晚期肺腺癌胸苷酸合成酶和亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與培美曲塞化療的臨床效果

白麗艷 韓軍 王冬梅 祁玉娟

1青海省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（西寧810007）；2青海大學(xué)（西寧810016）

肺癌位列全球發(fā)病率和死亡率的首位［1］，預(yù)計(jì)美國(guó)在2018年將有15 萬(wàn)人死于肺癌［2］。非小細(xì)胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）占肺癌患者的75%，腺癌占非小細(xì)胞肺癌患者的60%，肺癌預(yù)后較差，對(duì)于早期行根治性手術(shù)患者其5年生存率仍低于60%［3］。故晚期NSCLC 治療的主要方式是多學(xué)科治療為主的綜合治療［4］。培美曲塞是一種新型的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物，作為多靶點(diǎn)抗葉酸制劑，參與嘧啶及嘌呤合成［5］，在NSCLC和惡性胸膜間皮瘤［4］的治療中具有較好療效。培美曲塞聯(lián)合鉑類為晚期肺腺癌一線治療首選［6］。胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）和亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是培美曲塞的葉酸代謝的關(guān)鍵酶，本研究目的為探討晚期肺腺癌TS、MTHFR 基因多態(tài)性與培美曲塞+鉑類的療效相關(guān)性研究。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年9月至2017年5月的晚期肺腺癌58 例，男28 例，女30 例，中位年齡為55 歲（表1）。入組標(biāo)準(zhǔn)：所有入組病人病理診斷及分期檢查明確的晚期肺腺癌，EGFR 及ALK 均無(wú)突變；年齡≥18 歲，ECOG 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為評(píng)分0 ～1分，化療前肝腎功能及心電圖均正常，化療前向患方簽署化療知情同意書(shū)及入組知情同意告知書(shū)。58 例按要求完成隨訪。其中25 例患者外周血標(biāo)本提取DNA，按要求完成隨訪。

1.2 研究方法 全組患者一線化療應(yīng)用培美曲塞+鉑類（順鉑、卡鉑）方案（培美曲塞500 mg∕m2，d1，順鉑75 mg∕m2或卡鉑AUC 5，d2），1 個(gè)周期為21 d，化療前用維生素B12 及葉酸、地塞米松預(yù)處理。根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST 1.1）進(jìn)行療效評(píng)價(jià)：（1）所有目標(biāo)病灶均消失且持續(xù)4 周為完全緩解（complete response，CR）；（2）目標(biāo)病灶腫瘤的最大徑減少≥30%，持續(xù)時(shí)間＞4 周為部分緩解（partial response，PR）；（3）縮小未達(dá)到PR 或增加未達(dá)到PD（progressive disease，PD）為病灶穩(wěn)定（stable disease，SD）；（4）基線病灶最大徑之和增大≥20%或有新發(fā)病灶為疾病進(jìn)展。CR+PR+SD=DCR。PFS 以開(kāi)始用藥時(shí)間作為起點(diǎn)，疾病進(jìn)展和∕或隨訪結(jié)束作為終點(diǎn)。每化療2個(gè)周期行療效評(píng)價(jià)，4 ～6 個(gè)周期化療后療效評(píng)價(jià)為SD 或PR 者繼續(xù)以培美曲塞單藥維持化療，期間若病情進(jìn)展臨床表現(xiàn)需要提前進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

1.3 TS、MTHFR 基因多態(tài)性的檢測(cè)

1.3.1 主要試劑 DNA 是用QIAamp DNA 試劑盒提取外周血細(xì)胞（Qiagen 公司，德國(guó)，批號(hào)：10402606），基因多態(tài)性通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合凝膠電泳的方法及測(cè)序。引物是上海捷瑞生物工程有限公司合成，測(cè)序是上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成的。

