jié)構(gòu)改變而引發(fā)的效應(yīng)更為明顯[3]。

正常情況下，精子通過無氧酵解產(chǎn)生ATP，但在精子射出后的泳動過程所需的能量中，線粒體呼吸鏈起重要作用[4]。線粒體氧化磷酸化過程中產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）和大量ATP。由于缺乏內(nèi)源性過氧化物酶，精子細(xì)胞易于受到氧化物的損傷。研究表明，線粒體ATPase6、ATPase8、COX3、COX2、CytB、ND3、ND4、ND5及ND6基因參與精子細(xì)胞的功能成熟及射精后的快速“鞭動”[5]，線粒體氧化磷酸化對精子的運動功能非常重要。mtDNA質(zhì)和量的改變都會減弱精子的生理功能及運動能力[6]。據(jù)有關(guān)報道，有超過100種的mtDNA大片段缺失與人類疾病相關(guān)，其中包括mtDNA 4977 bp缺失而引發(fā)的不同疾病狀態(tài)[7]。在一定的環(huán)境因子的誘導(dǎo)下，隨著年齡的增長，mtDNA缺失具有積累效應(yīng)，4977 bp缺失是一種常見的缺失類型，被用作mtDNA損傷的一種監(jiān)測指標(biāo)[8]。Kao等發(fā)現(xiàn)mtDNA 4799 bp缺失發(fā)生在mtDNA nt8483與nt13459之間，nt8470-8482及nt13447-13459為核酸序列完全相同的13 bp重復(fù)區(qū)（TACCTCCCTCACC），該重復(fù)區(qū)可能是mtDNA 4977 bp缺失發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，導(dǎo)致mtDNA在復(fù)制過程中出現(xiàn)滑行錯配[9]。有大量研究表明，mtDNA缺失發(fā)生率在弱精子癥患者中高于正常男性，通過遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的方法能觀察到缺失的mtDNA分子與野生型的mtDNA分子在精子中共存的現(xiàn)象，即“異質(zhì)性”[10]。我們的研究旨在探究云南大理白族和漢族人群弱精子癥患者與mtDNA 4977 bp缺失之間的相關(guān)性，為從分子水平揭示弱精子癥的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)，也為男性不育癥患者的診斷及尋找簡單準(zhǔn)確的分子標(biāo)記物提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1　一般資料

大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖遺傳科門診就診的白族弱精子癥患者137例，漢族弱精子癥患者121例，正常對照組漢族、白族各120例。年齡24~47歲，平均年齡32.51 ± 8.38歲。研究個體之間無血緣關(guān)系，追溯3代均為同一民族個體，且在云南大理地區(qū)居住3代以上。

1.2　儀器與試劑

2720 Thermal Cycler 型號PCR擴增儀（美國Applied Biosystems 公司）；Nanodrop One UV/Vis微量核酸蛋白定量儀（美國Thermo Scientific公司）；凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；全自動滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；170-4402型瓊脂糖水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）；HH-4恒溫水浴鍋（上海國華電器有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）。

精子基因組DNA提取試劑盒（北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；DNA 聚合酶、dNTP（大連Takara公司）；DNA Marker（四川綿陽天恩澤基因工程有限公司）；DuRed核酸染料（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（Biowest Agarose）為西班牙進口分裝；乙醇、異丙醇等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR引物合成和DNA測序由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司完成。

1.3　方法

精液采集及分析和質(zhì)量控制按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）標(biāo)準(zhǔn)化程序進行。禁欲3~5 d，手淫法留取精液樣本于潔凈容器中，37 ℃液化30 min。研究征得患者本人知情同意及大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3.2 常規(guī)精液分析及分組

根據(jù)WHO指南，采用計算機輔助的精液質(zhì)量分析系統(tǒng)（CASA）行精液質(zhì)量分析，弱精子癥：精液參數(shù)中前向運動的精子（a+b）< 50% 或a級< 25%，精液常規(guī)分析包括a、b、c、d級精子，以及精子活力、活動率、精子密度、曲線速度、直線速度、平均路徑速度、直線性、擺動性、前向性等。精子量≥2 mL、精子密度20×106/mL、精子活率>50%、精子活動力a級≥ 25% 為正?；騛級+b級活動力≥50%為正常。

1.3.3 精子DNA的提取

取精液樣本50 μL，采用北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司精子基因組DNA提取試劑盒，按試劑盒說明書提取精液總DNA，NanoDrop核酸蛋白分析儀測定DNA濃度和純度。

