酵母抽提物在熱反應(yīng)中鮮味的變化及肽的鑒定

阿衣古麗g阿力木，宋煥祿*，劉 野，鄒婷婷，張 雨，張松培

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

酵母抽提物（yeast extract，YE）既是強(qiáng)鮮味劑，又是風(fēng)味增強(qiáng)劑。因此，在各類食品及食品原料的生產(chǎn)加工過(guò)程中添加YE后，應(yīng)適當(dāng)減少及調(diào)整原配方中其他食品添加劑（如肌苷酸（inosine acid，IMP）＋鳥(niǎo)苷酸（guanine nucleotide，GMP）、味精、水解植物蛋白液和水解動(dòng)物蛋白）的用量。這些滋味活性物質(zhì)賦予食品鮮味、苦味、甜味、酸味等基本味及近期發(fā)現(xiàn)的濃厚味。在起初的滋味研究中，因?yàn)闆](méi)有找到鮮味的味覺(jué)受體，因此鮮味并沒(méi)有被算作是基本味。2000年Chaudhari[1]和Nelson[2]等找到了鮮味的受體——谷氨酸（Glu）的G蛋白偶聯(lián)受體（例如mGluR4和異源性T1R1＋3受體），這一發(fā)現(xiàn)具有里程碑式的作用。一般推測(cè)鮮味的代表物質(zhì)是L-Glu和其他一些L型氨基酸，這些鮮味氨基酸反映了食品中另一個(gè)不可或缺的營(yíng)養(yǎng)素——蛋白質(zhì)的含量[3]。在YE中氨基酸、核苷酸、硫胺素、還原糖以及多肽類化合物也是滋味化合物，這些化合物在加熱過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)。熱反應(yīng)產(chǎn)物中有大量的滋味活性物質(zhì)。其中Festring等利用反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）-串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）法測(cè)定YE中的4 種核苷酸，發(fā)現(xiàn)IMP、GMP對(duì)鮮味具有提升作用[4]。肽及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物因具有獨(dú)特的滋味活性而被關(guān)注。

鮮味是最近被人們認(rèn)可的一種基本味，隨著對(duì)鮮味肽的深入探究，有學(xué)者對(duì)含有Glu殘基的12 種二肽，如Glu-Asp、Glu-Ser、Glu-Thr和Glu-Glu等進(jìn)行感官研究，發(fā)現(xiàn)在C-端疏水性較小的氨基酸的二肽具有肉湯鮮味。有研究報(bào)道，一些鮮味肽本身的鮮味可能不明顯，但與谷氨酸單鈉鹽、GMP、IMP、食鹽等共同存在時(shí)可以促進(jìn)其產(chǎn)生鮮味或使鮮味變得更加強(qiáng)烈，稱為鮮味增強(qiáng)肽[5-6]。Maehashi等[7]從雞胸肉提取出6 種對(duì)鮮味提升具有明顯效果的鮮味提升肽，其中Glu-Glu、Glu-Val兩種肽本身也具有鮮味。Han Fuliang等[8]在黃酒中發(fā)現(xiàn)了一種三肽，僅由Glu組成且具有鮮味。Su Guowan等[9]從花生中提取到一種鮮味增強(qiáng)肽和一種鮮味肽。

Hofmann等運(yùn)用凝膠滲透色譜、HPLC-MS/MS技術(shù)結(jié)合感官評(píng)價(jià)手段，對(duì)成熟期為44 周的Gouda干酪中的水溶性物質(zhì)進(jìn)行了研究[10]。Toelstede等應(yīng)用感官組學(xué)對(duì)Gouda干酪的風(fēng)味進(jìn)行了深入研究，他們運(yùn)用凝膠滲透色譜、超濾技術(shù)、RP-HPLC、HPLC-MS/MS、HPLC-飛行時(shí)間（time of fl ight，TOF）-MS/MS對(duì)干酪中水溶性提取物中的苦味成分進(jìn)行了鑒定，其中16 種苦味肽被鑒定出來(lái)，12 個(gè)肽具有較強(qiáng)的苦味[11]。Schlichtherle-Cerny等采用多種蛋白酶復(fù)合酶酶解小麥面筋蛋白，得到了去氨基的小麥面筋水解物，然后用凝膠滲透色譜、RP-HPLC、HPLC-MS/MS結(jié)合滋味分析對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果表明pGlu-Pro-Ser、pGlu-Pro、pGlu-Pro-Glu、pGlu-Pro-Gln具有滋味活性，是水解液中的滋味活性化合物[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，熱反應(yīng)后大分子肽降解生成小分子肽，分子質(zhì)量小于1 000 Da的組分含量顯著下降，降解成小分子肽段和游離氨基酸[13]。