1.3.2 方法 采集3 mL 血液樣本提取白細(xì)胞層，根據(jù)DNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取基因組DNA 凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 TS、MTHFR 基因型分析多態(tài)性通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析 反應(yīng)條件如下：TS 基因多態(tài)性25 μL 的反應(yīng)體系，預(yù)變性94 ℃3 min，變性94 ℃30 s，退火60 ℃1 min，72 ℃延伸至30 s，40 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。MTHFR 基因多態(tài)性25 μL 的反應(yīng)體系，預(yù)變性為95 ℃15 min，變性94 ℃30 s，退火60 ℃30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。TS 基因型用3%的瓊脂糖凝膠電泳約30 min，進(jìn)行凝膠圖像分析（圖1），經(jīng)PCR 法分析TS 基因多態(tài)性（圖2），經(jīng)基因測(cè)序分析MTHFR 基因多態(tài)性（圖3）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用軟件SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。χ2檢驗(yàn)比較率值，采用Kaplan-Meier 法計(jì)算生存曲線，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TS、MTHFR 基因型分布 TS 基因多態(tài)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為雙串聯(lián)重復(fù)系列純合子基因型2R∕2R 基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小215 bp，另一個(gè)產(chǎn)物片段大小245 bp 三串聯(lián)重復(fù)系列純合子基因型3R∕3R，雜合子2R∕3R產(chǎn)物片段大小分別為215、245 bp（圖2）。MTHFR 基因多態(tài)性見(jiàn)測(cè)序結(jié)果（圖3）。

圖1 PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification

圖2 TS 基因多態(tài)性檢測(cè)Fig.2 TS gene polymorphism

圖3 MTHFR（rs1801133）（C∕T）基因測(cè)序結(jié)果Fig.3 MTHFR（rs1801133）（C∕T）gene sequencing results

2.2 TS、MTHFR 基因型與化療療效的關(guān)系

2.2.1 TS 基因型與化療療效的關(guān)系 全組患者58 例均至少完成2 個(gè)周期以上化療，疾病控制率（DCR）38%，中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）8.1 個(gè)月。TS 基因2R∕2R 型理論頻數(shù)小將其與性質(zhì)相似2R∕3R 基因型合并并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，3R∕3R、2R∕2R+2R∕3R 基因型化療的DCR 率分別為53.8%、91.7%，結(jié)果提示不同基因型與化療療效間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

2.2.2 MTHFR 基因型與臨床化療療效的關(guān)系MTHFR 基因分布的結(jié)果T∕T 基因型的理論頻數(shù)小將其與性質(zhì)相近的基因型C∕T 基因型合并；C∕C、C∕T + T∕T 基因型DCR 率依次為70%、73.3%，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

2.3 TS、MTHFR 基因型與PFS 的關(guān)系

2.3.1 TS 基因型與PFS 的關(guān)系 將25 例患者進(jìn)行TS 基因多態(tài)性分析，3R∕3R 型PFS 為9.3 個(gè)月，2R∕3R+ 2R∕2R 型PFS 為10.4 個(gè)月（P＞0.05），結(jié)果提示TS 基因與PFS 未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性；MTHFR 基因C∕C 基因型PFS 為10 個(gè)月；C∕T + T∕T 基因型其中位PFS 為9.7 個(gè)月（10 個(gè)月vs.9.7 個(gè)月），MTHFR 基因與PFS 未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，其生存曲線見(jiàn)圖4。

表1 晚期肺腺癌患者臨床特征（n=58）Tab.1 Clinical features with advanced lung adenocarcinoma例（%）

表2 晚期肺腺癌患者TS、MTHFR 基因多態(tài)性與化療療效相關(guān)性Tab.2 Correlation of TS and MTHFR genotypes with the response rates to chemotherapy in patients with advanced lung adenocarcinoma例（%）

3 討論

培美曲塞是一種抗葉酸代謝的藥物，批準(zhǔn)用于晚期肺腺癌一線和二線化療藥物；作用于葉酸代謝途徑的多個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)抑制多種DNA 合成酶包括TS、二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）從而抑制葉酸的代謝［7］。TS 在細(xì)胞中是胸苷唯一來(lái)源，其主要作用為細(xì)胞生長(zhǎng)和DNA 復(fù)制。TS 在多種腫瘤組織中均有代謝活性，研究表明TS 為葉酸抑制劑包括培美曲塞等多種化療藥主要靶點(diǎn)［8］。MANDOLA 等［9］研究了不同種族的單核苷酸多態(tài)性的分布，亞洲人群攜帶2R∕2R 基因型和2R∕3R 及3R∕3R 基因型分別為2%、34%和64%，此基因多態(tài)性結(jié)果與本研究類似。

