日齡對麻鴨脂肪沉積及相關(guān)基因表達的影響

徐思雨，鄭和洋，劉 濤，孫楊贏，曹錦軒，潘道東,2,*

（1.寧波大學 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學食品科學與營養(yǎng)系，江蘇 南京 210097）

動物肌肉的組成部分——脂肪，在肉類感官品質(zhì)和加工特性方面發(fā)揮著重要作用。脂肪的主要形式包括皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪，其中肌內(nèi)脂肪對肉的嫩度、風味、多汁性等有好的促進作用[1]。脂肪沉積受物種、性別、日齡以及沉積部位等多種因素的影響，不同品種、性別和日齡的動物在不同組織中其脂肪沉積情況存在顯著差異。而目前就日齡對肌肉組織中脂肪沉積影響的研究尚不夠深入。

日齡是影響肌內(nèi)脂肪沉積的重要因素，楊燁[2]在研究日齡與優(yōu)質(zhì)雞的脂肪沉積關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，日齡對肌內(nèi)脂肪含量（intramuscular fat content，IMF）影響顯著，且8～16 周齡優(yōu)質(zhì)雞的IMF隨著周齡的增加而顯著增加。此外，不同組織器官的脂肪沉積也隨著品種和日齡的不同而呈現(xiàn)出差異性。Simon等[3]的研究表明，家禽的脂肪最先在皮下部位發(fā)育沉積，緊接著在頸部位置，最后在胸部和腿部的皮下位置，但在腹部積累最快。除日齡外，脂肪代謝相關(guān)基因與肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)。近年來，分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展為研究脂肪沉積機制提供了極大便利，分析脂肪代謝相關(guān)基因的表達從而加深對脂肪沉積調(diào)控的認識，已成為國內(nèi)外學者研究的熱點。脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）催化是脂肪酸生物合成通路的最后一步[4]，是脂肪合成代謝的關(guān)鍵酶[5]。Semenkovich[6]的研究指出肌細胞內(nèi)FAS能有效提高使甘油三酯合成量，從而增加動物的脂肪沉積。甘油三酯脂酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）可以將甘油三酯催化水解為甘油二脂，是脂肪水解第一步的限速酶[7-8]。CIDEa蛋白可促進野生型小鼠體內(nèi)的脂肪擴張與沉積[9]，與CIDEb、CIDEc[10]共同構(gòu)成CIDE家族。敲除CIDEa基因的小鼠表現(xiàn)出更高的基礎(chǔ)代謝率，脂肪分解速度加快，大脂滴數(shù)量減少而小脂滴數(shù)量增加，體內(nèi)脂肪積累減少，體質(zhì)量減輕[11-12]。

目前，有關(guān)脂肪沉積對肉品品質(zhì)的影響大多集中于豬、牛等哺乳動物中，少見于家禽。麻鴨是鴨類中優(yōu)良的品種，具有豐富的營養(yǎng)價值，脂肪的沉積量與麻鴨的食用品質(zhì)密切相關(guān)；因此研究麻鴨脂肪沉積具有一定實際意義，基于此，本研究采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，分析不同日齡麻鴨肌肉組織中CIDEa基因、脂肪代謝相關(guān)基因的相對表達量，然后測定了麻鴨不同組織中脂肪質(zhì)量分數(shù)，最后分析了肌肉組織的保水性和剪切力變化，旨在闡述日齡對麻鴨生長發(fā)育過程中脂肪沉積的代謝機制以及理清脂肪沉積對肌肉品質(zhì)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紹興雄性麻鴨，飼養(yǎng)于寧波市鎮(zhèn)海江南家禽育種有限公司，飼養(yǎng)條件按照公司飼養(yǎng)方法執(zhí)行，飼養(yǎng)管理條件均保持一致，分別于90、180、270、360 日齡取樣，并分別標為I組、II組、III組和IV組，每組10 只。將實驗所用麻鴨在當?shù)赝涝讏霭凑談游锿涝赘＠麡藴试讱⒑?，立即采集肝臟、心臟、皮下脂肪和腹部脂肪的組織樣品，快速分裝，放入－80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實驗。同時稱量并記錄皮脂質(zhì)量、腹脂質(zhì)量、屠體質(zhì)量。