本實(shí)驗(yàn)使用不同溫度熱處理后的YE，測(cè)定具鮮味的氨基酸和核苷酸的濃度變化趨勢(shì)；然后結(jié)合電子舌數(shù)據(jù)分析出鮮味最強(qiáng)的樣品及溫度對(duì)樣品鮮味的影響；將鮮味最強(qiáng)的樣品進(jìn)一步采用超濾、凝膠過(guò)濾、RP-HPLC等技術(shù)分離純化出具有鮮味的肽段，利用超高效液相色譜-四極桿-TOF-MS/MS（ultraperformance liquid chromatography-quadrupole-TOF-MS/MS，UPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)目標(biāo)肽分子進(jìn)行打碎，結(jié)合肽鏈的斷裂規(guī)律，人工解析出目標(biāo)肽的氨基酸序列。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、9-氟甲基氯甲酸甲酯的乙腈溶液（9-f l uorenylmethylchloroformate in acetonitrile，F(xiàn)OMC）試劑、含鄰苯二甲醛和3-巰基丙酸的硼酸緩沖液（O-phthalaldehyde and 3-mercaptopropionic acid in borate buffer，OPA）試劑、硼酸鹽試劑 美國(guó)安捷倫科技有限公司；其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國(guó)賽默飛世爾公司；酵母膏安琪酵母股份有限公司；超純水由分子感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型HPLC、1290型UPLC、Q-TOF-MS/MS美國(guó)安捷倫科技公司；?KTA快速純化系統(tǒng) 美國(guó)通用電氣公司；Asrree II/LS16型電子舌 法國(guó)Alpha MOS公司；LB-32型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾公司；切向流超濾系統(tǒng) 美國(guó)密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 YE的制備

設(shè)置不同的熱反應(yīng)溫度（100、110、120、130、140 ℃），取0.1 g酵母膏加入1 mL超純水中，錫箔紙密封，置于高壓反應(yīng)釜中反應(yīng)1 h后，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，放置于4 ℃冰箱中待測(cè)。以未經(jīng)處理的YE為對(duì)照組（CK）。

1.3.2 YE中氨基酸含量的檢測(cè)

結(jié)合HPLC技術(shù)，采用錢(qián)敏等[14]的方法檢測(cè)鮮味氨基酸，采用柱前衍生法對(duì)樣品中的4 種游離氨基酸（天冬氨酸（Asp）、Glu、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala））進(jìn)行定量分析。將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（1 nmol/μL）用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，配制成不同濃度（0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 nmol/μL）的混合標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。

HPLC條件：色譜柱：Zorbax Eclipse-AAA（150 mmh4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水相A為0.04 mol/L NaH2PO4溶液（pH 7.8），有機(jī)相B為甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）；梯度洗脫程序：0 min，0%流動(dòng)相B；1.9 min，0%流動(dòng)相B；18.1 min，37%流動(dòng)相B；23.2 min，37%流動(dòng)相B；24 min，100%流動(dòng)相B；26 min，100%流動(dòng)相B；27 min，0%流動(dòng)相B；30 min，0%流動(dòng)相B。流速：1 mL/min；進(jìn)樣方式：程序進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm；柱溫：40 ℃。

