不同包裝方式下冷鮮青蝦的菌群多樣性分析

吳海虹，孫芝蘭*，張新笑，劉 芳，徐為民

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

青蝦，又名河蝦，廣泛分布于淡水水域，是一種高蛋白、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的水產(chǎn)食品，頗受消費(fèi)者青睞。然而，其水分和蛋白質(zhì)含量較高，在捕撈、運(yùn)輸、加工及貯藏過程中極易受細(xì)菌侵襲而腐敗變質(zhì)[1-4]，不能適應(yīng)市場(chǎng)流通銷售的需要。氣調(diào)包裝技術(shù)已在生鮮食品的保鮮包裝中廣泛應(yīng)用[5-8]，勵(lì)建榮等[9]研究氣調(diào)包裝對(duì)冷藏魚糜制品品質(zhì)的影響，得出體積分?jǐn)?shù)50% CO2＋50% N2的氣調(diào)包裝比真空包裝和空氣包裝更有利于抑制魚丸中微生物的生長(zhǎng)和延長(zhǎng)魚丸的貨架期，藍(lán)蔚青等[10]認(rèn)為體積分?jǐn)?shù)80% CO2＋20% N2的氣調(diào)處理可將鯧魚樣品的冷藏貨架期延長(zhǎng)至6～12 d，且發(fā)現(xiàn)氣調(diào)包裝與低溫結(jié)合可以顯著延長(zhǎng)水產(chǎn)品的貨架期。

蝦在養(yǎng)殖、運(yùn)輸及貯藏過程中污染微生物的種類復(fù)雜，導(dǎo)致其菌落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出多樣性。曹榮[11]、李蕾蕾[12]等研究了對(duì)蝦在貯藏過程中微生物菌相的變化，發(fā)現(xiàn)貯藏初期主要以假單胞菌和氣單胞菌為主，在冷藏后期希瓦氏菌的比例大大增加；但是青蝦在貯藏過程中微生物的菌群變化尚缺乏相關(guān)研究。因此研究不同包裝方式下青蝦的菌群結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律可為合理使用不同的保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序通常選擇某個(gè)或某幾個(gè)變異區(qū)域，利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），然后基于HiSeq 2500 PE250平臺(tái)對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定，測(cè)序深度高，更有利于低豐富群落物種的鑒定和提高微生物群落研究的完整性，可成為研究微生物群落多樣性的首選[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以青蝦為對(duì)象，通過16S rDNA V4區(qū)域擴(kuò)增子測(cè)序分析，研究冷藏（4.0f0.5）℃條件下氣調(diào)包裝和空氣包裝方式對(duì)微生物菌群多樣性的影響，確定導(dǎo)致青蝦腐敗的優(yōu)勢(shì)菌，為探索延長(zhǎng)青蝦貨架期的保鮮工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蝦由溧陽市啟力潤(rùn)食品有限公司提供。

肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；通用引物（515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[15]由北京諾禾致源公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

UniCen MR臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Herolab公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；T-25數(shù)顯勻漿器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

隨機(jī)稱取20 kg的優(yōu)質(zhì)青蝦，加氧?；?，在2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后用碎冰猝死，經(jīng)冰水沖洗后瀝水備用。迅速按要求進(jìn)行包裝，每盒（150f5）g，本實(shí)驗(yàn)選取兩種包裝方式：托盤包裝（以保鮮膜封口）和氣調(diào)包裝。氣調(diào)包裝取體積分?jǐn)?shù)50% CO2，以N2作為補(bǔ)充氣體，氣體比例用氣體測(cè)定儀測(cè)定后進(jìn)行充氣包裝。隨后將樣品置于4 ℃貯藏6 d，每天分別隨機(jī)取3 盒樣品測(cè)定細(xì)菌總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量。

