采前氯吡苯脲處理對采后‘秦美’獼猴桃細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

李圓圓，羅安偉*，蘇 苗，李 琳，白俊青，李 銳，藺志穎，宋俊奇

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃味道酸甜、氣味清新，并含有豐富的膳食纖維、VC、氨基酸、礦物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)[1]，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。但在自然栽培條件下，獼猴桃果實較小、產(chǎn)量較低。據(jù)調(diào)查顯示，為提高果實單果質(zhì)量及畝產(chǎn)量，陜西周至、眉縣及武功地區(qū)的獼猴桃在生長期間幾乎都使用氯吡苯脲（N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea，CPPU）處理。

CPPU是一種細(xì)胞分裂素類的植物生長調(diào)節(jié)劑，俗稱膨大劑，它能提高開花坐果率，促進(jìn)果實細(xì)胞分裂，促使果實膨大[2]。但研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的CPPU會引起較嚴(yán)重的果實風(fēng)味變差、品質(zhì)及貯藏性降低等負(fù)面效應(yīng)[3-5]，微觀方面主要是細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁成分的變化，包括果肉細(xì)胞中葉綠體崩潰、線粒體降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其他細(xì)胞器消失，同時細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松散、降解。國內(nèi)外關(guān)于不同處理對果實采后貯藏期間細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的研究很少。Bu Jianwen等[6]通過透射電子顯微鏡觀察表明，紫外線-C照射延緩了番茄果皮細(xì)胞壁的分解。Loredo等[7]從細(xì)胞壁降解等微觀方面解釋了熱燙和/或滲透脫水對蘋果流變特性、質(zhì)地和結(jié)構(gòu)的關(guān)系。Alandes等[8]從超微結(jié)構(gòu)方面說明了乳酸鈣處理能提高鮮切富士蘋果細(xì)胞壁穩(wěn)定性。Hu Huigang等[9]從果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁和膜的完整性方面說明蠟處理可降低低溫脅迫下黑心菠蘿的出現(xiàn)。Fava等[10]研究了H2O2浸泡、紫外線照射和超聲處理對葡萄細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)處理組果實外果皮中斷，中果皮塌陷及細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離。任亞梅等[11]發(fā)現(xiàn)，1 μL/L 1-甲基環(huán)丙烯處理和1 μmol/L NO處理明顯延緩了獼猴桃果肉細(xì)胞壁的分解和葉綠體的解體。周慧娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)黃肉桃果實采后貯藏過程中果皮細(xì)胞壁變形，有色體穩(wěn)定性變差，線粒體減少。綜合國內(nèi)外研究結(jié)果表明，果實在后熟衰老過程中細(xì)胞間隙大小、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜及一系列細(xì)胞器結(jié)構(gòu)都發(fā)生著復(fù)雜的變化[13-14]。而關(guān)于CPPU處理對獼猴桃采后貯藏期間果肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響方面的研究鮮有報道。本實驗以‘秦美’獼猴桃為試材，研究采前CPPU處理對采后獼猴桃果實冷藏期間細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，旨在為采后獼猴桃果實軟化衰老機(jī)制及其控制途徑的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試獼猴桃品種為‘秦美’，采自陜西省楊凌區(qū)一管理良好的獼猴桃基地果園，樹齡6 年。

CPPU 四川省蘭月科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇 廣東光華科技股份有限公司；體積分?jǐn)?shù)25%戊二醛溶液 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四氧化鋨固定液 上海哈靈生物科技有限公司；醋酸雙氧鈾 上海寶曼生物科技有限公司；檸檬酸鉛 百靈威科技有限公司。所有試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

HT7700型透射電子顯微鏡 日本日立公司；UC6超薄切片機(jī) 德國Leica儀器有限公司；SP-3000P光學(xué)顯微鏡日本株式會社拓普康；電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；TA.XT Plus/50物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設(shè)計

于獼猴桃盛花期后28 d用10、20 mg/L CPPU水溶液蘸果處理，蘸果時間3～5 s，以清水蘸果處理作為對照組。當(dāng)果實可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6.0%～6.5%時采收，采后及時運(yùn)回冷庫。預(yù)冷24 h后用厚度0.03 mm的聚乙烯袋包裝，在0～1 ℃、相對濕度90%～95%下貯藏備用。在貯藏第0天（剛采收時）和貯藏90（貯藏中期）、150 d（貯藏末期）分別取樣，進(jìn)行果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.2 硬度測定