1.3.4 引物設(shè)計

引物設(shè)計參照人類mtDNA劍橋序列（GenBank：J01415），由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成（PAGE級純化，純度99%），L1（3304-3323） 5’-AACATACCCATGGCCAACCT-3’；L2(8150-8166) 5’-CCGGGGGTATACTACGGTCA-3’；H1(3836-3817) 5’-GGCAGGAGTAATCAGAGGTG-3’；H2(13650- 13631)5’-GGGGAAGCGAGGTTGACCTG-3’。擴增片段長度見表1。

電氣設(shè)備管理需要建立相應(yīng)的管理體系，對火電廠的管理水平有著一定的要求。在實際中，火電廠電氣設(shè)備故障經(jīng)常發(fā)生，并且可控性差，大部分企業(yè)找不到合理控制故障的有效措施，主要存在的問題如下：

表1 不同配對引物擴增片段長度

1.3.5 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL，加雙蒸水補充至總體積25 μL。引物對 L1/H1 的PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后進入循環(huán)，每個循環(huán)為94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。引物對 L2/H2的PCR擴增條件有所改變：94 ℃預(yù)變性5 min后進入循環(huán)，每個循環(huán)為94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 μL加至2.0 μL的6×loading buffer中混勻，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，恒壓120 V，于1×TAE緩沖液中電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察有無PCR產(chǎn)物及產(chǎn)物大小。

1.3.6 DNA測序

在所有檢測樣本中，選取其中10例4977 bp缺失樣本及5例正常對照組樣本的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳回收后，送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進行DNA純化和測序。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法

選用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用檢驗，計數(shù)資料采用χ檢驗。檢驗水準(zhǔn)α = 0.05，< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，< 0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 精子基因組DNA的檢測

每個樣本各取3.0 μL 精子基因組DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離（120 V，40 min），凝膠成像系統(tǒng)成像后可見清晰的基因組DNA條帶（圖1）。在NanoDrop核酸蛋白測定儀上測定各樣本的DNA，結(jié)果顯示，基因組DNA的A260/A280比值都在1.8~2.0之間，濃度50.58~512.3 μg/mL。

圖1 精子基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 大理白族和漢族精子活力正常者精子mtDNA的PCR擴增

從精子活力正常者的精液中提取的基因組DNA模板，以引物L(fēng)1/H1引物擴增可以獲得正常mtDNA的片段，長度為533 bp，證明mtDNA提取成功。凡是未擴增到代表正常mtDNA產(chǎn)物的基因組DNA模板，不用于后續(xù)實驗。用L2/H2引物擴增，凡是未擴增出524 bp產(chǎn)物的模板，說明mtDNA無4977 bp缺失；凡是擴增出524 bp產(chǎn)物的模板，說明mtDNA存在4977 bp缺失。取部分大理白族和漢族精子活力正常人的總mtDNA和有4977 bp缺失的mtDNA的PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳（圖2）。

1：陰性對照；2-5：用引物L(fēng)1/H1擴增代表總mtDNA的533 bp產(chǎn)物；6：陰性對照：7-10：用引物L(fēng)2/H2擴增代表4977 bp缺失的524 bp產(chǎn)物

2.3 大理白族和漢族弱精子癥患者精子mtDNA的PCR擴增

從大理白族和漢族弱精子癥患者的精液提取的基因組DNA模板，分別以引物L(fēng)1/H1引物和L2/H2引物進行PCR。凡是能同時擴增出533 bp產(chǎn)物和524 bp產(chǎn)物的樣品，說明mtDNA 4977 bp缺失陽性。取部分大理白族和漢族弱精子癥患者的總mtDNA和有4977 bp缺失的mtDNA的PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳（圖3）。

1：陰性對照；2-5：用引物L(fēng)1/H1擴增代表總mtDNA的533 bp產(chǎn)物；6：陰性對照：7-10：用引物L(fēng)2/H2擴增代表4977 bp缺失的524 bp產(chǎn)物

2.4 膠回收DNA測序結(jié)果

將10例mtDNA 4977 bp缺失標(biāo)本及5例正常對照組標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠DNA回收后，送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進行DNA純化和測序。將測序得到的DNA序列與人類mtDNA劍橋序列（GenBank：J01415）通過DNASTAR軟件進行核苷酸序列比對分析，結(jié)果顯示，mtDNA缺失區(qū)域是在8470 bp~13477 bp間存在的DNA片段缺失（圖4）。