三氯甲烷、甲醇、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純。TRIzol試劑、RNA marker、DNA marker、PrimeScript RT reagent kit試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII 試劑盒日本Takara公司；瓊脂糖 法國Biowest公司；半定量PCR試劑盒 北京全式金公司；GelRed核酸凝膠染料美國Biotium公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H-2050R型高速冷凍離心機 湘儀離心機有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 深圳市三利化學品有限公司；C-LMB型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司；M200全波長酶標儀 瑞士Tecan公司；實時熒光定量PCR儀 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪質(zhì)量分數(shù)的測定

參照Folch等[13]的方法提取脂質(zhì)，測定麻鴨胸肌的IMF。樣品于4 ℃解凍后，剔除結(jié)締組織和可見脂肪，稱2 g胸肌，剪碎，低速勻漿后用氯仿-甲醇（體積比2∶1）定容至120 mL，靜置1 h，過濾后加入0.2 倍體積的生理鹽水（7.3 g/L NaCl、0.5 g/L CaCl2），然后3 000 r/min離心15 min，吸取下層液體用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器44 ℃水浴真空蒸干，稱量脂肪質(zhì)量。皮脂率（percentage of subcutaneous fat，SFP）和腹脂率（percentage of abdominal fat，AFP）分別按式（1）和（2）計算。

1.3.2 pH值的測定

參照高海燕等[14]的方法稍作修改，取新鮮麻鴨胸肌2 g，剪碎放入小燒杯中，立即加入18 mL蒸餾水，勻漿之后過濾，最后用pH計測定濾液的pH值，用前先校準。

1.3.3 蒸煮損失的測定

取新鮮麻鴨胸肌肉樣品，修成4 cmh3 cmh1 cm[15]，稱質(zhì)量（m1/g），放入在蒸煮袋中密封，然后80 ℃水浴至肉樣中心溫度達至75 ℃，保持20 min。取出蒸煮袋，用吸水紙吸干肉樣表面水分，冷卻至室溫后再次稱質(zhì)量，記錄質(zhì)量（m2/g）。蒸煮損失按式（3）計算。每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.4 剪切力的測定

剪切力的測定參照Marino等[16]的方法，并稍作修改。取麻鴨胸肌新鮮肉樣，去掉脂肪、筋鍵、肌膜后，沿肌纖維方向修成2 cmh1 cmh1 cm的肉柱，然后放入蒸煮袋中密封，80 ℃水浴鍋內(nèi)加熱至肉中心溫度75 ℃，取出樣品冷卻至室溫，用嫩度儀測定每個肉柱的剪切力（kggf），每個樣品重復(fù)5 次。1.3.5 相關(guān)基因表達量的測定

根據(jù)IMF測定的結(jié)果，選出IMF差異顯著的兩個日齡組180 日齡和360 日齡，每個日齡組挑選體質(zhì)量位于同日齡組平均水平的麻鴨各5 只作為研究對象，放血屠宰后，迅速取其胸肌、肝臟和心肌，剔除組織表面明顯的脂肪和結(jié)締組織后置于液氮中速凍，再放入－80 ℃冰箱保存。

按順序依次進行組織總RNA的抽提、定量、設(shè)計引物（表1）、總RNA的反轉(zhuǎn)錄（反應(yīng)條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、∞；合成的cDNA產(chǎn)物放于－20 ℃保存?zhèn)溆茫?、PCR（PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min）以及實時熒光定量PCR實驗（反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸45 s，共40 個循環(huán)，并采集熒光信號，檢測各個基因的擴增變化情況，記錄Ct值）。

表1 相關(guān)基因熒光定量PCR引物序列Table1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用SAS 8.0 factorial ANOVA的Duncan’s Multiple RangeTest模型進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同日齡紹興麻鴨體內(nèi)脂肪的沉積及分布

表2 不同日齡紹興麻鴨體內(nèi)脂肪沉積的分布（n＝5）Table2 Lipid distribution and deposition in Shaoxing sheldrake ducks of different ages (n= 5)

飼養(yǎng)日齡對麻鴨胸肌IMF、SFP和AFP的影響如表2所示。隨著飼養(yǎng)日齡的增長，胸肌IMF、SFP和AFP均有不同程度的增長，其中紹興麻鴨胸肌IMF顯著增加（P＜0.05），SFP在180 日齡后顯著增加（P＜0.05），360 日齡的麻鴨的SFP達到最大值。

2.2 不同日齡紹興麻鴨脂肪質(zhì)量分數(shù)的組織特異性

表3 不同日齡紹興麻鴨的不同組織的脂肪質(zhì)量分數(shù)Table3 Fat contents in different tissues from Shaoxing sheldrake ducks of different ages%

