槐糖脂對蜜橘果實采后青霉病的控制及其機理

趙景芳，何 銀，唐 杰，龍曉琴，曾凱芳，曾凡坤,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009）

柑橘是世界第一大水果，也是我國主要的水果種植品種之一，我國柑橘栽培已有4 000多年歷史[1]。由于柑橘果實成熟期相對集中，加之我國以鮮食為主的現(xiàn)狀，采后需經(jīng)歷一定時間的貯藏和運輸期，在此期間，腐爛、生理性能下降等引起的采后損失時常發(fā)生，嚴重影響了柑橘產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益[2-3]。其中青霉病和綠霉病是柑橘最常見的兩種貯藏病害，占總發(fā)病率的70%～90%[4-5]。因此，如何降低柑橘采收以后損失、控制柑橘采后貯藏過程中的生理病害、提高產(chǎn)品價值成為亟待解決的問題。

目前，化學殺菌劑以其較好的效果成為常用的控制柑橘采后病害的防治方式之一，但對人類健康及環(huán)境造成了一定的危害，長期使用將導致微生物對其產(chǎn)生耐藥性，使其防治效果大打折扣[6]。槐糖脂最初于1954年被報道發(fā)現(xiàn)[7]，它是由Spencer從苦苣菜上分離的一株名為Torulopsis magnoliae的酵母合成的糖脂，其主要產(chǎn)生菌種為假絲酵母屬[8]，通過微生物發(fā)酵法和生物酶催化法可生產(chǎn)[9-10]?；碧侵瑸橐环N表面活性劑，具有諸多表面活性劑所擁有的優(yōu)越性能，并具備了環(huán)境友好、無毒無害和容易降解等優(yōu)點，使其在環(huán)境保護[11-12]、工業(yè)[13-14]、食品[15-16]、醫(yī)藥[17-20]及抗菌[21]等方面都具有較好的應用前景。但當前對其在果蔬采后生理病害機理的探究處于初步階段，還需要進一步的研究。

本研究以蜜桔為實驗材料，從腐爛的柑橘上分離致病病原菌，研究槐糖脂對蜜桔采后青霉的抑制作用，并對蜜桔果實采后誘導抗病性的機理進行初步的探討，以期為蜜橘果實采后青霉病的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜橘（Citrus unshiu Marc.）采自重慶市北碚區(qū)某農(nóng)戶果園。選取大小均勻、成熟度一致、無機械傷和病蟲害的果實，預冷后，放入7～10 ℃冷庫中貯藏待用。實驗時用質(zhì)量分數(shù)為2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后用自來水沖洗干凈并晾干。

槐糖脂 西安康諾化工有限公司；DNA提取試劑盒、DP305試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；B203LED生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；PowerPac電泳儀 美國Bio-Rad公司；G:BOX EF凝膠成像儀 英國Syngene公司； DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；FA2004A精密電子天平 上海精天電子儀器有限公司；XB.K.25型血球計數(shù)板 上海求精生化試劑有限公司；BCD-216YH冷凍冰箱 青島海爾股份有限公司；SYNERGYH1MG全自動酶標儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 槐糖脂PDA平板的制備

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板中，槐糖脂質(zhì)量濃度為0.025、0.050、0.075、0.100 g/L（用無菌水配制），121 ℃滅菌20 min，稍冷卻后傾倒平板備用。

1.3.2 致病菌分離與鑒定

1.3.2.1 病原菌的分離純化

選取自然發(fā)病的、具有典型青綠霉癥狀的蜜桔果實，在病健交界處取大小約為5 mmh5 mmh5 mm的小方塊，放置于經(jīng)滅菌冷卻后的PDA平板中，在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d。待長出菌絲后，挑取培養(yǎng)皿中的菌絲進行分離，待長出單菌落后進行單孢培養(yǎng)，得到純化的病原菌。

1.3.2.2 致病菌形態(tài)學鑒定

用無菌水配制濃度為1h106CFU/mL的孢子懸浮液[22]，取1 μL孢子懸浮液點在已滅菌的PDA培養(yǎng)基中，在25 ℃下進行培養(yǎng)，3 d后觀察培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)。