自動(dòng)進(jìn)樣程序：從瓶1（硼酸）中抽取2.5 μL，從樣品瓶中抽取0.5 μL，將3.0 μL溶液以最大速率混合2 次，等待0.5 min；在瓶2（超純水）中清洗進(jìn)樣針；從瓶3（OPA）中抽取0.5 μL，將3.5 μL以最大速率混合6 次；在瓶2（超純水）中清洗進(jìn)樣針；從瓶4（FOMC）抽取0.5 μL，將4.0 μL以最大速率混合6 次；從瓶5（超純水）中抽取18 μL，將32 μL以最大速率混合2 次；進(jìn)樣。

1.3.3 YE中核苷酸的檢測(cè)

5’-核苷酸鈉鹽是重要的滋味活性物質(zhì)，采用HPLC技術(shù)檢測(cè)YE中5’-核苷酸鈉鹽含量，測(cè)定方法為：取3 mL樣品，超聲5 min，過(guò)0.22 μm濾膜，置于4 ℃冰箱備用。色譜柱柱溫控制為20 ℃，流動(dòng)相為0.20 mol/L KH2PO4溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.8，進(jìn)樣量1 μL，流速1 mL/min。通過(guò)5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量[15]。

分別稱取5’-腺苷酸（adenine nucleotide，AMP）、5’-IMP、5’-腺苷酸（cytosine nucleotide，CMP）和5’-GMP 4 種核苷酸各8 mg，定容到10 mL，依次稀釋6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度（800、400、200、100、40、8 mg/L），做4 種核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。

1.3.4 YE中肽分布的測(cè)定

為了確定YE在加熱過(guò)程中的肽分布變化情況，采用HPLC法，使用質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的桿菌肽（Mr＝1 422.69 Da）、FFEFVT（Phe-Phe-Glu-Phe-Val-Thr）多肽（Mr＝789.88 Da）、Glu-Ser-Glu-Cys-Gly（Mr＝448.45 Da）、谷胱甘肽（Mr＝307 Da）、Gly（Mr＝75.07 Da）做分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作圖得到分子校正曲線及其方程。取3 g YE溶于1 mL超純水中，經(jīng)過(guò)一定溫度熱處理，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，并取1 mL于液相小瓶中備用。流動(dòng)相采用體積分?jǐn)?shù)20%乙腈-水溶液，用甲酸調(diào)節(jié)pH值為3.0。流速為0.5 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.5 YE的滋味分析

采用Asrree型電子舌系統(tǒng)（主要由傳感器陣列、自動(dòng)進(jìn)樣器、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)以及電子舌配套的數(shù)據(jù)分析軟件組成）。傳感器陣列由7 個(gè)具有化學(xué)選擇性區(qū)域效應(yīng)的味覺(jué)傳感器和1 個(gè)Ag/AgCl參比電極組成。這7 個(gè)傳感器對(duì)酸、甜、苦、咸、鮮5 種基本味覺(jué)呈味物質(zhì)都有響應(yīng)。將處理好的樣品放置在設(shè)定好的位置上，通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器使傳感器和電極都與樣品接觸，根據(jù)傳感器接觸樣品的電勢(shì)（V）與參比電極（Ag/AgCl）的電勢(shì)（V0）的差值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和模式識(shí)別[17-18]。本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)酸味、鮮味和咸味的強(qiáng)度。

1.3.6 YE中鮮味肽的分離純化

選取鮮味最強(qiáng)的樣品進(jìn)行冷凍干燥，然后取40 g樣品溶于200 mL超純水。分別用截流分子質(zhì)量不低于5 000 Da、3 000～1 000 Da和不超過(guò)1 000 Da的超濾膜包截流樣品溶液，重復(fù)多次進(jìn)行。分別合并多級(jí)截留液和透出液，冷凍干燥，用電子舌測(cè)定樣品鮮味的強(qiáng)度，置于－20 ℃?zhèn)溆肹19]。