圖4 DNA測序與人mtDNA劍橋序列核苷酸比對（mtDNA在8470 bp~13477 bp間存在的DNA缺失）

2.5 mtDNA 4977 bp缺失與弱精子癥的關(guān)系

將受檢查對象按大理白族、漢族分組，在同一個民族中按精子活力再分組，分別比較兩組之間mtDNA 4977 bp缺失的發(fā)生率與弱精子癥的關(guān)系，分別在大理白族、漢族兩個民族發(fā)現(xiàn)，弱精子癥組mtDNA 4977 bp缺失的發(fā)生率均高于正常對照組（表2），經(jīng)卡方檢驗，缺失的發(fā)生率在兩組之間具有極顯著性差異（< 0.01）。通過比較大理白族、漢族間精子活力不同組mtDNA 4977 bp缺失的發(fā)生率，結(jié)果顯示兩組之間無顯著性差異（> 0.05）（表3）。

表2 白、漢兩族不同組精子活力mtDNA 4977 bp缺失發(fā)生率

注：白族精子活力正常組與弱精子癥組間比較< 0.01；漢族精子活力正常組與弱精子癥組間比較< 0.01.

表3 白、漢兩族間精子活力不同組mtDNA 4977 bp缺失發(fā)生率

注：白、漢兩族間精子活力正常組mtDNA 4977 bp缺失發(fā)生率比較> 0.05；白、漢兩族間弱精癥組mtDNA 4977 bp缺失發(fā)生率比較> 0.05.

3 討論

精子線粒體在人類受精過程中扮演著重要角色，精子mtDNA缺陷是男性不育癥的原因之一。精卵細(xì)胞融合障礙，精子無法與透明帶識別、精子的泳動障礙均可導(dǎo)致精子功能障礙[11]。為了解精子運動和受精能力下降發(fā)生的原因，有必要從分子層次上研究并開發(fā)相關(guān)的治療策略。已有許多資料證明，精子獲能前主要依靠無氧酵解供能，精子進入女性生殖道后開始獲能[12]。精子獲能后代謝活性明顯增強，表明能量的供給除無氧酵解外更重要的是有氧氧化。精子中的線粒體聚集在尾的基部，而mtDNA編碼了參與細(xì)胞氧化磷酸化的13條多肽鏈。mtDNA 4977 bp的缺失和其它類型突變將減少mtDN A編碼的氧化磷酸化相關(guān)蛋白的合成，從而影響ATP的合成，引起弱精子癥和不育癥[13]。

在本研究中，我們采用PCR技術(shù)對大理白族和漢族兩類人群分別進行了精子mtDNA 4977 bp缺失的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子活力正常組與弱精子癥患者組mtDNA 4977 bp缺失頻率比較差異具有極顯著性（< 0.01），由此可見，精子mtDNA 4977 bp缺失在弱精子癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。大理白族和漢族人群兩組間mtDNA 4977 bp缺失無顯著差異（> 0.05）。夏米西努爾.依力克等[14]報道新疆維吾爾族和漢族人群mtDNA 4977 bp缺失在弱精癥的發(fā)病中起到重要作用，但兩組人群間mtDNA 4977 bp缺失頻率無顯著差異，提示mtDNA 4977 bp在弱精子癥患者中缺失頻率可能與不同民族人群的遺傳背景無關(guān)。本研究結(jié)果也間接支持了他們的觀點。

已有研究表明，mtDNA突變或缺失可引起更多的內(nèi)源性氧化損傷[13]。mtDNA突變或缺失可引起線粒體功能失調(diào)，事實上，呼吸鏈持續(xù)產(chǎn)生活性氧(ROS）如內(nèi)源性及外源性氧自由基、氧化應(yīng)激將引起線粒體的氧化損傷，造成細(xì)胞功能障礙。1995年，Kao等[9]首次在不育癥患者活力低下的精子中發(fā)現(xiàn)mtDNA存在高頻率的4977bp片段缺失。Dhillon等[15]于2007年在印度男性中通過對179例少弱精子癥患者和200例正常生育者進行核苷酸多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)mtDNA片段缺失與男性不育存在明顯的相關(guān)性。Tsai等[16]研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA 4977 bp片段缺失與體外受精的受孕率成負(fù)相關(guān)，因此在體外受精形成胚胎過程中此片段可能發(fā)揮重要作用。Gashti等[17]通過PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)精子mtDNA 4977 bp缺失在患精索靜脈曲張男性組發(fā)生率為81.66%，而在對照組僅為15.55%，因而推測精索靜脈曲張可能是精子mtDNA片段缺失的誘導(dǎo)因素。Kumar等[18]證實，少弱精子癥患者中包括線粒體ATPase6、ATPase8、ND2、ND3、ND4、ND5在內(nèi)的線粒體基因核苷酸突變頻率增加，并認(rèn)為精液中過多的ROS和低抗氧化物水平能引起線粒體的缺失、突變，進而減弱精子的受精能力。Kao等[19]證實細(xì)胞內(nèi)8-羥-2-脫氧鳥苷與精子mtDNA 4977 bp缺失存在正相關(guān)，可作為mtDNA氧化損傷的分子標(biāo)志。氧自由基(ROS)介導(dǎo)的DNA氧化應(yīng)激可能是精子mtDNA大片段缺失的誘因[19]。