1.3.2.3 回接實驗

將分離純化后的病原菌置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)在培養(yǎng)好的培養(yǎng)基上刮取適量霉菌孢子，用無菌水配制成1hl04CFU/mL孢子懸浮液待用。選取大小均勻、成熟度一致、無機械傷和病蟲害的蜜桔果實，在果實赤道處對稱地打2 個孔（直徑3 mm、深3 mm），向每個孔內(nèi)加入20 μL孢子懸浮液，晾干后單果包裝，放置于25 ℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，觀察果實的發(fā)病情況。

1.3.2.4 致病菌DNA的提取、通用引物擴增rDNA-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer， ITS）全序列

DNA的提取采用DP305試劑盒。通用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司提供。上游引物為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；下游引物為ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系（25 μL）：模板0.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、2hTaq PCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 10 μL。PCR程序為：預變性94 ℃ 4 min；變性94 ℃ 1 min，退火54 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，循環(huán)數(shù)37；終延伸72 ℃ 10 min，保 溫4 ℃ 60 min。

1.3.2.5 PCR產(chǎn)物的回收純化、序列分析及結(jié)果對比

取5 μL產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠電泳檢測。初樣檢測產(chǎn)物片段大小在500 bp左右，產(chǎn)物－20 ℃保存。產(chǎn)物送由上海生工生物技術(shù)工程服務有限公司純化測序。測序結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov的數(shù)據(jù)庫中進行比對。

1.3.3 不同質(zhì)量濃度槐糖脂對青霉菌體外生長狀況的影響

取1 μL濃度為1h104CFU/mL的青霉孢子懸浮液點在配制好的不同質(zhì)量濃度的槐糖脂PDA平板中，以不含槐糖脂的PDA平板作為對照，待菌液完全吸收后，將平板密封并放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，用十字交叉法測量菌落直徑。每隔24 h測定一次菌落直徑，每個質(zhì)量濃度梯度3 個平板。

1.3.4 不同質(zhì)量濃度槐糖脂接種處理對蜜桔青霉病的控制效果

蜜桔果實隨機分成7 組，每組9 個果實，重復3 次。果實表面赤道部位用體積分數(shù)75%乙醇擦拭消毒后，用無菌打孔器在果實赤道部位等距離打2 個孔（直徑3 mm、深3 mm）。每個孔用微量移液器接種20 μL如下的處理液：1）對照為無菌水；2）實驗組分別為15、20、25、30、35、40 g/L槐糖脂溶液。4 h后，分別向每個孔中加入20 μL、1h104CFU/mL的青霉孢子懸浮液。待菌液吸收后，用聚乙烯薄膜套袋單果包裝，于25 ℃、相對濕度90%的環(huán)境中貯藏，每隔12 h統(tǒng)計果實的病斑直徑和發(fā)病率。發(fā)病率的計算見下式。

1.3.5 槐糖脂對蜜桔采后抗病性的影響

1.3.5.1 果實打孔處理

用75%乙醇擦拭果實赤道部位后，用已消毒的無菌打孔器在果實赤道部位等距離打2 個孔（直徑3 mm、深3 mm）。每個孔用微量移液器注入20 μL處理液。2 組處理液分別如下：1）對照組為無菌水；2）實驗組為35 g/L槐糖脂溶液。待處理液完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋對蜜桔果實進行單果包裝，于25 ℃、相對濕度90%的環(huán)境中貯藏，每隔24 h進行一次取樣，取樣部位為蜜桔果實打孔傷口外直徑1 cm的健康果皮部位，除去打孔傷口。每次取樣5 個蜜桔果實，實驗重復3 次。

1.3.5.2 果實浸泡處理

將果實浸泡于2 組處理液中20 min。2 組處理液分別如下：1）對照組為無菌水；2）實驗組為35 g/L槐糖脂溶液。待果實表面完全晾干后，用聚乙烯薄膜袋對蜜桔果實進行單果包裝，于25 ℃、相對濕度90%的環(huán)境中貯藏，每隔5 d進行一次取樣，取樣部位為蜜桔果實赤道部位果皮。每次取樣5 個蜜桔果實，實驗重復3 次。

