生物樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的定量測(cè)定及其應(yīng)用研究進(jìn)展

曹雨虹, 張明勇, 劉 敏, 洪戰(zhàn)英*

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室, 上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200433;2. 第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部, 上海 200433)

在神經(jīng)分支的發(fā)生和生長以及神經(jīng)交流/神經(jīng)電路的發(fā)展中,腦神經(jīng)傳遞是一個(gè)重要的過程[1]。神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitters, NTs)是能夠促進(jìn)神經(jīng)傳遞的內(nèi)源性化學(xué)信使,在許多大腦功能中發(fā)揮重要作用,包括行為和認(rèn)知。它們影響并且調(diào)整肌肉張力和心率,調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、睡眠、記憶、意識(shí)、情緒和食欲。在正常的生理?xiàng)l件下,神經(jīng)遞質(zhì)在細(xì)胞中形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)控制著突觸功能。神經(jīng)遞質(zhì)通常儲(chǔ)存在突觸小泡中,并通過適當(dāng)?shù)男盘?hào)釋放到突觸中,釋放的神經(jīng)遞質(zhì)通過突觸間隙建立連接并與相應(yīng)受體結(jié)合,完成突觸傳遞。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化與許多精神和生理疾病有關(guān),例如阿爾茨海默癥(Alzheimer disease, AD)、帕金森氏癥、精神分裂癥、癲癇、心律失常、甲狀腺激素缺乏癥、充血性心力衰竭等,因此神經(jīng)遞質(zhì)濃度的檢測(cè)是研究這些疾病的一個(gè)重要手段。神經(jīng)遞質(zhì)在生物樣品中的含量很低,且本身熒光響應(yīng)和質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)不強(qiáng),而生物樣品本身基體復(fù)雜,內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多,因此NTs的分析檢測(cè)存在極大困難。建立快速高效的樣品前處理方法和靈敏的檢測(cè)手段仍是目前深入開展神經(jīng)遞質(zhì)研究需要解決的問題。本文對(duì)一些常見的神經(jīng)遞質(zhì),如多巴胺(dopamine, DA)、乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、腎上腺素(epinephrine, EP)和去甲腎上腺素(noradrenalin, NE)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等的定量檢測(cè)方法以及在一些疾病研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述(見圖1)。

圖 1 神經(jīng)遞質(zhì)常見的檢測(cè)方法及其在不同疾病中的應(yīng)用Fig. 1 Common detection methods of neurotransmitters (NTs) and their applications in different diseasesACh: acetylcholine; 5-HT: 5-hydroxytryptamine; DA: dopamine; GABA: gamma-aminobutyric acid; NE: noradrenalin.

1 神經(jīng)遞質(zhì)及其與疾病的關(guān)系

神經(jīng)遞質(zhì)可分為生物胺類、氨基酸類、ACh類等,通過突觸間隙建立連接并與相應(yīng)受體結(jié)合,完成突觸傳遞。到目前為止,已經(jīng)鑒定了100多種神經(jīng)遞質(zhì)。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是功能重要的腦神經(jīng)遞質(zhì),由兒茶酚胺(DA、NE和EP)和5-HT組成。DA和5-HT在大腦中起關(guān)鍵作用,控制運(yùn)動(dòng)、情緒和行為[2]。DA神經(jīng)元主要位于中腦黑質(zhì)致密部位,中腦腹側(cè)被蓋區(qū)域和下丘腦[3]。5-HT在呼吸、體溫和情緒的自主控制中也被認(rèn)為起著重要作用[4]。

ACh是1921年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)[5],分布于神經(jīng)肌肉接頭、腦、脊髓和自主神經(jīng)系統(tǒng)中。ACh在記憶與學(xué)習(xí)中起著關(guān)鍵作用,同時(shí)還起著調(diào)節(jié)皮質(zhì)結(jié)構(gòu)、腦血液動(dòng)態(tài)和睡眠周期的作用。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道乙酰膽堿神經(jīng)元與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

Glu是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。Glu在突觸傳遞,組織和與疾病相關(guān)的神經(jīng)元遷移中起關(guān)鍵作用[7]。除了在CNS中的重要生理功能外,Glu還在許多疾病(諸如癲癇、神經(jīng)變性疾病和中風(fēng))的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用[8]。Glu的過量釋放導(dǎo)致突觸后膜Glu受體過度被激活,引起神經(jīng)功能障礙和變性,在一定程度上會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)興奮性毒性,進(jìn)而引發(fā)腦缺血損傷。

