食用色素藻藍蛋白對非小細胞肺癌A549細胞體外增殖和凋亡的影響

郝?帥，閆?燕，李?爽，黃偉偉，王成濤,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京 100048；2.北京諾禾致源生物信息科技有限公司，北京 100083）

食品著色劑（食用色素）是食品添加劑的重要組成門類，據(jù)統(tǒng)計，全球對食用色素的年需求量超過80萬 t[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高以及對健康的關注，除了用于改善食品的色澤以外，功能性食用色素越來越受到人們的青睞，新型“健康友好型”功能食用色素已成為天然食品著色劑的研究熱點[2-5]。

藻藍（C-phycocyanin，C-PC）又稱藻藍色素蛋白，是一種普遍存在于藍藻、螺旋藻中的捕光色素復合體。藻藍蛋白主要由脫輔基蛋白亞基（α、β）和藻藍素輔基結合形成，以完整的六聚體結構存在于細胞內(nèi)，擔任能量的傳遞和貯存功能[6]。在GB 2760ü2014《食品安全國家標準?食品添加劑使用標準》中，藻藍已被列為我國允許使用的天然食品著色劑，可應用于糖果、口香糖、冰激凌、飲料等行業(yè)中[7]。與目前廣泛使用的醇溶性靛藍色素不同，藻藍不僅具有優(yōu)良的水溶性，而且兼有抗氧化、抗炎、抗衰老等多種生理活性功能，同時不產(chǎn)生毒副作用，是一種極具開發(fā)潛力的功能性安全食用色素[8-10]。因此，深度研究其生物活性功能是進一步開發(fā)利用藻藍的必要基礎。

藻藍的抗腫瘤活性是目前研究熱點之一。早在2003年，Pardhasaradhi等就發(fā)現(xiàn)藻藍蛋白能夠通過下調(diào)癌基因Bcl-2的表達而抑制大鼠腹腔組織細胞瘤BC-8細胞的體外增殖能力[11]；此外，有研究表明藻藍對肝癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌等多種癌癥細胞也具有不同程度的抑制作用，Roy[12]和Basha[13]等發(fā)現(xiàn)藻藍蛋白能夠抑制肝癌HepG2細胞的增殖并誘導其凋亡；Li Bing[14]、Saini[15]以及Yang Peng[16]等通過研究證實藻藍蛋白同樣能夠抑制乳腺癌、結腸癌以及宮頸癌細胞的增殖。另外Pan Ruowang[17]和Ying Jun[18]等在卵巢癌SKOV-3細胞中揭示了藻藍蛋白可能通過調(diào)控Akt和MAPK等信號通路的活性來誘導SKOV-3細胞的凋亡[16-17]。近年來關于藻藍蛋白對于肺癌特別是非小細胞肺癌的研究還并不多，Bingula[19]和Li Bing[20-21]等發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸和甜菜堿分別與藻藍蛋白復配后能夠抑制肺癌A549細胞的增殖[19-21]。肺癌是我國第一大癌癥，大約每年有近60萬肺癌病人，已然成為威脅我國人民健康的“第一殺手”[22]，其中非小細胞肺癌則是最常見的肺癌類型之一，占所有肺癌的80%左右。因此，本研究以一種典型的非小細胞肺癌A549細胞系為模型，評價藻藍蛋白對A549細胞體外增殖、凋亡以及周期分布等的影響，研究結果能夠為進一步開發(fā)天然無副作用的抗腫瘤功能食用色素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人類肺癌細胞A549，由北京市食品添加劑工程技術研究中心實驗室自主保存。藻藍蛋白樣品（質(zhì)量分數(shù)90%～95%左右）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學惠贈。

特級胎牛血清 康源生物技術有限公司；Annexin V/PI染色試劑盒、脫脂奶粉 美國BD公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）相關試劑 天根生物技術有限公司；Western blot相關單克隆抗體 美國Cell Signaling Technology公司；RIPA細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑北京鼎國昌盛生物技術有限公司；Western Blot化學發(fā)光液、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