1.3.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

按照GB 4789.2ü2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[16]的方法進(jìn)行蝦仁樣品中菌落總數(shù)的測(cè)定。無菌環(huán)境下打開包裝盒，稱取25 g青蝦剪碎置于225 mL無菌生理鹽水中，均質(zhì)器中速檔均質(zhì)拍打1 min。取均質(zhì)液依次10 倍梯度稀釋后，取合適的3 個(gè)連續(xù)梯度，傾注營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，待凝固后于37 ℃倒置培養(yǎng)72 h。

1.3.3 TVB-N含量的測(cè)定

將青蝦絞碎攪勻，稱取約10 g加90 mL去離子水，振蕩浸漬30 min后過濾。取濾液5 mL參照GB/T 5009.228ü2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[17]測(cè)定TVB-N含量。

1.3.4 樣品總DNA的提取

取托盤包裝第2天和氣調(diào)包裝第4天的樣品，收集菌體，參照Hinton等[18]的方法提取總DNA。將青蝦剪碎放入裝有250 mL蛋白胨-生理鹽水（含1 g/L蛋白胨、8.5 g/L NaCl）的無菌均質(zhì)袋中，振蕩器中200 r/min振蕩30 min。待振蕩結(jié)束后，2 000 r/min低溫離心5 min，去除蝦殼、肌肉等成分，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，收集濾膜上的菌體于無菌離心管中，12 000 r/min離心10 min收集菌體。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取樣本的總DNA。

1.3.5 16S rDNA測(cè)序及序列分析

16S rDNA V4區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序及分析委托諾禾致源公司進(jìn)行，其步驟為：首先利用帶Barcode的特異性引物擴(kuò)增16S rDNA的V4區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，利用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

對(duì)于得到的有效數(shù)據(jù)，利用Uparse 7.0.1001軟件進(jìn)行聚類[19]，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILV的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0）[20]。使用MUSCLE 3.8.31軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[21]。最后對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，利用均一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析。其中，使用R 2.15.3軟件繪制稀釋物種多樣性曲線和主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates anyalysis，PCoA）圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同包裝方式對(duì)青蝦貯藏過程中菌落總數(shù)的影響

圖1 不同包裝方式對(duì)青蝦貯藏過程中菌落總數(shù)的影響Fig.1 Change in total viable count under different packaging treatments

細(xì)菌的數(shù)量是表示產(chǎn)品腐敗程度的重要指標(biāo)，青蝦在貯藏過程中菌落總數(shù)的變化如圖1所示。在兩種不同的包裝方式中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)均逐漸增加。樣品初始菌落總數(shù)為5.59（lg（CFU/g）），托盤包裝組的菌落總數(shù)增長(zhǎng)迅速，貯藏的第2天菌落總數(shù)已達(dá)6.27（lg（CFU/g）），而氣調(diào)包裝組菌落總數(shù)增長(zhǎng)緩慢；在貯藏的第6天菌落總數(shù)為5.99（lg（CFU/g）），與托盤包裝組第1天時(shí)接近。在整個(gè)貯藏過程中，氣調(diào)包裝組樣品的菌落總數(shù)均顯著低于托盤包裝組（P＜0.05），說明CO2氣調(diào)包裝方式能有效延長(zhǎng)青蝦的貨架期。

2.2 不同包裝方式對(duì)青蝦貯藏過程中TVB-N含量的影響

TVB-N是微生物進(jìn)入肌肉組織內(nèi)部，生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)分解而形成的產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)產(chǎn)品新鮮度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[22]。在GB 2733ü2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》中規(guī)定淡水魚蝦TVB-N含量應(yīng)不高于20 mg/100 g；因此，本實(shí)驗(yàn)中分析了青蝦貯藏過程中TVB-N含量的變化，并將TVB-N含量為20 mg/100 g時(shí)定義為青蝦的貨架期。隨后取腐敗節(jié)點(diǎn)的樣品進(jìn)行微生物多樣性分析，為后續(xù)青蝦貯藏過程中腐敗菌控制，進(jìn)一步延長(zhǎng)貨架期提供依據(jù)。