如表3所示，隨著飼養(yǎng)日齡的增長，紹興麻鴨不同組織中的脂肪質(zhì)量分數(shù)均增加。其中肝臟組織中的脂肪質(zhì)量分數(shù)在分析的所有日齡中都顯著高于胸肌中的脂肪質(zhì)量分數(shù)，而在90、180 日齡顯著高于表皮的脂肪質(zhì)量分數(shù)。在360 日齡時，表皮中脂肪質(zhì)量分數(shù)達到最大值，均顯著高于其他兩個組織。

2.3 日齡對紹興麻鴨IMF及肉品理化指標的影響

表4 日齡對紹興麻鴨IMF及肉品理化指標的影響Table4 Effect of age on intramuscular fat content and meat quality of Shaoxing sheldrake duck

如表4所示，隨著飼養(yǎng)日齡的增加，IMF顯著增加（P＜0.05）。肌肉的pH值和剪切力顯著增加（P＜0.05），蒸煮損失率顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果顯示，日齡與IMF呈正相關(guān)，IMF越低，pH值和剪切力越低，而蒸煮損失率越大。

2.4 麻鴨脂肪沉積相關(guān)基因CIDEa、FAS和ATGL的表達量

圖1 CIDEa基因在180、360 日齡紹興麻鴨的不同組織中的相對表達量Fig.1 Relative expression levels of CIDEa gene in different tissues of sheldrake ducks at the age of 180 and 360 days

CIDEa基因在180 日齡和360 日齡麻鴨的胸肌、肝臟和心肌組織中的表達變化如圖1所示。在180 日齡麻鴨的3 個組織中，CIDEa基因在肝臟中的相對表達量最高，在胸肌中相對表達量最低。在360 日齡的3 個組織中，在心肌中表達量最高，在胸肌中最低。而在同一組織中，CIDEa基因在不同日齡中mRNA表達量均差異顯著（P＜0.05），且360 日齡CIDEa基因表達量顯著高于180 日齡。這表明日齡對CIDEa基因的表達具有顯著影響。

圖2 FAS基因在180、360 日齡紹興麻鴨的不同組織中的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of FAS gene in different tissues of sheldrake ducks at the age of 180 and 360 days

FAS基因在180 日齡和360 日齡麻鴨的胸肌、肝臟和心肌組織中的表達量如圖2所示。在180 日齡麻鴨的胸肌、肝臟和心肌組織中，肝臟FAS基因的相對表達量顯著高于胸肌和心肌（P＜0.05）。360 日齡麻鴨在胸肌、肝臟和心肌組織中的FAS基因相對表達量差異顯著（P＜0.05），且在肝臟中表達量最高，在胸肌中最低。同一組織中FAS基因表達量與日齡的關(guān)系如下：在心肌和肝臟中，F(xiàn)AS基因表達量隨日齡增加顯著升高（P＜0.05）；在胸肌中，F(xiàn)AS基因表達量隨著日齡的增加而顯著降低（P＜0.05）。

圖3 ATGL基因在180、360 日齡紹興麻鴨的不同組織中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of ATGL gene in different tissues of sheldrake ducks at the age of 180 and 360 days

如圖3所示，同一日齡下，在麻鴨的胸肌、肝臟和心肌組織中，ATGL基因的相對表達量差異顯著（P＜0.05）。180 日齡時，胸肌中ATGL基因的相對表達量顯著高于肝臟和心?。?60 日齡麻鴨的ATGL基因的相對表達量則在心肌中最高。同一組織中ATGL基因相對表達量與日齡的關(guān)系如下：在心肌和胸肌中，ATGL基因表達量隨日齡增加升高，其中心肌中的表達量升高最快（P＜0.05）；在肝臟中日齡對ATGL基因表達量沒有顯著影響。基因表達量的結(jié)果暗示360 日齡心肌中脂肪分解活動顯著高于180 日齡。