另有研究表明，隨著年齡的增長，精、卵細(xì)胞mtDNA缺失或突變可由生殖細(xì)胞生理環(huán)境的持續(xù)改變引起[20]。本研究結(jié)果并未提示精子mtDNA 4977 bp缺失與年齡有關(guān)，這有待進一步深入研究?？傊?，mtDNA突變或缺失能引起精子發(fā)生過程中精子形態(tài)及結(jié)構(gòu)的改變，mtDNA缺失可能出現(xiàn)或累積在起始的精子細(xì)胞內(nèi)，最終引起精子呼吸功能的減低及運動能力的減退[21]。此外，在采用人工授精和試管嬰兒等輔助性生育技術(shù)時也應(yīng)考慮mtDNA異常等問題來避免遺傳病的傳播[22]。

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ASSOCIATION OF mtDNA 4977 bp DELETION OF SPERMATOZOA BETWEEN DALI BAI AND HAN NATIONALITY MALES WITH ASTHENOZOOSPERMIA

YANG Yong-qin1,2, XIAO Yang1, ZI Jia-ji1, LI Su-fen1, YU Cheng-he3, ZHANG Ruo-peng3,*XIONG Wei1

(1. College of Basic Medical Sciences, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China; 2. Department of Nephrology, Traditional Chinese Medicine Hospital of Chuxiong Prefecture, Chuxiong, Yunnan 675000, China; 3. Department of Reproductive Medicine, The First Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan, China)

The relationship and differences for mtDNA 4977 bp deletion of spermatozoa between the normal Dali Bai and Han males with asthenozoospermia was investigated in this paper.Using polymerase chain reaction (PCR) technique, the frequency of occurrence and properties of mtDNA 4977 bp deletion were determined in human spermatozoa with different motilities. According to the three criteria established by World Health Organization 1999 (WHO 1999), samples were divided into 4 groups. They were Bai nationality male with normal sperm (120 cases), Bai nationality Male with asthenozoospermia (137 cases); Han nationality male with normal sperm (120 cases), Han nationality Male with asthenozoospermia (121 cases), and the samples in hot mutation region -4977 bp of mtDNA were screened. The results showed that the frequency of the presence of the 4977 bp deletion was 8.33% in Bai nationality males with fertility, 64.96% in Bai nationality males with infertility, 5.83% in Han nationality males with fertility, 70.25% in Han nationality males with infertility. The frequency of the deleted mtDNA 4977 bp in the spermatozoa with poor motility was significantly higher than those in the spermatozoa with good motility（< 0.01). In addition, there were no significant differences between Bai and Han male with infertility（> 0.05). It could be concluded thatmtDNA4977 bp deletion have close association of asthenozoospermia, mtDNA4977 bp deletion may play an important role in the pathophysiology of male infertility for both Han and Bai males in Dali district, Yunnan province.

asthenozoospermia; mitochondrial DNA; 4977 bp deletion; Bai nationality

1674-8085(2019)01-0023-06

R698.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.01.006

2018-07-15；

2018-10-19

國家自然科學(xué)基金項目(81560458, 31601155)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項目(2016ZDX01, 2016ZDX05)；云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才項目(2017HB077)；大理大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目(S-CXCY-2018-16)

楊勇琴(1979-)，女，云南安寧人，講師，碩士，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究(E-mail: 46097867@qq.com);

肖 楊(1995-)，女，云南曲靖人，大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院本科生(E-mail: 614348665@qq.com);

自加吉(1980-)，男，云南大理人，講師，碩士，主要從事分子病理學(xué)研究(E-mail: dldxjcyxyzjj@163.com);

李素芬(1993-)，女，山東濟寧人，碩士生，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究(E-mail: 1446198172@qq.com);

于成和(1988-)，男，湖南邵陽人，醫(yī)師，主要從事男性生殖醫(yī)學(xué)研究(E-mail: 51554514@163.com);

張若鵬(1974-)，男，山東菏澤人，副主任醫(yī)師，博士，主要從事生殖醫(yī)學(xué)研究(E-mail: 791372366@qq.com);

*熊 偉(1982-)，男，湖南株洲人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)和生物信息學(xué)研究(E-mail: xwailp@163.com) .