高效液相色譜法測定人血漿中阿托伐他汀的濃度

封永莉，歐亞青，邊 原，張麗娟，陳 岷，陳 璐，童榮生

(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072)

阿托伐他汀為臨床廣泛使用的降脂藥，口服吸收快，在肝細(xì)胞中代謝，通過抑制羥甲基戊二酰輔酶 A還原酶(HMG-CoA)而發(fā)揮藥理作用，可以減少內(nèi)源性膽固醇在肝臟的合成，從而降低總膽固醇及外周血中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，同時(shí)阿托伐他汀還具有穩(wěn)定斑塊的作用。臨床上，阿托伐他汀主要用于治療高膽固醇血癥、冠心病、外周動(dòng)脈粥樣硬化疾病[1]。有文獻(xiàn)顯示阿托伐他汀的代謝過程易受細(xì)胞色素P450(CYP)3 A4和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP)C和P-糖蛋白的影響，加之首過效應(yīng)明顯，臨床實(shí)際應(yīng)用療效差異較大，可見不良反應(yīng)[2]。臨床上使用阿托伐他汀發(fā)生的不良反應(yīng)以胃腸消化系統(tǒng)和骨骼肌肉系統(tǒng)受損為主，如惡心、肝酶的升高、橫紋肌溶解等[3]，針對患者可能存在的高危風(fēng)險(xiǎn)因素(如肝損、高齡、體型瘦小、甲狀腺功能減退、合并使用具有相互作用藥物等情況)，有必要通過監(jiān)測阿托伐他汀血藥濃度，結(jié)合藥動(dòng)藥效學(xué)理論，以建立適當(dāng)?shù)膭┝糠桨福瑴p少不良反應(yīng)并維持降脂效果[4]。故本實(shí)驗(yàn)建立一種簡便快捷的高效液相色譜法(HPLC)測定人血漿中阿托伐他汀的濃度，以用于下一步阿托伐他汀特殊人群藥代動(dòng)力學(xué)研究，對給出臨床個(gè)體化用藥方案具有重要意義。

1 材料

1.1儀器Waters 2690高效液相色譜儀(美國Waters 公司)、BP211D電子天平(德國Sartori μs公司)、優(yōu)普UPR-II-5 T超純水器(成都超純科技有限公司)、高速離心機(jī)320R(德國Hettich公司)。

1.2試劑阿托伐他汀(Solarbio公司，批號(hào)：308A021，含量≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品)、醋酸銨(科密歐公司，含量≥98.0%)、冰醋酸(諾爾施，含量99.5%)、乙腈(Fisher公司，含量99.97%)、甲醇(Dikma公司，含量99.9%)，使用溶劑均為色譜級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用Aglient Eclipse HPLC色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相條件：乙腈：0.02 mol/L醋酸銨緩沖溶液(冰醋酸調(diào)至pH=5.2)=40：60；柱溫：30 ℃，流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長：245 nm。

2.2溶液配制精密稱取阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇∶水(90∶10)的溶劑定容于10 ml的容量瓶，即得1.445 mg/ml阿托伐他汀貯備液。從貯備液中取1 ml，用上述溶劑定容于10 ml的容量瓶，即得144.5 μg/ml的阿托伐他汀工作液，放入4 ℃冰箱保存。

2.3樣品處理取阿托伐他汀工作液20 μl，加入200 μl血漿，渦旋1 min后加入乙腈400 μl，渦旋3 min，14000 r/min離心7 min，取上清液進(jìn)樣。

2.4方法的專一性考察阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液后，取空白血漿和含阿托伐他汀的血漿樣品及某病人血漿，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣檢測記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。阿托伐他汀出峰時(shí)間為7.5 min，此時(shí)檢測專一性好，與生物內(nèi)源性物質(zhì)分離，無雜質(zhì)干擾，且色譜峰型對稱。

圖1 阿托伐他汀色譜圖 a：阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液；b：空白血漿；c：阿托伐他汀的血漿；d：某病人血漿

2.5線性關(guān)系考察取阿托伐他汀144.5 μg/ml工作液20 μl，用甲醇∶水(90∶10)的溶劑依次等比例稀釋后，取適量加入血漿樣本200 μl，得系列濃度為14.45、8.76、5.20、3.13、1.87、1.12、0.67、0.41 μg/ml的血漿樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后。以阿托伐他汀的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸直線(采用加權(quán)最小二乘法)，得到回歸直線方程為Y=1.54×104X-5130(R2=0.9993)，表明阿托伐他汀在0.41～14.45 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限為0.41 μg/ml。

2.6準(zhǔn)確度與精密度取適量阿托伐他汀工作液，加入適量空白血漿得到0.64、3.03、12.89 μg/ml低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿質(zhì)控樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，每日每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣6 份，連續(xù)測定3 d，用當(dāng)日制得隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各濃度值，考察準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果如表1，阿托伐他汀血漿質(zhì)控樣品日內(nèi)和日間的RSD 均小于10% (n=6)。