3 討 論

本實驗研究了紹興麻鴨的日齡對其體內(nèi)脂肪沉積的影響以及IMF對肉質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，麻鴨的3 個組織中的肪含量差異顯著，在分析的所有日齡中，肝臟中的脂肪質(zhì)量分數(shù)始終高于胸肌，在前期高于表皮，360 日齡時則低于表皮。而日齡對IMF、SFP、APF有顯著影響。在4 個日齡中，90 日齡麻鴨胸肌的IMF、SFP、APF都最低，而360 日齡麻鴨胸肌的IMF、SFP、APF顯著高于其他3 個日齡。脂肪質(zhì)量分數(shù)都是隨著日齡增長而變大。這可能是因為麻鴨處在不同生長發(fā)育階段脂肪代謝存在差異引起的[17]。隨著飼養(yǎng)日齡增加，麻鴨日漸成熟，肝臟發(fā)育完全，脂肪合成能力增強，同時其體內(nèi)新陳代謝速率逐漸變緩，因此麻鴨體內(nèi)脂肪沉積的量會逐漸增大。IMF是評價肉質(zhì)的諸多指標中關(guān)鍵的一個指標，與肌肉pH值、蒸煮損失率、滴水損失及剪切力密切相關(guān)[18]。Chartrin等[19]研究表明，鴨胸IMF從1.7%增加到8.5%時，L*值、b*值、蒸煮損失率、嫩度都有所增加。嫩度和保水性是評價肉質(zhì)的重要指標，通常用剪切力和蒸煮損失率分別表示肉的嫩度和保水性。本實驗結(jié)果顯示：飼養(yǎng)日齡對這些指標有顯著影響，IMF隨日齡增加而增加，隨著IMF的升高，肌肉的pH值和剪切力均呈現(xiàn)升高的趨勢，蒸煮損失則降低。

Li等[20]報道，CIDEa基因在豬體內(nèi)11 個組織中普遍表達，且表達量存在較大差異：CIDEa基因在腎臟和淋巴組織中有中等水平表達量，而在肝臟、脾臟、心臟、肺、大腦、小腸、胃、肌肉中的表達量很低。在野生型小鼠體內(nèi)，CIDEa基因高表達于褐色脂肪組織中，少量表達于白色脂肪組織中[21-22]。在人類組織中，CIDEa基因大量存在于褐色和白色脂肪組織中[9]。黃柳梅[23]報道CIDEa基因在肉雞的20 個組織中廣泛表達，且表達豐度相差較大，在脂肪組織中的表達量最高，其次是在腎臟、肝臟和卵巢有中等水平的表達量，在心臟、脾臟、肺、胸肌、腿肌等中的表達量很微弱。這些報道都說明了CIDEa基因在不同物種中的組織表達模式存在差異，且具有組織特異性，而本實驗結(jié)果表明CIDEa基因在同一日齡麻鴨的不同組織中，表達具有明顯的組織特異性，且在脂滴含量豐富的組織中表達量較高，這與以上報道相一致。但與前面的研究相比，CIDEa基因在360 日齡的心肌中表達出現(xiàn)了很大的差異，這可能是本實驗研究的物種（麻鴨）和日齡不同的緣故所致。同時，黃柳梅[23]還報道了在不同部位的脂肪組織中，隨著肉雞日齡的增大，CIDEa基因的相對表達量也隨之增大。這與本實驗的結(jié)果相符。CIDEa蛋白定位于脂滴表面及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[24-25]和細胞核內(nèi)[26]，可促進野生型小鼠體內(nèi)的脂肪擴張與沉積[9]，調(diào)節(jié)褐色脂肪組織中的解偶聯(lián)蛋白Ucp1的活性，在CIDEa基因敲除小鼠中，CIDEa抑制Ucp1的作用缺失，從而導致Ucp1的解偶聯(lián)活性顯著升高，最終導致能量代謝水平的顯著提高，從而調(diào)節(jié)脂肪代謝[21]。在CIDEa基因敲除小鼠中，AMPK蛋白水平及酶活性升高，促進脂肪酸的β氧化[24]。在敲除了CIDEa基因后，小鼠表現(xiàn)出更高的基礎(chǔ)代謝率，能量代謝速度加快，脂肪分解速度加快，大脂滴減少而小脂滴增加，體內(nèi)脂肪積累減少，體質(zhì)量減輕，表現(xiàn)為瘦的表型[12,21]。上述報道都說明CIDEa基因?qū)χ镜某练e有積極作用。而本實驗的結(jié)果也證明了CIDEa對脂肪的沉積有積極作用。