如圖2所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種不同包裝方式的青蝦TVB-N含量均逐漸增加。在托盤包裝組青蝦在貯藏的前2 d，TVB-N含量由最初的12.7 mg/100 g增長(zhǎng)至20.4 mg/100 g，而氣調(diào)包裝組青蝦在貯藏的第4天，TVB-N含量為21.3 mg/100 g。因此托盤包裝組和氣調(diào)包裝組的青蝦分別于貯藏的第2天和第4天到達(dá)腐敗節(jié)點(diǎn)，后續(xù)微生物菌群分析樣品分別取自托盤包裝的第2天和氣調(diào)包裝的第4天。

圖2 不同包裝方式對(duì)青蝦貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig.2 Changes in TVB-N content under different packaging treaments

2.3 基于16S rRNA基因測(cè)序的物種多樣性

取初始樣品、托盤包裝組和氣調(diào)包裝組進(jìn)入腐敗期的樣品，進(jìn)行16S rRNA V4區(qū)測(cè)序。3 組樣品產(chǎn)生的有效片段數(shù)量在65 219～95 052之間，平均長(zhǎng)度在250～257 bp之間，98.5%的堿基Q值大于20（即錯(cuò)誤率小于1%）。在有效的片段數(shù)量中，初始樣品、托盤包裝組和氣調(diào)包裝組的GC含量分別為50.2%、51.2%和52.0%。對(duì)樣品中有效的Tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，然后對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋，發(fā)現(xiàn)這3 組樣品中的菌群主要包含變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）10 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門。

2.4 物種相對(duì)豐度分析

選取各組在科、屬和種水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖（圖3）。由圖3可以看出，初始樣品、托盤包裝組和氣調(diào)包裝組樣品所含微生物種類和數(shù)量在科、屬和種水平均有差異。

圖3 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of microbial species under different packaging treatments during storage

由圖3 A可知，初始樣品中支原體科Mycoplasmataceae所占比例最大，為42.4%，其次為莫拉菌科Moraxellaceae，所占比例為34.6%，黃桿菌科Flavobacteriaceae占3.5%；托盤包裝組中在科水平下主要有Moraxellaceae（25.0%）、Flavobacteriaceae（18.4%）、希瓦氏菌科Shewanellaceae（12.2%）、假單胞菌科Pseudomonadaceae（5.5%）、普雷沃氏菌科Prevotellaceae（6.0%）和毛螺菌科Lachnospiraceae（3.7%）；氣調(diào)包裝組的菌群在科水平下主要有Pseudomonadaceae（26.4%）、Moraxellaceae（14.6%）、鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae（7.6%）、Lachnospiraceae（3.8%）和疣微菌科Ruminococcaceae（3.3%）。從科水平來看，與初始樣品相比，托盤包裝組第2天科水平的豐富度增加，F(xiàn)lavobacterium、Shewanellaceae、假單胞菌科等一些嗜冷菌相對(duì)豐度增加。而與托盤包裝組相比，氣調(diào)包裝組假單胞菌科逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，這可能是因?yàn)镕lavobacterium、Shewanellaceae對(duì)低氧環(huán)境耐受能力更差，而假單胞菌科有更強(qiáng)的耐受力。

從屬水平來看（圖3B），初始樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬主要為嗜冷桿菌屬Psychrobacter（33.6%）和Candidatus Bacilloplasma（42%），兩者總豐度占75.6%。與初始樣品相比，托盤包裝組Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma的相對(duì)豐度大大減小，而假單胞菌屬（Pseudomonas）（5.5%）、Acinetobacter（13.9%）、Flavobacterium（12.3%）和希瓦氏菌屬（Shewanella）（12.2%）相對(duì)豐度顯著增加，聚類在其他的菌屬由19%增加至33.7%，也說明菌種的豐富度增加。與托盤包裝組相比，氣調(diào)包裝組假單胞菌屬（26.4%）豐度顯著增加，而Flavobacterium和Shewanellaceae相對(duì)豐度顯著降低。聚類在其他的菌屬已接近50%，氣調(diào)包裝使菌種的豐富度進(jìn)一步增加。