表1 精密度與準(zhǔn)確度(n = 6)

2.7提取回收率

2.7.1相對提取回收率 將配制好的0.64、3.03、12.89 μg/ml低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣6 份，測定得峰面積A；另取空白血漿200 μl，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，加入適量阿托伐他汀工作液，制成質(zhì)量濃度為0.64、3.03、12.89 μg/ml的低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿樣品，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣6 份，測定得峰面積B；用A/B的值表示相對提取回收率。結(jié)果可見表2，符合中國藥典生物樣品分析方法的要求。

2.7.2絕對提取回收率 另取阿托伐他汀工作液，加入流動(dòng)相(乙腈：0.02 mol/L 醋酸銨緩沖溶液(冰醋酸調(diào)pH=5.2)=40：60)溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.64、3.03、12.89 μg/ml的低、中、高濃度的阿托伐他汀溶液，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣6 份，測定得峰面積C；用A/C的值表示絕對提取回收率，見表2。符合中國藥典生物樣品分析方法的要求。

表2 提取回收率(n = 6)

2.8殘留效應(yīng)在高濃度質(zhì)控樣品進(jìn)樣后，再以空白血漿進(jìn)樣，考察殘留效應(yīng)。結(jié)果顯示，空白血漿中無阿托伐他汀響應(yīng)出現(xiàn)。

2.9穩(wěn)定性考察阿托伐他汀工作液在1、2、3、5、7 d的穩(wěn)定性，考察含有低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿樣品在室溫放置4 h、4 ℃冰箱保存1、2、3、5、7 d 及反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性，每時(shí)按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣6 份，測定其濃度用以評價(jià)該方法的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，上述條件下的RSD 均小于10%，符合生物樣品分析方法要求。

3 討論

阿托伐他汀具親脂性，易溶于甲醇、乙醇，極微溶于水，故本實(shí)驗(yàn)選用甲醇∶水(90∶10)的比例溶液作為溶劑，阿托伐他汀在該溶液保存下溶解性及穩(wěn)定性均良好。由于阿托伐他汀含有開環(huán)羥基酸結(jié)構(gòu)，故顯弱酸性，其對pH敏感，有文獻(xiàn)顯示他汀類藥物及其代謝產(chǎn)物易發(fā)生內(nèi)脂結(jié)構(gòu)和開環(huán)結(jié)構(gòu)的互變現(xiàn)象，pH>6時(shí)促進(jìn)離子形式下的互變現(xiàn)象，相反，pH降低時(shí)促進(jìn)非離子形式下的互變現(xiàn)象[5]，所以液相條件摸索的關(guān)鍵在于確定流動(dòng)相的pH值，大多文獻(xiàn)采用流動(dòng)相pH在4～5.5范圍內(nèi)，并多用到甲酸銨、醋酸銨溶液[6～9]。還有文獻(xiàn)指出阿托伐他汀甲醇中的穩(wěn)定性比乙腈低[10]。為了尋找合適的流動(dòng)相比例及pH值，該實(shí)驗(yàn)在摸索過程中擴(kuò)大比較了pH在3.5～7.5范圍內(nèi)的水相條件，以及乙腈比例在35%～60%范圍內(nèi)阿托伐他汀的保留時(shí)間及峰型，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH值增高和/或乙腈比例提高都能夠顯著地減少保留時(shí)間，最終本實(shí)驗(yàn)采用Aglient 的中等長度色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，在流動(dòng)相比例為乙腈：0.02 mol/L 醋酸銨緩沖溶液(冰醋酸調(diào)pH=5.2)= 40∶60條件下進(jìn)行，用冰醋酸調(diào)低pH值是為了有效抑制阿托伐他汀的解離，使其更多以分子形式存在，這將有助于阿托伐他汀與內(nèi)源性物質(zhì)區(qū)分并且峰對稱性好，無拖尾，基線無干擾，保留時(shí)間為7.5 min，也利于臨床快速開展監(jiān)測。該實(shí)驗(yàn)使用的高效液相色譜法連接的是紫外檢測器，通過觀察阿托伐他汀在保留時(shí)間范圍內(nèi)的全波長掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)檢測波長為245 nm時(shí)阿托伐他汀響應(yīng)最大，故采用245 nm作為檢測波長。此外，為了建立簡便快速的樣本前處理方法，本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈直接沉淀法和二氯甲烷、乙酸乙酯液-液萃取等多種處理方法，發(fā)現(xiàn)相比復(fù)雜的萃取過程，單純使用1：2比例的乙腈沉淀蛋白，既能去除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，又簡便、快速、準(zhǔn)確，可用于日常阿托伐他汀的血藥濃度監(jiān)測。該方法采人血漿量少，專一性強(qiáng)，簡便快捷，適用推廣于阿托伐他汀特殊人群血藥濃度監(jiān)測、藥代動(dòng)力學(xué)及其相關(guān)性研究。