動物體內(nèi)脂肪沉積需要大量的脂肪酸，而這些脂肪酸大多是丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A在FAS的催化作用下合成的[27]。FAS表達水平的升高能夠顯著地增加甘油三脂在體內(nèi)的沉積而導致肥胖[6]。魯凱[28]的研究發(fā)現(xiàn)FAS基因在北京鴨與黑鶩鴨的肝臟中的相對表達量在同一周齡下表現(xiàn)出差異，但是都是16 周齡高于8 周齡的表達量。這表明FAS基因的表達不僅與物種相關(guān)，還隨飼養(yǎng)日齡的變化而有所改變。而呂剛[29]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，不管是限飼還是自由覓食，F(xiàn)AS基因相對表達量在肉鴨肝臟中都隨日齡的增加而增加。對哺乳動物的研究表明，F(xiàn)AS活力或基因表達與動物體脂沉積關(guān)系密切[30-31]。肝臟中酶蛋白含量受該酶基因表達的調(diào)控，肝臟中FAS基因的表達狀況一定程度上反映了FAS含量的多寡，從而影響肝臟合成脂肪酸的能力的大小。本實驗研究了心臟、肝臟、胸肌中FAS基因的相對表達量，發(fā)現(xiàn)FAS基因表達具有明顯的組織特異性，在心肌和肝臟中，F(xiàn)AS基因表達量隨日齡增加而顯著升高（P＜0.05），這與上述報道相符。但在胸肌中，F(xiàn)AS基因的表達量則隨日齡升高顯著降低（P＜0.05）。

Nie Qinghua等[32]在研究ATGL基因在鸚鵡、鵪鶉、鴨這3 種禽鳥組織中的表達時發(fā)現(xiàn)，ATGL基因主要在鸚鵡、鵪鶉的胸肌和腿肌表達；在鴨的腹部脂肪、皮下脂肪中有最高表達量，在心臟、脾臟、胸肌和腿肌中也有較高的表達量。Zimmermann等[8]研究顯示ATGL基因在在小鼠脂肪組織中表達量最高，在骨骼肌、心肌和睪丸中次之，在腎臟、肺、脾臟、腦和肝臟等組織中也有低水平的表達；王寶維等[33]研究發(fā)現(xiàn)ATGL基因在鵝的脾臟、肝臟、腹部脂肪、皮下脂肪中表達量較高，其次在腿肌、胸肌、腎臟和心臟中有少量表達，在肺、腺胃和肌胃中幾乎不表達。以上研究可看出在正常生理條件下，ATGL基因廣泛在動物的各組織器官中表達，并且物種和組織對其表達量都有影響。本實驗研究的ATGL基因在3 個組織中的表達量也都差異顯著，與上述報道相符。在胸肌和心肌中，ATGL表達量均隨日齡增加而升高。本實驗中無論是180 日齡還是360 日齡，ATGL基因在肝臟中的表達量均顯著低于胸肌和心臟（P＜0.05），對于這一異常現(xiàn)象，除了物種和日齡的原因，其他原因還有待進一步探究。

動物脂肪沉積是機體內(nèi)脂肪合成與分解的共同結(jié)果。CIDEa基因?qū)χ境练e有積極作用，F(xiàn)AS基因和ATGL基因分別調(diào)控脂肪的合成與分解。本實驗中麻鴨肝臟組織和胸肌中，CIDEa基因表達量隨著日齡增加顯著升高，F(xiàn)AS基因與ATGL基因表達量在不同組織中隨日齡變化趨勢不一致。最終結(jié)果顯示脂肪質(zhì)量分數(shù)隨日齡增加而升高。這說明隨著日齡增加，麻鴨體內(nèi)脂肪合成代謝比脂肪分解代謝更加活躍。

4 結(jié) 論

本實驗測定了麻鴨脂肪質(zhì)量分數(shù)和肉質(zhì)理化指標，探討了CIDEa、FAS和ATGL基因的表達量與麻鴨脂肪沉積的關(guān)系。結(jié)果顯示：日齡對麻鴨脂肪質(zhì)量分數(shù)的影響顯著，隨著日齡增加，IMF、肌肉的pH值和剪切力均呈現(xiàn)升高的趨勢，蒸煮損失率則降低；CIDEa、FAS和ATGL基因的表達均具有組織特異性，但在不同組織中隨日齡變化的趨勢不一致。脂肪代謝是一個復(fù)雜的動態(tài)平衡過程，脂肪沉積是其綜合作用的結(jié)果，最終結(jié)果顯示脂肪質(zhì)量分數(shù)隨日齡增加而升高。這說明隨著日齡增加，麻鴨體內(nèi)脂肪合成代謝比脂肪分解代謝更加活躍。