果肉硬度采用物性測定儀測定，每次測量15 個果實，最大量程25 kg，P5圓形探頭，探頭直徑為0.5 cm，單位為kg/cm2。

1.3.3 腐爛率測定

果實腐爛率根據(jù)式（1）計算。

1.3.4 質(zhì)量損失率

果實質(zhì)量損失率根據(jù)式（2）計算。

1.3.5 果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

用雙面刀片將果肉（皮下3 mm左右）切成1 mm3大小的方塊，用體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛（0.1 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液配制），在室溫下固定16 h，同時抽氣直到切塊下沉為止。用0.1 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗（5、10、15、20、25、30 min各沖洗一次）。用體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸（0.2 mol/L、pH 6.8磷酸鹽緩沖液配制）室溫下后固定2 h，之后磷酸鹽緩沖液再次沖洗，用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液各脫水1 次，每次15 min，再用無水乙醇脫水2 次，每次30 min。Technovit 7100樹脂滲透后包埋，在60 ℃溫箱中聚合48 h，用超薄切片機(jī)切薄片，經(jīng)醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行Duncan差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 2016軟件作圖；電子顯微鏡圖片用Photoshop軟件進(jìn)行調(diào)色和清晰度處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPPU處理對獼猴桃果實貯藏期間硬度的影響

圖1 CPPU處理對獼猴桃果實貯藏期間硬度的影響Fig.1 Effect of CPPU treatment on fruit fi rmness of kiwifruit during storage

果實在采后成熟衰老過程中，硬度呈現(xiàn)一直下降的趨勢。如圖1所示，使用CPPU處理的果實硬度均顯著低于對照組果實（P＜0.05），且與CPPU質(zhì)量濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，質(zhì)量濃度越大，果實硬度越低。從采收到貯藏第150天，對照組和10、20 mg/L處理組的硬度分別下降了76.21%、76.41%和76.63%。

2.2 CPPU處理對獼猴桃貯藏期間果實質(zhì)量損失率和腐爛率的影響

由圖2A、B可知，獼猴桃果實在貯藏期間，隨著CPPU處理質(zhì)量濃度的升高，果實質(zhì)量損失率和腐爛率顯著增加（P＜0.05）。在貯藏第90、150天，20 mg/L處理組果實的質(zhì)量損失率最高（圖2A）。出庫時，對照組的腐爛率最低，10 mg/L處理組次之，20 mg/L處理組最高，且各組之間差異顯著（P＜0.05）（圖2B）。

圖2 CPPU處理對獼猴桃貯藏期質(zhì)量損失率（A）和腐爛率（B）的影響Fig.2 Effect of CPPU treatment on mass loss rate (A) and decay incidence (B) of kiwifruit during storage

2.3 CPPU處理對貯藏期獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 CPPU處理對采收當(dāng)天獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 CPPU處理對采收當(dāng)天獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of CPPU treatment on cell ultrastructure of kiwifruit on the day of harvest

由圖3A可觀察到獼猴桃果肉的細(xì)胞壁只有初生壁，沒有次生壁。相鄰細(xì)胞由兩層質(zhì)膜分界的細(xì)胞壁隔開，并由胞間層所緊密連接。因此，相鄰兩細(xì)胞所共有的壁為3 層，即中間的胞間層與兩側(cè)的初生壁[15]。