經(jīng)過(guò)超濾后得到不同分子質(zhì)量的樣品粗組分，取鮮味最強(qiáng)的組分0.1 g溶于3 mL超純水中備用。使用蛋白純化儀對(duì)不同粗組分進(jìn)一步的分離純化[20-21]，凝膠色譜柱用超純水先經(jīng)過(guò)預(yù)平衡和活化，接著用體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液調(diào)整pH值為4，用超純水再次平衡凝膠柱。儀器洗脫條件為：流動(dòng)相為超純水，用體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液調(diào)整pH值為4.0；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，流速：0.6 mL/min；分次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量為500 μL，合并相同組分，冷凍干燥后溶解并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

將經(jīng)過(guò)凝膠分離后的滋味活性組分溶解，采用XDB-C18柱進(jìn)一步分離鮮味肽段組分[22]，以甲醇和水為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，流速5 mL/min，進(jìn)樣量1 000 μL，根據(jù)色譜峰收集相關(guān)組分，冷凍干燥后溶解并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.7 UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定肽序列結(jié)構(gòu)

取一定量經(jīng)過(guò)RP-HPLC分離的滋味活性組分采用超純水溶解，使用Eclipse Plus C18色譜柱，以含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的甲醇溶液作為流動(dòng)相A，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相B，設(shè)置流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，柱溫調(diào)整為30 ℃。MS條件為：正離子模式；毛細(xì)管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V；霧化壓力：241 kPa；干燥器溫度：300 ℃；流量：5 L/min；載氣（N2）溫度：150 ℃；流量：1 L/min；流速：0.2 mL/min；碰撞能：20 eV；離子掃描范圍：m/z 50～1 000[23]。通過(guò)肽鍵兩端斷裂的碎片鑒定鮮味肽段的序列[24]。

1.3.8 感官評(píng)價(jià)

味道是人們?cè)u(píng)估食物可口性的重要指標(biāo)，是由舌頭的味蕾細(xì)胞呈現(xiàn)出的化學(xué)反應(yīng)?；疚队X(jué)分為酸、甜、苦、鮮、咸5 種。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，組織實(shí)驗(yàn)室感官評(píng)價(jià)小組（男性4 名、女性6 名）；感官評(píng)價(jià)員評(píng)價(jià)前用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行培訓(xùn)：蘸取適量甜味（35 mmol/L蔗糖溶液）、酸味（1.5 mmol/L酒石酸溶液）、咸味（40 mmol/L NaCl溶液）、鮮味（10 mmol/L谷氨酸單鈉鹽溶液）、苦味（15 mmol/L奎寧溶液）以及5 種溶液的混合液進(jìn)行品嘗訓(xùn)練。制備好樣品后，組織感官評(píng)價(jià)小組對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，對(duì)成品液進(jìn)行打分（10 分制：0～2 分，很弱；3～4 分，弱；5～6 分，中等；7～8 分，強(qiáng)；9～10 分，很強(qiáng)）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析（單因素方差分析），P＜0.05表示差異顯著；使用Origin 8.0軟件作圖。電子舌數(shù)據(jù)采用主成分分析法進(jìn)行分析[25]，根據(jù)所得數(shù)據(jù)建模，相近的數(shù)據(jù)歸為一類或一組[26]。每個(gè)樣品進(jìn)行5 次測(cè)試，驗(yàn)證滋味的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 YE經(jīng)不同溫度熱處理后鮮味氨基酸含量的變化

游離氨基酸中，Glu、Ala、Gly及Asp呈鮮味[27]。氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程如表1所示。

表1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程Table1 Linear regression equation for amino acids

圖1 YE經(jīng)不同溫度處理后鮮味氨基酸含量的變化Fig.1 Changes in umami amino acids in YE at different temperatures

由圖1可以看出，隨著加熱溫度的升高，YE中的鮮味氨基酸含量有所變化。Glu、Asp、Gly和Ala的含量先下降，在加熱溫度達(dá)到120 ℃后開(kāi)始上升，由于加熱過(guò)程中前驅(qū)物肽的分布也有所變化，因此可能是肽降解變成氨基酸，影響了氨基酸含量的變化。