從種水平來看（圖3C），初始樣品中優(yōu)勢(shì)菌種主要為嗜冷桿菌屬，分別為Psychrobacter arenosus（19.1%）、Psychrobacter cryohalolentis（4.3%）和Psychrobacter maritimus（1.5%）。與初始樣品相比，托盤包裝組Psychrobacter相對(duì)豐度降低，Shewanella putrefaciens（11.8%）和Flavobacterium succinicans（8.0%）相對(duì)豐度顯著增加；氣調(diào)包裝組中優(yōu)勢(shì)菌種主要為Pseudomonas veronii（26%）。說明氣調(diào)包裝抑制多數(shù)微生物的增殖，包括嗜冷菌和非嗜冷菌，但對(duì)假單胞菌的抑制效果不明顯，使其逐漸生長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌。

2.5 物種豐度聚類分析

圖4 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種豐度聚類分析圖Fig.4 Clustering analysis of microbial species abundance under different packaging treatments during storage

選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個(gè)樣品中的豐度信息，從物種和樣品兩個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖，更便于發(fā)現(xiàn)哪些物種在哪些樣品中聚集較多或含量較低。如圖4所示，圖中顏色越深表示該物種聚集越多，可以看出3 組樣品物種聚集差異較大。在初始樣品組中，Psychrobacter、Candidatus Bacilloplasma和Planctomyces聚集較多，其他物種較分散；而在貯藏過程中，無論托盤包裝還是氣調(diào)包裝，均有物種出現(xiàn)了不同程度的聚集，但集中在不同的區(qū)間。在托盤包裝組中，Aeromonas、Flavobacterium、Shewanella等聚集較多，這可能與這些菌能耐受較低的溫度有關(guān)。氣調(diào)包裝組中Pseudomonas聚集較多，說明氣調(diào)包裝能抑制貯藏期中優(yōu)勢(shì)腐敗菌如Flavobacterium和Shewanella的生長(zhǎng)，但假單胞菌屬有較強(qiáng)的耐受力，從而逐漸生長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌株。

2.6 Ternary plot分析

圖5 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種的三元相圖Fig.5 Ternary plots of microbial species under different packaging treatments during storage

為了繼續(xù)尋找初始樣品、托盤包裝組和氣調(diào)包裝組3 組樣品之間優(yōu)勢(shì)物種的差異，選取這3 組樣品在科、屬、種水平上平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖。從科水平看（圖5A），莫拉菌科Moraxellaceae在初始包裝組和托盤包裝組中有較大比例的富集，而在氣調(diào)包裝組中相對(duì)豐度較低，說明氣調(diào)包裝能抑制莫拉菌科的菌種生長(zhǎng)。支原體科（Mycoplasmataceae）在初始樣品中所占比例最大，但托盤包裝組和氣調(diào)包裝組中比例接近都非常低，說明Mycoplasmataceae不能適應(yīng)低溫環(huán)境，在低溫貯藏時(shí)將不會(huì)成為致腐的優(yōu)勢(shì)菌株。Flavobacteriaceae和Shewanellaceae在初始樣品中比例較少，在托盤包裝組中所占的比例大大增加，說明二者能耐受較低的溫度，將會(huì)成為青蝦低溫貯藏時(shí)的主要威脅菌株。而在氣調(diào)包裝組中，二者的比例又大大降低，說明氣調(diào)包裝能顯著抑制二者的生長(zhǎng)，這可能與它們的多數(shù)菌株不能耐受低氧環(huán)境有關(guān)。Pseudomonadaceae在初始樣品組和托盤包裝組中都未有較大比例的富集，但是在氣調(diào)包裝組中所占比例大大增加，說明氣調(diào)包裝不能有效控制Pseudomonadaceae菌株的生長(zhǎng)，需要配合一些其他的殺菌技術(shù)（例如高壓靜電保鮮技術(shù)[23]）才能進(jìn)一步延長(zhǎng)貨架期。