剛采收的對照組與處理組的獼猴桃果肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化有一定的差異。剛采收時，細(xì)胞明顯液泡化，細(xì)胞質(zhì)與內(nèi)含物被擠成一薄層，緊貼細(xì)胞壁。對照組果實細(xì)胞壁整齊，厚度一致，結(jié)構(gòu)完整，呈明顯的明-暗-明分區(qū)結(jié)構(gòu)，胞間層為一薄的高電子密度的暗層，均勻而連續(xù)，內(nèi)含物豐富，膜結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)生質(zhì)壁分離（圖3A1）；線粒體是果實進(jìn)行呼吸和能量代謝轉(zhuǎn)換的場所，與果實的衰老進(jìn)程有密切的關(guān)系[16]，對照組果實線粒體結(jié)構(gòu)清晰可辨，無破損現(xiàn)象（圖3A1～A3）；果肉細(xì)胞含有大量淀粉顆粒，粒大而明顯（圖3A2），相鄰細(xì)胞由胞間質(zhì)緊密相連（圖3A3），此時獼猴桃果實硬度最高，硬度為14 kg/cm2。10 mg/L CPPU處理組的獼猴桃果實細(xì)胞壁、膜系統(tǒng)及線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與對照組無明顯差異（圖3B1～B3），淀粉顆粒大而明顯，但數(shù)量明顯少于對照組（圖3B2），且細(xì)胞胞間質(zhì)密度低于對照組（圖3B3）。20 mg/L處理的獼猴桃果實細(xì)胞壁仍整齊，結(jié)構(gòu)完整，但暗層中膠層致密度明顯降低，細(xì)胞內(nèi)含物豐富，膜結(jié)構(gòu)仍完整，也未發(fā)生質(zhì)壁分離（圖3C1）；線粒體結(jié)構(gòu)清晰可辨，無破損現(xiàn)象，數(shù)量明顯少于對照組（圖3C1～C3）；淀粉顆粒數(shù)與10 mg/L處理組無明顯差異，但少于對照組（圖3C2）；細(xì)胞胞間質(zhì)完全降解，出現(xiàn)小的間隙（圖3C3）。上述結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度CPPU處理對剛采收的獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響較小，但20 mg/L CPPU處理對獼猴桃果實線粒體、胞間質(zhì)的影響大于10 mg/L CPPU處理。

2.3.2 CPPU處理對貯藏90 d獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖4 CPPU處理對貯藏90 d獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of CPPU treatment on cell ultrastructure of kiwifruit after 90 days of storage

與剛采收的獼猴桃果實相比，采后貯藏90 d時的獼猴桃果實細(xì)胞壁開始松散，胞間中膠電子層仍明顯，但致密性降低，細(xì)胞質(zhì)降解，淀粉顆粒減少，線粒體數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞間隙增大。但不同質(zhì)量濃度CPPU處理對獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響不同。其中對照組獼猴桃果實的細(xì)胞壁排列整齊，厚度均勻，但中膠層電子致密度下降（圖4A1）；線粒體、淀粉顆粒數(shù)量減少，線粒體個別降解，出現(xiàn)小泡（圖4A1～A3）；液泡膜個別出現(xiàn)破損，胞間質(zhì)開始降解（圖4A3），失去淀粉的支撐和膨壓作用，果肉硬度迅速下降為5.13 kg/cm2，果實開始進(jìn)入成熟狀態(tài)，腐爛率和質(zhì)量損失率也明顯升高。10 mg/L CPPU處理組的獼猴桃果實細(xì)胞壁個別位點(diǎn)出現(xiàn)降解，導(dǎo)致壁厚度不均勻、彎曲變形，中膠層分解（圖4B1）；線粒體結(jié)構(gòu)受損且數(shù)量明顯少于對照組（圖4B1～B3）；淀粉顆粒數(shù)減少，逐漸淡化（圖4B2）；液泡膜大量破裂，胞間質(zhì)完全降解，細(xì)胞間出現(xiàn)小的間隙（圖4B3），果實硬度（3.66 kg/cm2）顯著小于同一時期對照組獼猴桃。20 mg/L CPPU處理組果實細(xì)胞壁多個位點(diǎn)出現(xiàn)降解，細(xì)胞壁嚴(yán)重變形，中膠層消失（圖4C1）；線粒體、淀粉顆粒與10 mg/L CPPU處理組無明顯差異（圖4C1～C3）；液泡膜破裂情況明顯比對照組嚴(yán)重，細(xì)胞間隙進(jìn)一步增大（圖4C3），此時果實硬度（3.43 kg/cm2）與對照組貯藏150 d（貯藏末期）時的果實硬度無明顯差異，說明高質(zhì)量濃度CPPU處理加速了獼猴桃果實衰老進(jìn)程。上述結(jié)果表明，采前CPPU處理加速了采后貯藏90 d內(nèi)獼猴桃果實細(xì)胞壁及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的降解，且CPPU質(zhì)量濃度越大，受損越嚴(yán)重。