2.2 YE經(jīng)不同溫度熱處理后核苷酸含量的變化

YE中核苷酸主要包括4 種，以核苷酸二鈉鹽的形式存在，包括5’-AMP、5’-IMP、5’-CMP和5’-GMP，其中5’-IMP、5’-GMP是重要的滋味活性物質(zhì)[28]。核苷酸類也會(huì)參與熱反應(yīng)，例如肉中的核苷酸（如肌苷單磷酸鹽）加熱后產(chǎn)生5-磷酸核糖，經(jīng)過(guò)脫磷酸、脫水形成5-甲基-4-羥基-呋喃酮。羥甲基呋喃酮類化合物很容易與硫化氫反應(yīng)，產(chǎn)生噻吩類化合物和呋喃類化合物，并產(chǎn)生非常強(qiáng)烈的氣味[29]。

圖2 YE經(jīng)不同溫度處理后核苷酸含量的變化Fig.2 Changes in nucleotides in YE at different temperatures

如圖2所示，樣品在100～140 ℃加熱過(guò)程中，4 種核苷酸的平均含量均呈快速下降的趨勢(shì)，5’-IMP初始含量為0.733 g/kg，當(dāng)溫度升高到140 ℃時(shí)下降到0.155 g/kg；5’-GMP從初始含量0.745 g/kg降低到0.17 g/kg。

2.3 YE經(jīng)不同溫度熱處理后肽分布的變化

圖3 YE經(jīng)不同溫度處理后肽分布的變化Fig.3 Changes in peptide components in YE at different temperatures

從圖3可以看出，隨著加熱溫度的升高，分子質(zhì)量大于1 000 Da以及500～1 000 Da的組分含量逐漸降低，而300～500 Da以及小于300 Da的組分含量逐漸升高，說(shuō)明在加熱過(guò)程中大分子肽類逐漸降解成小分子肽類，且大部分為單個(gè)氨基酸或小于五肽的組分，這些化合物作為前驅(qū)物又可參與到熱反應(yīng)過(guò)程中，形成香氣活性化合物。

2.4 YE經(jīng)不同溫度熱處理后滋味的變化

圖4 YE經(jīng)不同溫度處理后滋味的變化Fig.4 Taste prof i les of YE at different temperatures

如圖4A所示，所有的樣品都有強(qiáng)烈的酸味，CK組有較強(qiáng)的鮮味，隨著處理溫度的升高，YE的鮮味明顯下降。隨著溫度的升高，小肽繼續(xù)參與反應(yīng)，分子質(zhì)量大的肽降解為分子質(zhì)量較小的肽，形成新的肽段。當(dāng)溫度達(dá)到110 ℃時(shí)鮮味最強(qiáng)，而在140 ℃時(shí)鮮味較低。對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析，圖4B顯示不同樣品的電子舌傳感器信號(hào)得分圖。PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為93.94%、6.05%。CS組能被PC1與其他樣品清楚的區(qū)分。PC2使100、110 ℃和120 ℃處理組的樣品明顯在不同位置，130 ℃和140 ℃處理組的樣品分布在圖片的中部。電子舌能夠識(shí)別樣品中滋味特征的差異，120、130 ℃和140 ℃處理的3 個(gè)樣品有相似的滋味，而其他3 個(gè)樣品具有3 種不同的滋味。

2.5 YE經(jīng)不同溫度熱處理后鮮味肽的分離純化結(jié)果

圖5 超濾截留組分的鮮味評(píng)價(jià)Fig.5 Evaluation of umami intensity of ultraf i ltration fractions

根據(jù)電子舌分析的結(jié)果，本研究只利用鮮味最強(qiáng)的110 ℃處理組。從圖5中可看出，經(jīng)過(guò)超濾得到的不同分子質(zhì)量的肽鮮味不同，隨著分子質(zhì)量的減小鮮味增加，不超過(guò)1 000 Da組分的鮮味最強(qiáng)。因此使用不超過(guò)1 000 Da組分進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖6 110 ℃處理YE后凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.6 Gel fi ltration chromatogram of YE after treatment at 110 ℃