1.3.5.3 果皮POD、PPO的提取及活力測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照曹建康等[23]的方法并作適當改進。3 mL的反應體系中，加入2.7 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）、0.1 mL質(zhì)量分數(shù)4%愈創(chuàng)木酚溶液、0.1 mL體積分數(shù)0.5% H2O2溶液和0.1 mL上清液。采用全自動酶標儀于470 nm波長處室溫下測定反應3 min吸光度的變化，以每分鐘吸光度變化1為一個酶活力單位（U），實驗重復3 次。POD活力單位為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參照Srivastava等[24]的方法并作適當改進。3 mL反應體系中，加入2 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）、0.9 mL 50 mmol/L鄰苯二酚和0.1 mL上清液，采用全自動酶標儀于420 nm波長處室溫下測定反應3 min吸光度的變化，以每分鐘吸光度變化1為一個酶活力單位（U），實驗重復3 次。PPO活力單位為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計。

1.3.5.4 果皮PAL的提取及活力測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）的活力測定參照Assis等[25]的方法并作適當修改。取兩支試管，一支為樣品管，一支為對照管。向兩支試管中加入3.4 mL 50 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液和0.25 mL上清液，于37 ℃下水浴平衡10 min后向反應管中加入0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液，在對照管中加入0.5 mL 50 mmol/L的硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.8），將兩支試管繼續(xù)置于37 ℃水浴下保溫60 min。保溫結(jié)束后，立即向兩支試管中加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液以終止反應。分別測定兩支試管在290 nm波長處室溫下的吸光度，以每小時每克蜜桔果皮組織酶促反應體系吸光度增加0.01為一個酶活力單位（U），實驗重復3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，計算標準差，用Origin 8.0進行制圖；并對數(shù)據(jù)進行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學鑒定

圖1 病原菌菌落形態(tài)特征Fig.1 Colony characteristics of the pathogen cultured on potato dextrose agar

從有典型青綠霉癥狀的蜜桔果實表面分離出一株病原菌，病原菌在平板上的菌落形態(tài)如圖1所示。病原菌在PDA平板上菌落生長較快，呈現(xiàn)青綠色、粉粒狀、較薄，有白色的邊緣，菌落顏色隨著培養(yǎng)時間的延長而逐步加深，有同心環(huán)。

2.2 回接實驗結(jié)果

將分離得到的病原菌回接到健康的蜜桔果實上，回接效果如圖2所示?；亟訉嶒灡砻鳎摼昴軌蛞鹈劢郾砻姘l(fā)生腐爛，果實在接種的48 h開始發(fā)病，發(fā)病初期果實變軟，接種處呈現(xiàn)青綠色圓形病斑，最后至整個果實腐爛，此癥狀與田間蜜桔青霉病癥狀一致。將該菌株在PDA上分離、純化并擴大培養(yǎng)，能夠得到與所接種菌株培養(yǎng)形狀相同的菌落。

圖2 回接病原菌蜜桔果實發(fā)?。ˋ）和自然發(fā)?。˙）癥狀Fig.2 Inoculated (A) and naturally infected (B) satsuma mandarin fruit

2.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

2.3.1 病原菌ITS序列電泳結(jié)果

圖3 菌株ITS的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products of the ITS region from the pathogen

如圖3所示，以病原菌DNA作為模板，擴增出500 bp左右的DNA片段。

2.3.2 病原菌rDNA-ITS序列測定結(jié)果

病原菌株ITS測定結(jié)果表明（圖3），該片段長590 bp。將該核苷酸序列提交到GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），通過BLAST程序?qū)Ρ确治龅玫浇Y(jié)果：該病原菌與已知的意大利青霉（Penicillium italicum，HQ850905.1）rDNA-ITS區(qū)域同源性為99%，根據(jù)該病原菌的形態(tài)學特征和分子鑒定結(jié)果，說明此病原菌為柑橘意大利青霉。

2.4 不同質(zhì)量濃度槐糖脂對青霉菌體外生長狀況的影響

由圖4可知，槐糖脂能抑制柑橘意大利青霉菌落直徑的擴展，不同質(zhì)量濃度槐糖脂實驗組菌落水平在貯藏期間均顯著低于對照組（P＜0.05）。當槐糖脂質(zhì)量濃度為0.100 g/L時，青霉菌的生長被完全抑制，說明槐糖脂對青霉菌具有較好的抑制效果。