BioSpectrum凝膠成像儀 美國UVP公司；超凈工作臺 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；漩渦振蕩器德國IKA公司；BSA224S型數(shù)字電子天平 德國Sartorius公司；CFX96 Touch qPCR檢測系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；SpectraMax i3連續(xù)波長多功能酶標儀美國MD公司；流式細胞儀FACSJAZZ 美國BD公司；恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將A549細胞株用含體積分數(shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分數(shù)1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2的相對飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，使細胞貼壁生長。

1.3.2 MTT法測定細胞的存活率

取生長狀態(tài)良好的細胞，利用血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整細胞懸液濃度，鋪板使待測細胞調(diào)密度至每孔5 000?個/100 μL，5% CO2，37 ℃孵育12 h，加入不同濃度的藻藍蛋白培養(yǎng)液（終濃度為0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 μmol/L），每個濃度做4 個復孔，分別以不同的時間梯度進行培養(yǎng)后，加入10 μL 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）溶液，繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-HCl裂解液，第二天用酶標儀于570 nm波長處測各孔吸光度（A）。根據(jù)下式計算細胞存活率（R）。

1.3.3 MTT法測定細胞生長曲線

利用血球計數(shù)板計數(shù)，以5 000 個/100 μL每孔的細胞量接入96 孔板中正常培養(yǎng)，37 ℃正常培養(yǎng)12 h后分別用0、1.2、2.4、4.8 μmol/L濃度的藻藍蛋白溶液處理細胞，同時在第一組細胞加入10 μL MTT，4 h后每孔加入100 μL SDS-HCl裂解液，第二天用酶標儀在570 nm波長處測各孔吸光度作為第0天測量值（每個測量組做4 個平行復孔）。以后每天按同一標準加入10 μL MTT，4 h后加100 μL SDS-HCl裂解液，12～16 h后測量吸光度，連續(xù)測定5 d，記錄實驗數(shù)據(jù)；統(tǒng)計細胞生長情況。以橫坐標為時間，縱坐標為吸光度，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 倒置顯微鏡下觀察藻藍蛋白對A549細胞形態(tài)的影響

取生長狀態(tài)良好的細胞，利用血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整細胞懸液濃度，以每孔20 000 個細胞的密度接種于6 孔板中，37 ℃正常培養(yǎng)12 h后加入藻藍蛋白（0、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol/L）分別處理細胞24、48 h和72 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.3.5 流式細胞儀檢測肺癌A549細胞的早期、晚期凋亡率

取生長狀態(tài)良好的細胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，加入0、1.2、2.4、4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理48 h，胰酶消化離心后，用100 μL雙染孵育液將洗干凈的細胞沉淀重懸，往重懸液中先加入5 μL AnnexinV-FITC染液，再加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，放置在冰上進行20 min避光染色。充分混勻后上機檢測細胞的凋亡情況，統(tǒng)計早期凋亡、晚期凋亡的細胞比例。

1.3.6 流式細胞儀檢測肺癌A549細胞的周期分布

取生長狀態(tài)良好的細胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，加入0、1.2、2.4、4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理48 h，胰酶消化離心后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次，并制成單細胞懸液，于體積分數(shù)70%乙醇中4 ℃固定24 h以上，1 000 r/min離心10 min得到固定后的細胞沉淀，用提前4 ℃預冷好的PBS洗滌細胞沉淀2 次，加入RNase A使其終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，37 ℃放置40 min，PI染色后用流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況。