2.3.3 CPPU處理對貯藏150 d獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖5 CPPU處理對貯藏150 d獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of CPPU treatment on cell ultrastructure of kiwifruit after 150 days of storage

采后貯藏150 d的獼猴桃果實細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)降解部位不均勻?qū)е聡?yán)重變形，同時發(fā)生質(zhì)壁分離，明暗分區(qū)不明顯，淀粉基本消失，線粒體降解，細(xì)胞間黏合能力喪失。但不同質(zhì)量濃度CPPU處理對獼猴桃果實細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響不同。其中對照組獼猴桃果實的細(xì)胞壁個別位點(diǎn)發(fā)生降解，導(dǎo)致細(xì)胞壁厚度不均勻，彎曲變形，質(zhì)壁分離嚴(yán)重，中膠層降解（圖5A1）；線粒體變形、內(nèi)容物解體，細(xì)胞器雙層膜模糊或消失（圖5A1、A2），淀粉顆粒大量分解（圖5A2）；連接相鄰細(xì)胞的胞間質(zhì)消失，出現(xiàn)細(xì)胞間隙，細(xì)胞松散（圖5A3），此時硬度為3.33 kg/cm2，果實開始衰老、變軟，這與前人在桃[17-19]、蘋果[20-21]、柿子[22-23]、枇杷[24]及梅果[25]等中的研究結(jié)果相似。10 mg/L CPPU處理的獼猴桃果實細(xì)胞壁區(qū)域變得模糊（圖5B1）；線粒體只剩雙層膜結(jié)構(gòu)，淀粉顆粒明顯少于對照組（圖5B1、B2）；細(xì)胞間隙擴(kuò)大（圖5B3），腐爛率和質(zhì)量損失率顯著高于對照組（P＜0.05）。20 mg/L CPPU處理的獼猴桃果實細(xì)胞壁降解程度高于10 mg/L處理組，細(xì)胞壁區(qū)域基本消失（圖5C1）；線粒體內(nèi)含物與原生質(zhì)互溶，嚴(yán)重空泡化，內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失，淀粉顆粒完全降解消失（圖5C2），細(xì)胞間的黏合力喪失，相鄰細(xì)胞出現(xiàn)分離（圖5C3）。上述結(jié)果表明，經(jīng)采前CPPU處理后，貯藏150 d的獼猴桃果實細(xì)胞壁嚴(yán)重降解，內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本消失，且CPPU處理質(zhì)量濃度越大，損傷程度越嚴(yán)重。

3 討 論

超微結(jié)構(gòu)的變化是果實發(fā)育成熟及衰老過程的重要特征，反映了果實的生理狀態(tài)。隨著果實的后熟軟化，組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)功能逐漸衰弱甚至喪失，果實的衰老與腐敗變質(zhì)加速[26]。各處理組的獼猴桃果實在不同貯藏時期的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化表明，CPPU處理加速了獼猴桃果實細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及細(xì)胞壁的降解，從而導(dǎo)致果實過早出現(xiàn)衰老、軟化。前人研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CPPU處理后的獼猴桃果實呼吸速率及乙烯釋放速率均增大[27]，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基[28]，從而使活性氧代謝失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化作用加劇[29]，膜損傷程度增大、抗氧化能力降低[30-31]，主要細(xì)胞壁降解酶多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶活力升高（另行報道），且處理質(zhì)量濃度越大，負(fù)面效應(yīng)越大[32]，這些都與果實細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化使細(xì)胞的區(qū)域作用減弱，水分、營養(yǎng)物質(zhì)等內(nèi)含物自由流出細(xì)胞，打破了果實固有的物質(zhì)代謝程序，導(dǎo)致果實質(zhì)地、風(fēng)味的喪失。同時又為一些次生物的聚合或合成創(chuàng)造了底物、酶及其接觸的條件，加速了一系列衰老的生理反應(yīng)[33]。

綜上所述，CPPU處理加快了果實在貯藏過程中細(xì)胞壁、線粒體及淀粉的降解速度，破壞了細(xì)胞器及膜系統(tǒng)的完整性，增加了果實的質(zhì)量損失率及腐爛率，降低了果實品質(zhì)及耐藏性；因此，獼猴桃生產(chǎn)中不建議使用CPPU處理。