GABA是成熟CNS中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。它通過控制中間神經(jīng)元的活動(dòng)模式來調(diào)節(jié)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)。GABA在調(diào)節(jié)腦修復(fù)中起重要作用[9],在早期腦缺血和再灌注期間,GABA神經(jīng)傳遞的喪失會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的神經(jīng)元興奮性并可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[10]。

2 神經(jīng)遞質(zhì)的定量檢測(cè)方法

針對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)已報(bào)道的方法可總結(jié)為儀器分析方法、電化學(xué)傳感器、新興材料檢測(cè)法3大類。在神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)中使用較為廣泛的儀器分析法,主要包括高效液相色譜(HPLC)法、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法等。

2.1 HPLC法

HPLC法是應(yīng)用較為廣泛的定量分析方法,具有良好的選擇性和較低的檢出限。HPLC法應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)時(shí)所采用的檢測(cè)器有紫外-可見光(ultraviolet-visible, UV-VIS)檢測(cè)器、熒光(fluorescence, FL)檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemical detection, ECD)。多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)熒光基團(tuán)和可供離子化的官能團(tuán)不多,對(duì)熒光和質(zhì)譜的響應(yīng)信號(hào)較弱,且生物樣品基質(zhì)復(fù)雜,內(nèi)源性干擾物質(zhì)多,因此采用紫外可見光或熒光檢測(cè)器、衍生化(分離前或分離后)常常是必要的。ECD由于檢測(cè)靈敏度高、操作簡單,且對(duì)于兒茶酚胺和吲哚胺類化合物的檢測(cè)無需衍生化,應(yīng)用日益廣泛。ECD檢測(cè)可以通過庫侖法或安培法進(jìn)行,庫侖法具有較低的檢出限。

Chen等[11]選用鄰苯二甲醛作為衍生化試劑,采用HPLC-庫侖法結(jié)合微透析技術(shù)檢測(cè)大腦中5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。該方法檢出限可達(dá)1.5～5.7 nmol/L,可用于體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的連續(xù)監(jiān)測(cè)。Sanli等[12]采用3(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉環(huán)甲醛為衍生試劑,建立了RPLC-FL方法檢測(cè)大鼠和小鼠脊髓組織中4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì):Glu、甘氨酸(Gly)、?；撬?Tau)和GABA,由于大多數(shù)氨基酸的發(fā)光強(qiáng)度較弱,采用柱前衍生法進(jìn)行熒光檢測(cè)提高了重現(xiàn)性和靈敏度。同時(shí)柱前衍生化增加了分析物的疏水性,使其足以保留在反相固定相上。在最佳條件下,對(duì)于所有分析物,在0.50～50.00 mol/L的濃度范圍內(nèi),線性相關(guān)系數(shù)為0.991 2至0.999 7,檢出限范圍為0.03～0.06 mol/L。

2.2 HPCE法

HPCE具有進(jìn)樣量小(最低可達(dá)nL級(jí))、分析時(shí)間短和柱效高的特點(diǎn),常與微透析技術(shù)和在線柱前衍生技術(shù)聯(lián)用,在體內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的分析和連續(xù)監(jiān)測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[13]。大腦微透析、毛細(xì)管電泳(CE)與激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)的聯(lián)合使用,對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的外排物可以做到以每10 s一次的同步監(jiān)測(cè)。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)相較于傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)技術(shù)與毛細(xì)管電泳聯(lián)用可達(dá)到更低的檢出限。