圖4 不同質(zhì)量濃度槐糖脂對青霉菌體外生長的抑制作用Fig.4 Effect of sophorolipids treatment on mycelium growth of Penicillium italicum

2.5 不同質(zhì)量濃度槐糖脂接種處理對蜜桔青霉病的控制效果

圖5 不同質(zhì)量濃度槐糖脂對青霉發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.5 Effect of sophorolipid on disease incidence (A) and lesion diameter of satsuma mandarin fruit (B) inoculated with Penicillium italicum

由圖5A可以看出，同孔接種處理后，72 h時對照組發(fā)病率達100%，而槐糖脂處理組發(fā)病率較低，說明槐糖脂有效地延緩了蜜桔果實青霉病的發(fā)?。辉?08 h的貯藏期間，35 g/L槐糖脂實驗組發(fā)病率始終處于較低的水平。圖5B表明，同孔接種處理后，對照組蜜桔果實病斑直徑迅速擴展，貯藏84 h，所有實驗組均發(fā)病，經(jīng)對比可知，在貯藏期間，槐糖脂質(zhì)量濃度為35 g/L時對蜜桔病斑直徑的抑制效果最好，因此選用質(zhì)量濃度為35 g/L的槐糖脂對蜜桔采后青霉病的控制效果進行研究。貯藏96 h時，對照組病斑直徑為2.89 cm，與35 g/L槐糖脂實驗組（0.038 cm）相比差異顯著（P＜0.05）。

2.6 接種處理對果實果皮酶活力的變化

2.6.1 接種處理對蜜桔果皮PPO和POD活力的影響

由圖6A、B可知，在接種處理后貯藏的5 d內(nèi)，蜜桔果皮的PPO和POD活力總體呈先上升后下降的趨勢。與對照組相比，槐糖脂實驗組的PPO和POD活力明顯增高，且在接種后貯藏的第3天，槐糖脂接種實驗組POD、PPO活力分別約為對照組的2.90、1.96 倍。

圖6 接種處理對蜜桔果皮POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig.6 Effect of inoculation with Penicillium italicum on POD (A) and PPO (B) activities in satsuma mandarin peel

2.6.2 接種處理對蜜桔果皮PAL活力的影響

圖7 接種處理對蜜桔果皮PAL活力的影響Fig.7 Effect of inoculation with Penicillium italicum on PAL activity in satsuma mandarin peel

由圖7可知，在接種槐糖脂處理的5 d內(nèi)，蜜桔果皮的PAL活力整體大致呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且PAL活力顯著高于對照組。接種后貯藏的第3天，槐糖脂實驗組的PAL達到峰值，約為對照組的1.7 倍（P＜0.05）。

2.7 浸泡處理對蜜桔果皮酶活力的影響

2.7.1 浸泡處理對蜜桔果皮PPO、POD活力的影響

由圖8A、B可知，在25 d的貯藏期內(nèi)，經(jīng)槐糖脂浸泡處理后的蜜桔，其POD和PPO活力整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，且對照組的PPO活力在貯藏的25 d內(nèi)一直比實驗組低。在貯藏期內(nèi)，對照組的PPO和POD處于較低的水平。在貯藏的第10天，槐糖脂實驗組的POD、PPO活力約為對照組的1.84、2.72 倍。

圖8 浸泡處理對蜜桔果皮POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig.8 Effect of sophorolipid on POD (A) and PPO (B) activities in satsuma mandarin peel

2.7.2 浸泡處理對蜜桔果皮PAL活力的影響

圖9 浸泡處理對蜜桔果皮PAL活力的影響Fig.9 Effect of sophorolipid on PAL activity in satsuma mandarin peel

由圖9可知，在25 d的貯藏期內(nèi)，經(jīng)槐糖脂浸泡處理后的蜜桔PAL活力呈先增加后降低的趨勢，且對照組PAL活力在25 d內(nèi)一直比槐糖脂實驗組低。在貯藏的第15天，槐糖脂實驗組的PAL活力約為對照組的1.54 倍。

3 討 論

本實驗通過組織塊分離法，從有典型青綠霉病癥狀的蜜桔果實上分離到病原菌，通過回接實驗、病原菌形態(tài)學以及ITS鑒定發(fā)現(xiàn)，該病原菌的種類為柑橘意大利青霉（Penicillium italicum）。