波蘭KRAWCZYK 等［10］研究一線培美曲塞+鉑類化療晚期的非鱗NSCLC 患者，TS 基因多態(tài)性攜帶3R∕3R 的患者比攜帶2R∕2R 和2R∕3R 的PFS縮短，TS 基因多態(tài)性可能是NSCLC 一線培美曲塞聯(lián)合鉑類化療預(yù)測(cè)因子之一，該研究結(jié)果與本研究的結(jié)果是一致的。吳毓優(yōu)等［11］研究TS rs34743033 及rs34489327 與培美曲塞治療海南黎族肺腺癌患者療效與預(yù)后的相關(guān)性。TS 基因5′端非編碼區(qū)rs34743033 多態(tài)性位點(diǎn)3R∕3R、2R∕3R、2R∕2R 基因型在肺腺癌患者所占的比例分別為67. 3% 、17.3%和15.4%。TS 基因多態(tài)性可能與培美曲賽治療海南黎族肺腺癌的療效和預(yù)后無(wú)關(guān)。

ARéVALO 等［12］研究TS 基因多態(tài)性3R∕3R 基因型患者未達(dá)到中位OS，而2R∕3R 基因型患者中位PS 為70 個(gè)月；3R∕4R 和2R∕2R 基因型中位OS 分別為15 和13 個(gè)月（P＝0.019）。HIDETAKA URAMOTO 等［13］研究非鱗狀非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的TS、DHFR 和GARFT 表達(dá)與培美曲塞治療的關(guān)系，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR 和免疫組織化學(xué)（IHC）染色分析原發(fā)性腫瘤TS∕DHFR mRNA 和蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)TS、DHFR、GARFT mRNA 的表達(dá)水平與NSCLC 的臨床反應(yīng)之間無(wú)顯著相關(guān)性。

LI 等［14］分析了TS 基因啟動(dòng)子增強(qiáng)子區(qū)域的遺傳多態(tài)性。“低表達(dá)”基因多態(tài)性（2R ∕2R，2R ∕3C 或3C∕3C）中位PFS 較“高表達(dá)”基因多態(tài)性（2R∕3G，3C∕3G 或3G∕3G）PFS 延長(zhǎng)（6.8 個(gè)月vs.3.8 個(gè)月，P＝0.036）。但沒(méi)有觀察到OS 的差異（10.3 個(gè)月vs. 10.1 個(gè)月，P＝0.638）。最近，NICOLSON等［15］已經(jīng)證實(shí)了TS 表達(dá)水平和培美曲塞療效之間的相關(guān)性。這項(xiàng)單臂2 期臨床試驗(yàn)晚期非鱗NSCLC 患者接受誘導(dǎo)培美曲塞聯(lián)合順鉑化療，隨后在非進(jìn)展期予培美曲塞維持治療。低表達(dá)組中位PFS為7.1個(gè)月，高表達(dá)組為2.6個(gè)月（P＝0.001 5）。P值分別為0.09 和0.05。本研究顯示，TS 基因多態(tài)性以3R∕3R 型為主；2R∕2R+2R∕3R 型DCR 高于3R∕3R 型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但培美曲塞聯(lián)合鉑類化療PFS 分別為9.3 和10.4 個(gè)月（P＞0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MTHFR 是葉酸代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶［16］，MTHFR 在肺癌領(lǐng)域的相關(guān)研究較少，LAN 等［17］研究MTHFR 基因C677T 多態(tài)性非鱗非小細(xì)胞肺癌患者41.2%攜帶C∕C 型。C∕T 雜合子51 例非小細(xì)胞肺癌患者中，21 例（41.2%）攜帶C∕C。攜帶T∕T 野生型20 例（39.2%），攜帶C∕T 雜合子，基因型占19.6%；MTHFR 基因C677T 多態(tài)性與培美曲塞化療療效差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。趙蘊(yùn)偉等［18］研究晚期肺腺癌患者M(jìn)THFR 基因C677T 野生型（C∕C）的分布為61.4%，純合突變型（T∕T）為13.6%，雜合突變型（C∕T）為25. 0%。C∕C 型患者的TTP 顯著長(zhǎng)于T∕T 型患者和C∕T 型患者。野生型（C∕C）NSCLC 患者可能是使用培美曲塞聯(lián)合順鉑化療的有效人群。

本研究顯示，MTHFR 基因多態(tài)性C∕C 型、C∕T型、T∕T 型分別為40%、52%和8%；MTHFR 基因多態(tài)性與培美曲塞聯(lián)合鉑類治療晚期肺腺癌DCR、PFS 未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)研究基本吻合，與國(guó)外研究存在差異。這也體現(xiàn)出惡性腫瘤是多基因的疾病，腫瘤分期不同治療選擇亦不同，多種因素均影響著腫瘤發(fā)生、發(fā)展、療效及預(yù)后，臨床工作需權(quán)衡利弊，有效治療。