Jako等[14]采用氟代試劑(7-氟-4-硝基-1,1,3-苯并惡二唑)為衍生化試劑,毛細(xì)管電泳與激光誘導(dǎo)熒光(LIF)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)生物樣品中D-絲氨酸(D-Ser)、D-天冬氨酸(D-Asp)與Glu和Asp。D-Ser與D-Asp的定量限為0.05 μmol,該方法成功應(yīng)用于成年小鼠的不同腦區(qū)中D-Asp和D-Ser含量檢測(cè)。Lorenzo等[15]建立了簡單、快速的CE-LIF檢測(cè)方法,用來檢測(cè)尿液、海馬體組織樣品中多種氨基酸的含量。該方法采用4-氟-7-硝基2,1,3-苯并惡二唑(NBD-F)為衍生化試劑,并且只需10 μL尿液或20 mg海馬組織,衍生化時(shí)間為15 min,分析時(shí)間為20 min,靈敏度可達(dá)nmol級(jí)。該方法成功應(yīng)用于檢測(cè)糖尿病患者尿液中Glu、Gly、D-Ser、Tau、Asp、苯丙氨酸(Phe)和Ser 7種氨基酸含量。Li等[16]采用腦微透析技術(shù)獲得下丘腦細(xì)胞外液透析液,建立了同時(shí)測(cè)定多種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的HPCE方法。該方法采用異硫氰酸熒光素為衍生劑,為了達(dá)到最佳分離狀態(tài),上樣緩沖液中加入一定量的十二烷基硫酸鈉(SDS)和3種有機(jī)改性劑(甲醇、乙腈和異丙醇),同時(shí)測(cè)定丘腦細(xì)胞外液透析液中多種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量,研究了腦缺血/再灌注過程中神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的動(dòng)態(tài)變化。

2.3 GC-MS法

GC-MS法也可用于神經(jīng)遞質(zhì)的定量檢測(cè),與LC相比,GC通常具有更高的峰容量、更少的基質(zhì)效應(yīng)、更高的穩(wěn)定性和靈敏度。質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度以及結(jié)構(gòu)判定等優(yōu)勢(shì)。目前GC-MS法應(yīng)用于檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)同樣需要樣品純化處理和衍生化。Aragon等[17]采用GC-MS法測(cè)定暴露于低濃度具有神經(jīng)毒性農(nóng)藥和甲基汞等化學(xué)物質(zhì)中的斑馬魚幼魚中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(MNT)的含量變化。該方法在樣品前處理時(shí)采用兩步衍生化:N-甲基-2-七氟丁胺(BMHFBA)用于N-全氟?；磻?yīng);六甲基二硅氮烷(HDMS)用于O-硅烷化反應(yīng)。方法的檢出限和定量限分別為0.4～0.8 μg/L和1.2～2.7 μg/L。雖然未檢測(cè)到視覺畸形,但在斑馬魚早期發(fā)育過程中MNT水平變化顯著。結(jié)果表明,產(chǎn)生神經(jīng)毒性的化學(xué)物質(zhì)可以改變神經(jīng)遞質(zhì)水平,從而可能影響早期腦發(fā)育。

2.4 LC-MS法

LC-MS法將色譜的高分離性能和質(zhì)譜鑒別力強(qiáng)的特點(diǎn)相結(jié)合,許多劑量小藥效強(qiáng)的藥物及其代謝產(chǎn)物多為極性強(qiáng)、難揮發(fā)的化合物,LC-MS法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)液相檢測(cè)器的不足,成為了體內(nèi)藥物分析中不可或缺的有效檢測(cè)手段。近年來,LC-MS檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的應(yīng)用日漸增多,表1列舉了一些實(shí)例,包括樣品前處理方法及其相應(yīng)檢出限等。

表 1 LC-MS測(cè)定生物樣品中神經(jīng)遞質(zhì)含量Table 1 Determination of NT contents in biological samples by LC-MS

DLLME: dispersive liquid-liquid microextraction; ILUSA: ionic liquid based ultrasound assisted; SCX/SPE: strong cation exchange/solid phase extraction; LLME: liquid-liquid microextraction; LLOQ: lower limit of quantitation; CNS: central nervous system.

由于生物樣本中(包括血漿、尿液和腦組織等)神經(jīng)遞質(zhì)的含量較低且內(nèi)源性化合物干擾較大,采用LC-MS法檢測(cè)時(shí)樣品前處理是有必要的。傳統(tǒng)的前處理技術(shù)包括液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)和固相萃取(solid phase extraction, SPE)。近年來,出現(xiàn)一些新的微萃取技術(shù),包括填充吸著劑微萃取(microextraction by packed sorbent, MEPS)[32]、固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)[33]、分散液-液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)。DLLME是基于合理的萃取溶劑和分散溶劑混合物開發(fā)的萃取技術(shù),只需要少量的有機(jī)溶劑,當(dāng)快速注入液體樣品后形成渾濁溶液并且樣品和萃取溶劑之間快速達(dá)到平衡,而完成目標(biāo)化合物的萃取。SPME是一種多用途的提取方法,需要非常少的溶劑量便可達(dá)到同時(shí)萃取和富集多種分析物的作用。然而,SPME纖維壽命是有限的。MEPS是一種用于樣品純化的小型化固相萃取技術(shù),但與一般SPE有顯著差異,它是把吸著劑直接集成到注射器中,而不是一個(gè)單獨(dú)的小柱子,因此可用于100次以上的萃取純化,而常規(guī)固相萃取小柱只能使用1次。MEPS可以與GC-MS、LC-MS、毛細(xì)管電色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。用注射器作為進(jìn)樣裝置,可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,包括樣品處理、萃取和注射等步驟[34]。傳統(tǒng)的前處理技術(shù)需要較長的處理時(shí)間和大量的有機(jī)溶劑,這些新技術(shù)具有效率高、操作簡單快速和成本低的優(yōu)點(diǎn),已逐漸應(yīng)用于生物樣品神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定的處理。