如圖6所示，根據(jù)峰形將樣品分為5 組，其中GEL-2峰豐度最高。將凝膠過(guò)濾組分大量分離制備后冷凍干燥，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)（表2）。其中GEL-2、GEL-3都具有鮮味，得分分別為7.35±0.82和1.32±0.61，選擇GEL-2組分進(jìn)行下一步分離純化實(shí)驗(yàn)。

GEL-2組分經(jīng)RP-HPLC分離純化得到4 個(gè)峰（圖7）。如表3所示，F(xiàn)1、F3、F4組分具有鮮味，得分分別為7.90±0.36、9.03±0.62、5.83±0.25。收集具有鮮味的肽段進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表2 凝膠過(guò)濾各組分滋味的感官評(píng)價(jià)Table2 Taste prof i les of fractions obtained by gel permeation chromatography

圖 7 GEL-3組分的RP-HPLC圖Fig.7 RP-HPLC chromatogram of fraction GEL-3

表3 RP-HPLC各組分的滋味分析Table3 Taste pro fi les of RP-HPLC subfractions

2.6 YE經(jīng)不同溫度熱處理后鮮味肽的鑒定結(jié)果

表4 YE肽RP-HPLC組分中肽序列結(jié)構(gòu)的鑒定及二級(jí)離子碎片歸屬Table4 Fragment ions and proposed peptide sequences of selected peptides in RP-HPLC subfractions

研究表明，在多肽的碰撞誘導(dǎo)解離過(guò)程中，肽鏈一般在化學(xué)能較低的肽鍵處斷裂。由n 個(gè)氨基酸脫水縮合而成的多肽，在由N端開(kāi)始的第m個(gè)氨基酸與第（m＋1）個(gè)氨基酸之間發(fā)生了斷裂，根據(jù)斷裂位點(diǎn)與肽鍵的關(guān)系，會(huì)產(chǎn)生a-x、b-y和c-z型3 種斷裂方式，其中，肽鏈N端的子離子碎片連續(xù)命名為am、bm、cm離子，C端的子離子碎片連續(xù)命名為xm、ym、zm離子。在Q-TOF-MS/MS中，b-y型斷裂為常見(jiàn)的方式；此外，am-NH3、ym-H2O等也是常見(jiàn)的子離子碎片類型[30]。

將收集得到的RP-HPLC組分依次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測(cè)，利用其對(duì)目標(biāo)肽分子進(jìn)行打碎，結(jié)合肽鏈的斷裂規(guī)律，人工解析出4 條具有鮮味的肽段（表4）。典型的MS/MS圖如圖8所示。在110 ℃處理的樣品中鑒定出的鮮味肽段為Gln-Leu、Pro-Glu-Thr、Ala-Pro-Ala和His-Val。

圖 8 110 ℃處理后鮮味肽段的UPLC-Q-TOF-MS/MS圖Fig.8 UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis of umami peptides in YE after treatment at 110 ℃

3 結(jié) 論

YE是一種天然新型調(diào)味品，作為復(fù)配料被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，在加工食品的調(diào)味料中具有廣闊的應(yīng)用前景。在熱處理過(guò)程中，YE中的滋味物質(zhì)含量和小分子滋味肽結(jié)構(gòu)上有所變化，所產(chǎn)生的呈味化合物也有所不同。然而，對(duì)于熱處理對(duì)其滋味的影響研究甚少。本研究在不受其他因素干擾的條件下，以單一的熱處理溫度為因素，分析具有鮮味的化合物的變化規(guī)律并鑒定鮮味肽段，找到最適溫度以達(dá)到其鮮味增強(qiáng)的效果。結(jié)果表明，溫度對(duì)熱反應(yīng)的影響很大，熱處理溫度為110 ℃時(shí)鮮味最強(qiáng)。本研究結(jié)果為酵母提取物在加工食品中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了良好的理論依據(jù)。本研究只選擇溫度作為影響因素，因此需要進(jìn)一步研究底物濃度、pH值和反應(yīng)時(shí)間的影響，找到最佳的熱反應(yīng)條件以提高YE的鮮味。