1.3.7 qPCR檢測細胞凋亡和周期調(diào)控基因mRNA的表達

取生長狀態(tài)良好的細胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，加入0、1.2、2.4、4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理48 h，胰酶消化后用PBS洗滌2 次，離心收集細胞沉淀。利用TRIzol法提取細胞總RNA，根據(jù)提取的RNA量，用5～30 μL DEPC水進行溶解，利用NanoDrop測定RNA濃度。參照試劑盒說明進行cDNA合成。反應體系：10hFast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Prime Mix 2 μL、RNase-Free H2O 5 μL，于42 ℃反應15 min，95 ℃反應3 min。qPCR所使用的擴增引物序列如表1所示。

表1 用于qPCR分析的引物序列Table1 Primer sequences used for quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)

1.3.8 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達

取生長狀態(tài)良好的細胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，加入0、1.2、2.4、4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理48 h，胰酶消化后收集細胞沉淀，根據(jù)細胞沉淀的體積加入適量RIPA裂解液對細胞進行冰上裂解1 h，隨后12 000 r/min離心45 min，取上清液，Bradford法測定蛋白濃度。在質(zhì)量分數(shù)12%聚丙烯酰胺凝膠上分離后，將蛋白質(zhì)轉移到PVDF膜上，隨后利用質(zhì)量分數(shù)5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，以體積比1∶1 000稀釋的一抗于4 ℃條件孵育PVDF膜12～16 h。第二天用TBST清洗PVDF膜，每15 min更換一次TBST，洗5～6 次將非特異性結合的一抗洗凈，隨后將膜用抗兔或抗小鼠的二抗于37 ℃孵育1 h，接著用TBST洗膜5～6 次，每次洗15 min，將非特異性結合的二抗洗凈。最后在膜上加入發(fā)光液避光孵育5 min，利用凝膠成像儀曝光顯影，觀察結果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗重復3 次，取其平均值。采用Microsoft Excel 2010及Design Expert 7.1.3軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用Student T-test雙尾檢驗進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 藻藍蛋白對A549細胞體外生長的影響

圖1 藻藍蛋白對A549細胞體外增殖能力的影響Fig.1 Effect of C-phycocyanin on the proliferation of A549 cells

由圖1A可知，采用藻藍蛋白處理體外培養(yǎng)的A549細胞24 h或48 h，隨著處理濃度的不斷增大（0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6、19.2 μmol/L），細胞的存活率均呈現(xiàn)下降趨勢，表明細胞的存活狀態(tài)與藻藍蛋白存在濃度依賴效應；同時，在相同處理劑量下（4.8、9.6、19.2 μmol/L），細胞在48 h的存活率明顯低于24 h，說明細胞存活狀態(tài)與藻藍蛋白也存在時間依賴效應。隨后選取0、1.2、2.4、4.8 μmol/L的處理劑量進行了細胞增殖檢測，如圖1B所示，4.8 μmol/L處理組細胞的生長速率從第二天起就顯著低于對照組。以上結果表明，藻藍蛋白對體外培養(yǎng)的肺癌A549細胞具有顯著的生長抑制作用。

2.2 藻藍蛋白對肺癌A549細胞的形態(tài)影響

圖2 藻藍蛋白對A549細胞形態(tài)的影響（100×）Fig.2 Effect of C-phycocyanin on morphology of A549 cells (100 ×)

如圖2所示，未經(jīng)處理的A549細胞輪廓清晰，呈現(xiàn)梭形，細胞緊密貼壁生長，且未見明顯的懸浮細胞。隨著藻藍蛋白處理濃度的不斷增大，從2.4 μmol/L作用劑量開始，細胞的形態(tài)由梭形變得不規(guī)則，形成芽狀的突起，部分細胞呈漂浮狀不再貼壁；同時，在相同處理劑量下，細胞形態(tài)也會隨著處理時間的延長而發(fā)生非正常改變。當藻藍蛋白處理濃度達到9.6 μmol/L時，大部分細胞均已脫落，僅觀察到極少的細胞貼壁。以上結果表明，較高濃度的藻藍蛋白能夠使A549細胞形態(tài)發(fā)生非正常改變，初步提示藻藍蛋白能夠引起細胞的凋亡。