2.抓安全教育。對(duì)HSE工作遵循“安全第一、預(yù)防為主”的原則，安全工作經(jīng)常抓、抓日常，積極宣貫落實(shí)《安全生產(chǎn)禁令》《員工守則》和崗位責(zé)任制，開展了“人人都是安全員”、排查身邊的隱患、“我能安全”演講、書法作品征集等活動(dòng)；開辦了“安全生產(chǎn)小課堂”，利用周一生產(chǎn)會(huì)的時(shí)機(jī)，集中20分鐘的時(shí)間，分析案例，講解注意事項(xiàng)、家庭生活安全常識(shí)、夏季防暑降溫技巧等知識(shí)；在單元親情提示牌、服務(wù)大廳等顯著位置張貼、發(fā)放“安全防范溫馨提示七字歌”等宣傳品，提醒大家做好安全防范，提高了全員的安全意識(shí)。

Jha等[19]采用離子液體超聲輔助分散液-液微萃取(IL-USA-DLLME)結(jié)合LC-MS法檢測(cè)大鼠腦組織、血漿和細(xì)胞內(nèi)15種神經(jīng)遞質(zhì)的含量,該檢測(cè)方法快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)且無需衍生化。前處理過程中采用離子液體替代了傳統(tǒng)的有毒溶劑作為提取溶劑,將萃取溶劑(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽,BMIMPF6)和分散溶劑(乙腈)的混合物快速注射到樣品基質(zhì)中,渦流攪拌和超聲,離心,萃取相在下層。實(shí)驗(yàn)過程中所需溶劑量少,分析時(shí)間快,從樣品制備到儀器分析時(shí)間不超過15 min。該分析方法具有良好的選擇性,成功應(yīng)用到不同生物基質(zhì)(大鼠腦組織、大鼠血漿和細(xì)胞樣品)中神經(jīng)遞質(zhì)含量的測(cè)定,檢出限在大鼠腦組織中可達(dá)到0.021～0.912 μg/L,在大鼠血漿中可達(dá)到0.028～0.978 μg/L,在細(xì)胞樣品中可達(dá)到0.025～0.945 μg/L。Zhang等[35]采用N-叔丁氧羰基-L-色氨酸-羥基琥珀酰亞胺酯(Boc-TRP)作為衍生化試劑同時(shí)測(cè)定大鼠大腦微透析樣本的多種神經(jīng)遞質(zhì)。在三重四極質(zhì)譜分析中,衍生化產(chǎn)物中的叔丁氧基基團(tuán)顯示出獨(dú)特的碎片化模型,極大地提高了特異性和敏感度。該研究建立的快速LC-MS定量分析法線性范圍寬,相關(guān)系數(shù)大于0.990。在室溫下,Boc-TRP衍生劑在磷酸根緩沖液(pH 7.4)中衍生速度較快,衍生的神經(jīng)遞質(zhì)在HPLC中可快速分離。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)為強(qiáng)極性物質(zhì),在反相色譜柱上保留極弱,且離子化效率低,質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)不強(qiáng),降低了質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度。通過衍生化處理可以改善單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的色譜保留行為和離子化效率。二乙基可降低單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的極性,提高離子化效率。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含有羧基、羥基、氨基等極性基團(tuán),采用LC-MS法檢測(cè)時(shí)需要先對(duì)其衍生化以提高待測(cè)物的分離度和靈敏度。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)常用的衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(Dansyl-C)、異硫氰酸苯酯(PITC)、丙酸酐等。這些傳統(tǒng)的衍生化試劑都有各自的缺點(diǎn),如OPA不能和仲氨酸反應(yīng),與胱氨酸的衍生物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較低且不穩(wěn)定;Dansyl-C的衍生化時(shí)間較長,同時(shí)Dansyl-C及其衍生物容易見光分解。近年來新的衍生化試劑不斷出現(xiàn),如Zhao等[26]采用10-乙基-阿啶酮-3-磺酰氯(EASC)為衍生試劑,開發(fā)了同時(shí)測(cè)定多種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的LC-MS法;Zhao等[30]等采用衍生化試劑4-氯代羰基羅薩明(CCR)建立了LC-MS法測(cè)定大鼠尿液中氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。如何選擇合適的衍生化試劑、簡化衍生化步驟、提高衍生化效率、使衍生產(chǎn)物穩(wěn)定且無相互干擾是LC-MS法應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)的關(guān)鍵。Zheng等[36]首次提出穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化與超聲輔助DLLME聯(lián)用技術(shù),采用LC-MS法同時(shí)測(cè)定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(MANT)及其生物合成前體和相應(yīng)代謝物。質(zhì)譜敏化試劑d0-10-甲基-阿啶酮-2磺酰氯和d3-10-甲基-嘧啶-2-磺酰氯作為同位素探針來標(biāo)記神經(jīng)遞質(zhì)可降低質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)。該方法已成功應(yīng)用于帕金森病模型和正常大鼠腦微透析液中神經(jīng)遞質(zhì)含量的測(cè)定。