從屬水平看（圖5B），3 組樣品中的優(yōu)勢(shì)物種也差異較大，在初始樣品組中，與物種豐度分析結(jié)果一致，優(yōu)勢(shì)物種為Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma，且相對(duì)豐度最高。在托盤包裝組中，F(xiàn)lavobacterium、Shewanella和Arthrobacter為優(yōu)勢(shì)物種，但相對(duì)豐度相比初始樣品組已大大降低。在托盤包裝組中優(yōu)勢(shì)物種主要為Pseudomonas和Sphingomonas，且Pseudomonas的相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sphingomonas。另外，Acinetobacter在托盤包裝組和氣調(diào)包裝組中都有一定程度的聚集。

從種水平看（圖5C），初始樣品中優(yōu)勢(shì)菌種主要為Psychrobacter arenosus，且相對(duì)豐度較高。托盤包裝組中主要為Shewanella putrefaciens和Flavobacterium succinicans，同樣地，二者的相對(duì)豐度相對(duì)初始樣品組也大大降低。而在氣調(diào)包裝組中Pseudomonas veronii已占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他物種。

2.7 屬水平物種進(jìn)化樹

為了進(jìn)一步研究屬水平物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過多序列比對(duì)得到排名前100屬的代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系（圖6），可以看出，初始樣品組中優(yōu)勢(shì)物種Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma主要集中在兩個(gè)不同的分支。在托盤包裝組中，雖然物種種類豐富度增加，但種與種之間的親緣關(guān)系較接近，依舊主要集中在兩個(gè)不同的分支。但在氣調(diào)包裝組中，物種的豐度大大降低，豐富度卻增加，散落在各個(gè)分支中。說明氣調(diào)包裝抑制了優(yōu)勢(shì)腐敗菌的增長(zhǎng)，從而使物種的豐富度增加。

圖6 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種的屬水平物種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of microbial genera under different packaging treatments during storage

2.8 物種多樣性曲線

物種多樣性曲線可直觀反映樣品中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向上，曲線的平滑程度，反映了樣品中物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻。

圖7 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種多樣性曲線Fig.7 Rank abundance curves of microbial species under different packaging treatments during storage

由圖7可知，從物種的豐富度和均勻度來說都是初始樣品組＜托盤包裝組＜?xì)庹{(diào)包裝組，這與上述分析也較為一致，青蝦經(jīng)過一定的貯藏期后，物種豐富度增加，物種分布較初始樣品均勻，而氣調(diào)包裝能抑制原本優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)，造成物種的豐富度和均勻度進(jìn)一步增加。

2.9 基于OTU的Venn分析

圖8 不同包裝方式樣品在貯藏過程中微生物物種間共有OTU分析圖Fig.8 Shared OTU analysis of samples under different packaging treatments during storage

基于樣品總OTU數(shù)作Venn圖，進(jìn)行相似性分析（圖8）。初始樣品組與托盤包裝組共有的OTU數(shù)735 個(gè)，占二者OTU總數(shù)的42.4%。初始樣品組中特有的OTU為102 個(gè)，托盤包裝組中特有的OTU為557 個(gè)，同樣也說明托盤包裝組中菌群結(jié)構(gòu)豐富度和均勻度與初始樣品相比有所增加。氣調(diào)包裝組與托盤包裝組共有的OTU為851 個(gè)，占二者總數(shù)的35.8%，氣調(diào)包裝組中特有的OTU為744 個(gè)，說明氣調(diào)包裝組中菌群結(jié)構(gòu)的豐富度和均勻度稍高于托盤包裝組，但二者的菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