2.3 藻藍蛋白對肺癌A549細胞凋亡程度的情況

圖3 藻藍蛋白對A549細胞凋亡程度的影響Fig.3 Effect of C-phycocyanin on apoptosis of A549 cells

為了進一步證實藻藍蛋白是否引起了A549細胞的凋亡，采用流式細胞術對藻藍蛋白處理48 h后的細胞進行了Annexin V-PI雙染凋亡檢測。由圖3可知，與對照組相比，隨著藻藍蛋白處理濃度的不斷增加（0、1.2、2.4、4.8 μmol/L），A549細胞的早期凋亡與晚期凋亡比例均呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性上調(diào)，當處理濃度為4.8 μmol/L時，細胞凋亡比例最大，早期、晚期凋亡率分別達到（8.03f0.32）%和（21.95f1.21）%，表明藻藍蛋白確實誘導了A549細胞的凋亡。

圖4 藻藍蛋白影響A549細胞內(nèi)凋亡相關基因的轉錄Fig.4 Transcriptional levels of the genes related to apoptosis in A549 cells after C-phycocyanin treatment

采用熒光定量PCR對凋亡相關基因的轉錄水平進行了檢測。如圖4所示，藻藍蛋白處理后，A549細胞內(nèi)促凋亡基因Bax、Bad[23]的轉錄水平發(fā)生了顯著上調(diào)，而凋亡抑制基因Bcl-2以及Bcl-xl[24]的轉錄水平則呈現(xiàn)相反變化趨勢，這與流式細胞術的結果一致。

采用Western Blot方法對細胞內(nèi)凋亡相關蛋白的表達水平進行了檢測。如圖5所示，隨著藻藍蛋白處理濃度的不斷增加，A549細胞內(nèi)Bax、Bad蛋白水平出現(xiàn)了明顯上調(diào)，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達量出現(xiàn)顯著降低。以上結果從細胞表型、基因轉錄水平和蛋白表達水平對細胞的凋亡進行了驗證，表明藻藍蛋白確實能促進體外培養(yǎng)A549肺癌細胞的凋亡，藻藍蛋白有望作為一種極具潛力的新型抗肺癌功能性食品添加劑。

圖5 藻藍蛋白影響A549細胞內(nèi)凋亡相關蛋白的表達Fig.5 Expression levels of the proteins related to apoptosis in A549 cells after C-phycocyanin treatment

2.4 藻藍蛋白對肺癌A549細胞周期分布的影響

圖6 藻藍蛋白對A549細胞周期分布的影響Fig.6 Cell cycle distribution of A549 cells after C-phycocyanin treatment

為探究藻藍蛋白是如何引起A549細胞凋亡的，利用流式細胞儀對藻藍蛋白處理后的細胞周期分布進行了檢測。如圖6所示，與對照組相比，隨著藻藍蛋白處理濃度的不斷增加（0、1.2、2.4、4.8 μmol/L），A549細胞中G1期比例出現(xiàn)增加，S期比例下降。結果表明，藻藍蛋白能夠使細胞阻滯在G1期，無法進入S期進行DNA的復制，影響了正常的細胞周期進程，從而可能引起細胞凋亡的發(fā)生。

圖7 藻藍蛋白影響A549細胞周期相關基因的轉錄Fig.7 Transcriptional levels of the genes related to cell cycle in A549 cells after C-phycocyanin treatment