2.5 電化學(xué)傳感器法

儀器分析方法通常需要昂貴的儀器設(shè)備,操作比較耗時(shí)。近年來,一些研究人員[37]使用獨(dú)特的材料開發(fā)生物傳感器,用于體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)。這些傳感器具有出色的傳感性能,如快速響應(yīng)、簡單的測(cè)量程序、高靈敏度和選擇性。其中,電化學(xué)傳感器具有較好的重復(fù)性、較高的準(zhǔn)確性及較寬的線性響應(yīng)范圍,具有低檢出限和實(shí)時(shí)測(cè)量的優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)與臨床診斷和疾病治療相關(guān)分析物的快速、靈敏、選擇性和低成本檢測(cè)。

在眾多基于電化學(xué)檢測(cè)方法報(bào)道中,碳基電極的應(yīng)用較為廣泛,用于體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)可提供較高的分辨率,碳基電極可分為玻碳電極(GCE)、石墨烯電極(GRE)、碳糊電極(CPE)等。GCE已用于多分析物檢測(cè),玻碳通常用作幾種化學(xué)修飾電極的底物。石墨烯(Gr)是極薄的材料,比金剛石更柔韌、更硬,并且在室溫下比其他材料導(dǎo)電更有效。Gr對(duì)某些物質(zhì)具有優(yōu)異的電子轉(zhuǎn)移促進(jìn)能力,對(duì)小分子具有優(yōu)異的催化性能。CPE由美國著名電化學(xué)家Adams[38]于1958年推出,具有制備快速簡便、成本低等優(yōu)于其他電極的優(yōu)點(diǎn)。碳糊材料已成為實(shí)驗(yàn)室用于制備各種電極、傳感器和探測(cè)器的最流行的電極材料之一。Baluta等[39]基于石墨烯量子點(diǎn)(GQD)和漆酶修飾的GCE開發(fā)了一種有用的電化學(xué)傳感方法用于檢測(cè)EP。在優(yōu)化的條件下,線性范圍為1.0～1.2×10-4mol/L,檢出限為83 nmol/L。Madhu等[40]使用SnO2納米片修飾導(dǎo)電碳紗(CCY),用作DA的無標(biāo)記檢測(cè)。采用水熱法將SnO2納米結(jié)構(gòu)固定在CCY表面。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定DA,檢出限為53 nmol/L,線性范圍為0.01～150 mol/L。

此外,其他碳基材料如碳納米管(CNT)[41]、碳纖維(carbon fiber)[42]、貴金屬和金屬氧化物納米顆粒(NPs)[43]、離子液體(ILs)[44]、分子印跡聚合物(MIP)[45]等用于電極的修飾,以提高神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)的靈敏度和選擇性。本文列舉了基于電化學(xué)傳感器開發(fā)的測(cè)定生物樣本中神經(jīng)遞質(zhì)的方法及相應(yīng)的檢出限,詳見表2。