本實驗使用槐糖脂處理，探討不同質(zhì)量濃度的槐糖脂對青霉的抑制作用。Yoo等[26]發(fā)現(xiàn)槐糖脂對疫霉菌以及腐霉菌均有抑制作用，胡靜等[27]的研究結(jié)果表明，槐糖脂對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用，且槐糖脂具有穩(wěn)定性，在酸性和高溫條件下抑制效果都不會受到影響。本實驗中，體外實驗表明槐糖脂對柑橘意大利青霉具有良好的抑制作用，且當PDA培養(yǎng)基中槐糖脂質(zhì)量濃度達到0.100 g/L時能100%抑制柑橘意大利青霉孢子的萌發(fā)；在活體實驗中，槐糖脂質(zhì)量濃度達到35 g/L時果實病斑直徑最小，與其他質(zhì)量濃度實驗組及對照組相比差異顯著（P＜0.05）。離體和活體實驗均能說明槐糖脂對柑橘意大利青霉的抑制有著較好的作用。

果實采后主要作用機制之一是誘導抗病性[28]。在果蔬采后抗病性的誘導中，相關(guān)抗性酶展現(xiàn)出了至關(guān)重要的作用。病程相關(guān)蛋白家族和酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶如PPO、POD和PAL與植物體內(nèi)抵抗病原微生物的侵染都有著一定的關(guān)系。PPO通過催化木質(zhì)素及醌類化合物形成保護性屏蔽來保護細胞免受病菌的侵害[29]，POD在木質(zhì)素生物合成時能有效催化過氧化氫的分解[30]，PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它能促進次生代謝產(chǎn)物的生成，從而提高果實的誘導抗病性[31]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，不論是物理、化學還是生物激發(fā)子，當對果蔬進行抗性誘導時，其PPO、POD和PAL三者的酶活力均能顯著提高，使果蔬的抗性增加[29]。在抗菌方面，槐糖脂對細菌和真菌都展現(xiàn)了卓越的抗菌性能。果實采收過程中會不可避免受到不同程度的機械損傷，當果實受到損傷時，其自身會產(chǎn)生生理生化反應[32]，為探究槐糖脂對蜜桔果實自身誘導抗病性和傷口愈合是否存在促進作用，本實驗對蜜桔進行接種處理。實驗發(fā)現(xiàn)，用質(zhì)量濃度為35 g/L的槐糖脂溶液對蜜桔進行接種處理后，其PPO、POD和PAL活力得到了顯著提高。在商品化應用的前提下，為探究槐糖脂對蜜桔果實的自然病害的抑制效果及抗病性是否有促進作用，本實驗還采用了浸泡處理。當用質(zhì)量濃度35 g/L的槐糖脂溶液對蜜桔進行浸泡處理時，蜜桔的PPO、POD和PAL活力也得到了顯著提高。經(jīng)對比研究發(fā)現(xiàn)，采用接種處理的蜜桔果實出現(xiàn)傷口，其PPO、POD和PAL的活力變化較快，并在貯藏的第3天達到峰值；當用質(zhì)量濃度35 g/L的槐糖脂溶液對蜜桔浸泡處理后，蜜桔的PPO、POD和PAL的活力也顯著提高，并在貯藏的第10天，PPO和POD活力達到峰值；實驗組的PAL活力在貯藏第15天達到峰值。對比兩處理組的酶活力發(fā)現(xiàn)變化趨勢大致相同，接種實驗組酶活力較浸泡實驗組高，其原因可能是當果實出現(xiàn)傷口時，果實自身生理生化代謝也得到了誘導。初步判斷提高果實誘導抗病性是槐糖脂對蜜橘果實采后青霉病的控制的作用機制之一。

綜上所述，蜜橘青霉病的病原菌為意大利青霉，槐糖脂對蜜橘青霉病有顯著控制效果，直接抑菌及誘導抗病性是其主要作用機制，為蜜橘采后青霉病的防治提供了新的方法和思路。本實驗初步研究了槐糖脂的控病效果，并對其在蜜桔采后抗病性的誘導方面進行了初步的探究。在接下來的研究中，可系統(tǒng)開展槐糖脂在果蔬采后控病方面的研究，同時也可以研究其與不同拮抗劑復合，期待得到更好的效果。