同時對細胞周期相關基因的轉錄水平進行了定量PCR檢測，結果如圖7所示。細胞周期蛋白（Cyclin）E、細胞周期依賴的蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）2以及CDK4作為細胞周期重要的調(diào)控因子[25-26]，能夠促進細胞由G1期向S期轉換，而細胞周期調(diào)控抑制因子p21、p27則對Cyclin E以及CDK2、CDK4具有抑制作用[27-28]。定量PCR結果顯示，藻藍蛋白處理后，細胞中CyclinE、Cdk2、Cdk4的轉錄水平均出現(xiàn)了顯著下調(diào)，p21、p27則出現(xiàn)了顯著上調(diào)，這些基因的異常調(diào)節(jié)可能導致細胞不能正常合成G1/S期轉換過程所需的蛋白，使細胞阻滯在G1期，這與流式細胞術結果相一致，進一步驗證了藻藍蛋白對細胞周期的調(diào)控效應。

3 討 論

總所周知，癌癥是目前嚴重威脅人類健康的疾病之一。傳統(tǒng)治療癌癥的手段主要有手術切除、放療以及化療等，但這些方法往往存在易復發(fā)、副作用大等缺陷。近年來，一些潛在的具有抗腫瘤活性的營養(yǎng)物質(zhì)越來越引起廣大研究學者的注意，它們對一些特定的癌癥有顯著的抑制效果；而藻藍蛋白則是其中重要的一類，其具有安全性高、活性強、無毒副作用等優(yōu)點，能夠為癌癥的治療提供新的思路和方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，藻藍蛋白處理體外培養(yǎng)的肺癌A549細胞后，細胞凋亡的比例顯著增加。細胞凋亡受到一系列凋亡相關蛋白的調(diào)控作用，使細胞能夠自發(fā)有序地進行程序性死亡，經(jīng)典的細胞凋亡過程主要受到Bcl-2蛋白家族調(diào)控因子的影響。Bcl-2、Bcl-xl、mcl-1等是典型的抗凋亡基因，而Bax、Bad等則是典型的促凋亡基因[29-31]。Bad等促凋亡蛋白能夠用過抑制Bcl-2、Bcl-xL的表達而加速細胞的程序性死亡進程，從而促進細胞的凋亡。本研究中，A549細胞經(jīng)藻藍蛋白處理后，Bad、Bax基因的轉錄水平和蛋白表達水平均出現(xiàn)了顯著上調(diào)，而Bcl-2、Bcl-xL的表達水平出現(xiàn)顯著降低，因此推斷，藻藍蛋白可能是通過調(diào)控經(jīng)典的Bcl-2蛋白家族信號通路而抑制非小細胞肺癌A549的凋亡。

細胞凋亡與細胞周期是密不可分的兩個過程，在細胞處于凋亡的同時，由于存活細胞數(shù)量的急劇下降，群體細胞周期的進程必定也受到影響，因此，探究藻藍蛋白處理后對A549細胞周期分布的影響也至關重要。細胞周期的正常進行依賴于Cyclin以及CDK的共同調(diào)節(jié)。CyclinE/CDK2、CDK4等是調(diào)控細胞周期G1/S轉換點的重要蛋白，其正常表達能夠使細胞順利進入S期進行DNA的復制；CyclinA等蛋白主要促進細胞由S期進入G2期；而CyclinB則主要調(diào)控細胞由分裂間期進入M期的過程；除此之外，周期抑制因子p21與p27可以作用多種CDKs，抑制G1/S的轉換以及細胞周期的進程[32-33]。前期的研究發(fā)現(xiàn)藻藍蛋白對A549細胞的體外增殖具有顯著抑制，但作用于細胞周期進程的具體時期尚不明確。定量PCR結果顯示，藻藍蛋白處理后，A549細胞的CyclinE、Cdk2、Cdk4出現(xiàn)了顯著下調(diào)，周期抑制因子p21、p27的表達出現(xiàn)顯著上調(diào)，可以推測，這些基因的異常調(diào)節(jié)可能導致細胞不能正常合成G1/S期轉換過程所需的蛋白，使細胞阻滯在了G1期，從而影響了細胞的生長。研究結果充分證實了藻藍蛋白對A549非小細胞肺癌的抑制作用，為開發(fā)新型安全的功能性食用色素提供了有力的理論支持，具有潛在的應用價值。