在電化學(xué)傳感器檢測(cè)方法中,除了碳基電極應(yīng)用較為廣泛以外,近些年來,一些新興的納米材料用作電極材料應(yīng)用于體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量測(cè)定。例如,基于離子在兩種不混溶電解質(zhì)溶液之間的界面上轉(zhuǎn)移的納米移液管電極可以用來檢測(cè)多種神經(jīng)遞質(zhì),包括具有電化學(xué)氧化還原活性的5-HT和非氧化還原活性的ACh等神經(jīng)遞質(zhì)[58]。用碳量子點(diǎn)修飾的NiAl層狀雙氫氧化物(NiAl-LDH/CD)復(fù)合材料是電化學(xué)生物傳感器發(fā)展中出現(xiàn)的新興材料,該復(fù)合材料是采用水熱法合成具有交聯(lián)納米片結(jié)構(gòu)和高比表面積的花狀納米材料,可修飾GCE電極應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)[59,60]。

表 2 基于電化學(xué)傳感器方法測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)Table 2 Determination of NTs based on an electrochemical sensor method

DA: dopamine; EP: epinephrine; GCE: glassy carbon electrode; CPE: carbon paste electrode; SPE: screen-printed electrode PGE: pencil graphite electrode; ITO: indium tin oxide; CNT: carbon nanotube; PPy: polypyrrole; MWCNT: multiwalled carbon nanotubes. EDAS:N-[3(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine; AuNPs: Au nanoparticles: AzrS: Alizarin red S; 2-CBF/AZ: 2-chlorobenzoyl ferrocene/Ag-ZnO; IL: ionic liquid; Gr: graphene; Fe3O4NPs-MWCNT-poly: Fe3O4nanoparticles-multiwalled carbon nanotubes-poly; ILC/RGO: ionic liquid crystal/reduced grapheneoxide; OFMs: olive-like Fe2O3microspheres; 3D HGBs: three-dimensional hollow graphene balls; rGO: re-dispersed graphene oxide; MIP: molecularly imprinted polymer.

2.6 其他檢測(cè)方法

2.6.1光學(xué)傳感器

2.6.2生物傳感器

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)具有高度特異性,構(gòu)成大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的受體。Jing等[65]最近通過使用GPCR支架,開發(fā)了一種具有高信噪比的ACh傳感器,可檢測(cè)體內(nèi)/體外環(huán)境中ACh的信號(hào),在從幾種動(dòng)物物種制備的十幾種類型的神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染病毒和轉(zhuǎn)基因表達(dá)得到驗(yàn)證。結(jié)果顯示,該傳感器選擇性地響應(yīng)外源和內(nèi)源ACh信號(hào)。最近,Moreira等[66]提出了基于混合酶燃料電池的第一傳感器用于ACh的實(shí)時(shí)原位檢測(cè),該方法不需要樣品處理,響應(yīng)時(shí)間在3 min內(nèi)。這種方法說明ACh的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)朝著自動(dòng)供電的廉價(jià)設(shè)備邁出了重要一步。

3 應(yīng)用

一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病與神經(jīng)遞質(zhì)濃度的微小變化密切相關(guān),因此,神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定成為疾病診斷和監(jiān)測(cè)以及治療干預(yù)的重要手段。多種分析方法已被用于研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病中神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化,如AD、抑郁癥、唐氏綜合征、亨廷頓病、帕金森病和精神分裂癥等。探討各種疾病模型中特定神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化可為研究人員提供有關(guān)潛在致病機(jī)制的重要信息,有效的神經(jīng)遞質(zhì)體內(nèi)監(jiān)測(cè)可以反映治療效果,從而為臨床合理用藥乃至新的藥物設(shè)計(jì)和新治療方法提供科學(xué)依據(jù)。