2.1 0 物種主坐標(biāo)PCoA分析

圖9 基于Weighted Unifrac距離的PCoA分析Fig.9 PCoA analysis based on the Weighted Unifrac distance

基于Weighted Unifrac距離進(jìn)行PCoA分析，由圖9可知，初始樣品組、托盤包裝組和氣調(diào)包裝組3 組樣品分別聚集在不同的象限，說明這3 組樣品微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。初始樣品組的聚集性明顯高于托盤包裝組和氣調(diào)包裝組，說明初始樣品組樣品個(gè)體之間重復(fù)性高于另外兩組，即初始樣品組樣品中所含有的微生物群落多樣性較小。而托盤包裝方式下微生物群落多樣性增加，說明原始的優(yōu)勢(shì)菌株不能耐受較低的貯藏溫度，而原本非優(yōu)勢(shì)的耐低溫菌株快速生長(zhǎng)，造成比例增大。托盤包裝優(yōu)勢(shì)菌株聚集在第四象限而氣調(diào)包裝組聚集在第三象限，說明氣調(diào)包裝能抑制優(yōu)勢(shì)腐敗菌-耐低溫菌株的生長(zhǎng)，起到較好的保鮮作用。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)托盤包裝和CO2氣調(diào)包裝方式下青蝦菌群結(jié)構(gòu)的深入分析，認(rèn)識(shí)了青蝦貯藏過程中腐敗菌群的一般結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)菌群及不同包裝方式對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的影響，為進(jìn)一步集成不同的冷鮮技術(shù)、延長(zhǎng)貨架期提供理論依據(jù)。青蝦的初始菌落總數(shù)和TVB-N含量較高，分別為5.59（lg（CFU/g））和12.7 mg/100 g，托盤包裝2 d后，TVB-N含量已達(dá)到20.4 mg/100 g，已腐敗變質(zhì)，因此通常青蝦的保鮮期比較短。采用氣調(diào)包裝后，貨架期延長(zhǎng)至4 d，但相對(duì)于冷鮮肉來說貨架期仍然較短[24]。本實(shí)驗(yàn)通過菌群結(jié)構(gòu)分析顯示，從屬水平上看出，托盤包裝方式下優(yōu)勢(shì)菌群主要以Acinetobacter、Flavobacterium和Shewanellaceae為主，因此這三者是造成青蝦腐敗的主要菌群。采用氣調(diào)包裝后，F(xiàn)lavobacterium和Shewanellaceae的豐度相對(duì)于托盤包裝大大降低，F(xiàn)lavobacterium為嚴(yán)格好氧菌[25-26]，50% CO2＋50% N2造成的無氧環(huán)境能顯著抑制二者的增殖。Shewanellaceae為兼性厭氧菌[27-28]，在氣調(diào)包裝方式下，其生長(zhǎng)繁殖受到抑制，這可能與CO2溶解于樣品汁液中，所造成的低pH值有關(guān)[29-30]。因此50% CO2＋50% N2能抑制優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)貨架期。此外，氣調(diào)包裝增加了微生物菌群的多樣性，這可能也與氣調(diào)包裝抑制了普通托盤包裝時(shí)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)有關(guān)。環(huán)境中微生物互相競(jìng)爭(zhēng)食物中的營(yíng)養(yǎng)、溶解氧等物質(zhì)，氣調(diào)包裝消除優(yōu)勢(shì)腐敗菌的競(jìng)爭(zhēng)，非優(yōu)勢(shì)菌株開始生長(zhǎng)繁殖，因而增加了菌群多樣性。在氣調(diào)包裝方式下，Pseudomonadaceae所占的比例為26.4%，成為新的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，這可能是因?yàn)镻seudomonadaceae有較強(qiáng)的耐受力。后期可研究與其他保鮮技術(shù)如高壓靜電保鮮技術(shù)[23]聯(lián)合以進(jìn)一步延長(zhǎng)青蝦的貨架期。