3.1 AD

AD是一種神經(jīng)退行性疾病,其特征是記憶和其他認(rèn)知功能逐漸喪失。已有研究[67]表明,膽堿能神經(jīng)元的退化在與AD相關(guān)的認(rèn)知衰退中起主要作用。如前所述,神經(jīng)遞質(zhì)是通過在突觸前神經(jīng)元發(fā)送信號(hào)來維持突觸和認(rèn)知功能的必需的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì),通過研究神經(jīng)遞質(zhì)的變化以確定它們?cè)贏D中的作用,并有助于診斷AD。Zhao等[30]采用原位超聲輔助衍生DLLME前處理技術(shù)結(jié)合LC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)AD模型大鼠尿液中氨基酸類和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量。該方法可在16 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)22種分析物,檢出限達(dá)1×10-4～1×10-2nmol/L。應(yīng)用該方法對(duì)正常組和AD模型組大鼠尿液中的神經(jīng)遞質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果(見圖2)表明,AD模型組大鼠尿液中DL-3,4-二羥基苯基乙二醇(DHPG)以及3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇(MHPG)含量顯著高于正常對(duì)照組(p<0.01)。GABA和Gly也明顯高于對(duì)照組,而AD大鼠尿中L-3,4-二羥基苯基丙氨酸(L-DOPA)、DA、NE、去甲變腎上腺素(NME)、3-甲氧基酪胺鹽酸鹽(3-MT)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、DL-3,4-二羥基扁桃酸(DOMA)、香草扁桃酸(VMA)、5-HT和Asp水平顯著低于正常對(duì)照組(p<0.01)。Hsieh等[68]建立了一種簡單的環(huán)糊精毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法,并配有激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器,用于分析興奮性氨基酸Asp和Glu。血漿和腦脊液(CSF)樣品經(jīng)離心過濾裝置預(yù)處理后,去除高分子量蛋白質(zhì),然后用106-羧基熒光素N-羥基琥珀酰亞胺酯在二甲基亞砜(DMSO)中衍生化。應(yīng)用該方法測(cè)定了26例AD患者血漿和腦脊液中Asp和Glu的濃度,并研究了這些遞質(zhì)濃度與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系(見圖3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示,血漿和腦脊髓液中Asp及Glu濃度與AD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。以上分析方法在AD疾病的臨床診斷,監(jiān)測(cè)治療效果和藥物評(píng)價(jià)方面具有潛在價(jià)值。

圖 2 正常和AD組(a)DA及其代謝產(chǎn)物和(b)5-HT及其代謝產(chǎn)物的濃度(n=8)[30]Fig. 2 Concentrations of (a) DA and its metabolites and (b) 5-HT and its metabolites in normal and Alzheimer disease (AD) groups (n=8)[30] L-DOPA: L-3,4-dihydroxyphenylalanine; E: epinephrine; 3-MT: 3-methoxytyramine hydrochloride; NME: normetanephrine; ME: metanephrine; DOPAC: 3,4-dihydroxyphenylacetic acid; HVA: homovanillic acid; DOMA: DL-3,4-dihydroxymandelicacid; DHPG: DL-3,4-dihydroxyphenyl glycol; VMA: vanillylmandelic acid; MHPG: 4-hydroxy-3-methoxyphenylglycol; 5-HIAA: 5-hydroxyindole-3-acetic acid.

圖 3 血漿和腦脊液(CSF)中D-Asp/L-Asp和Glu的電泳圖譜[68]Fig. 3 Electropherograms of D-Asp/L-Asp and Glu in plasma and cerebrospinal fluid (CSF)[68] a. plasma sample from an AD patient; b. plasma sample from a non-AD patient; c. CSF sample from an AD patient; d. CSF sample from a non-AD patient. Peak Nos.: 1. D-Glu; 2. L-Glu; 4. L-Asp.

3.2 抑郁癥

抑郁癥是一種以情緒低落、自我價(jià)值感降低、快感缺失為主要癥狀的精神類疾病。重度抑郁癥(MDD)涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂,包括GABA、DA、5-HT等[69]。Wojnicz等[25]建立了一種快速的LC-MS方法測(cè)定大鼠腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì):EP、NE、Glu、GABA、DA、5-HT、5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)及MHPG。定量限為0.25～250 μg/L。此方法成功應(yīng)用于檢測(cè)Nrf2基因剔除的小鼠抑郁癥模型內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物,結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠海馬樣本中NE、5-HT、DA、5-HIIA、Glu 5種化合物在基因剔除小鼠與正常小鼠之間無明顯差別,但基因剔除小鼠海馬樣本中GABA的含量明顯減少。該研究首次報(bào)道Nrf2基因剔除的小鼠海馬組織中GABA水平,也支持了抑郁癥Glu缺陷假說。該實(shí)驗(yàn)有助于尋找抑郁癥和其他相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物,提高神經(jīng)遞質(zhì)水平變化相關(guān)疾病的診治水平和效率。

3.3 缺血性中風(fēng)

缺血性中風(fēng)是指腦血栓形成或在腦血栓的基礎(chǔ)上導(dǎo)致腦梗死、腦動(dòng)脈堵塞而引起的偏癱和意識(shí)障礙,不僅發(fā)病率高,也具有較高的病亡率以及致殘率。神經(jīng)元中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu和Asp過度釋放產(chǎn)生的神經(jīng)毒性與腦缺血性損傷有關(guān),目前這些神經(jīng)遞質(zhì)已成為科學(xué)家們研究中風(fēng)治療方法的目標(biāo)[70]。王展等[71]采用LC-MS/MS法測(cè)量比較卒中組以及正常對(duì)照組血漿內(nèi)的5-HT、NE、Glu和GABA 4種神經(jīng)遞質(zhì)的濃度。同時(shí)比較不同卒中嚴(yán)重程度患者的4種神經(jīng)遞質(zhì)濃度。結(jié)果表明,血漿神經(jīng)遞質(zhì)與正常對(duì)照組相比,血漿5-HT、NE和Glu有上升趨勢(shì),GABA有下降趨勢(shì);缺血性卒中急性期血漿神經(jīng)遞質(zhì)水平與正常對(duì)照組相比有差異,中重度卒中患者的血漿5-HT水平升高較輕度卒中患者顯著。

3.4 精神分裂癥

精神分裂癥是一種相對(duì)常見、慢性且常常具有毀滅性的神經(jīng)精神疾病。嚴(yán)重癥狀通常出現(xiàn)在青春期晚期或成年早期,涉及認(rèn)知、情緒和行為異常。到目前為止,還沒有生物學(xué)驗(yàn)證或?qū)嶒?yàn)室試驗(yàn)可以診斷該疾病,也沒有生物標(biāo)志物可以評(píng)價(jià)治療效率。血漿中神經(jīng)遞質(zhì)水平含量的變化可能會(huì)影響神經(jīng)分裂癥患者的情緒敏感程度和治療效果。Diego等[72]采用LC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)人血漿中多種神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸的含量,血漿樣本來自35例精神分裂癥患者(其中27例患者接受氯氮平藥物治療,8例患者接受奧氮平治療)和38名健康志愿者。該測(cè)定方法可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療效果。結(jié)果顯示,與對(duì)照組(健康志愿者)比較,奧氮平治療精神分裂癥患者血漿中蛋氨酸水平顯著較高,氯氮平治療精神分裂癥患者血漿中Glu水平明顯升高。該方法可成功應(yīng)用于監(jiān)測(cè)臨床治療效果。

4 結(jié)論與展望

神經(jīng)遞質(zhì)在診斷和治療精神障礙疾病中起著至關(guān)重要的作用,因此在各種環(huán)境中實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)其濃度尤為必要。生物介質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)的定量測(cè)定可采用儀器檢測(cè)方法,電化學(xué)檢測(cè)方法及一些基于光學(xué)傳感器和生物傳感器的檢測(cè)方法。儀器分析方法具有良好的選擇性和較低的檢出限。電化學(xué)傳感器法具有較好的重復(fù)性、較高的準(zhǔn)確性以及較寬的線性范圍,并且具有低檢出限和實(shí)時(shí)測(cè)量的優(yōu)勢(shì),可用于神經(jīng)遞質(zhì)的快速檢測(cè),但暫時(shí)無法實(shí)現(xiàn)多種神經(jīng)遞質(zhì)的同時(shí)測(cè)定?；诠庾V分析法開發(fā)的新型生物傳感器應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè),可達(dá)較低的檢出限并具有良好的選擇性,但目前還處于理論研究階段。未來關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)的研究方向還是聚焦于開發(fā)出同時(shí)檢測(cè)多種神經(jīng)遞質(zhì)且無相互干擾的分析方法。應(yīng)用于體內(nèi)檢測(cè)時(shí),需要考慮生物兼容性、穩(wěn)定性、靈敏度、重復(fù)性等。碳基材料用于神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)具有良好的生物兼容性,但目前研究還處于初級(jí)階段;儀器分析方法則致力于開發(fā)操作簡便、省時(shí)省力、對(duì)環(huán)境友好的前處理方式,且可同時(shí)檢測(cè)多種神經(jīng)遞質(zhì)。隨著各類分析技術(shù)的發(fā)展,越來越多新技術(shù)和新方法有望實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)檢測(cè)生物基質(zhì)中的神經(jīng)遞質(zhì),為神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。