H2O2預(yù)處理結(jié)合微生物發(fā)酵提取玉米芯木聚糖的工藝研究

傅 杰，王 園，王瑞芳，陳秋燕，郭俊清，馮 霞，安曉萍*，齊景偉*

1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2內(nèi)蒙古優(yōu)牧特農(nóng)牧科技股份有限公司，呼和浩特 010010

木聚糖是植物細(xì)胞中半纖維素的重要組成成分，是自然界中第2豐富的可再生物質(zhì)[1]。木聚糖具有廣泛的生物活性，如調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖、益生等[2-5]。隨著社會(huì)對(duì)木聚糖需求的日益增加，尋求一種高效快速的木聚糖提取、制備技術(shù)已成為食品添加劑行業(yè)發(fā)展的需求。

玉米芯作為一種豐富、廉價(jià)、富含半纖維素的玉米加工副產(chǎn)物，常用作木聚糖提取的理想原料。然而，自然狀態(tài)下玉米芯的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素交聯(lián)在一起，形成了致密的纖維結(jié)構(gòu)。為了能有效地從玉米芯細(xì)胞壁中提取木聚糖，常采用物理法、化學(xué)法、生物法以及三種方法的結(jié)合利用的提取方法。本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)菌酶協(xié)同發(fā)酵法提取玉米芯木聚糖進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌與釀酒酵母1∶9的比例發(fā)酵玉米芯的同時(shí)，添加纖維素酶量1 000 U/g，產(chǎn)物中木聚糖含量可達(dá)1.421 mg/g，與對(duì)照組相比提高了257%[6]。但此研究結(jié)果所得玉米芯木聚糖含量遠(yuǎn)低于其他方法[7，8]。為了更有效地從玉米芯中提取木聚糖，本研究采用微生物發(fā)酵結(jié)合H2O2預(yù)處理的方法提取玉米芯木聚糖，并利用SEM法初步探討了該方法提高玉米芯木聚糖含量的原因，以期為微生物發(fā)酵玉米芯生產(chǎn)木聚糖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：枯草芽孢桿菌CGMCC 1.892(BacillussubtilisCGMCC 1.892)和釀酒酵母CGMCC 2.119(SaccharomycescerevisiaeCGMCC 2.119)均購(gòu)買于中國(guó)微生物菌種保藏中心。

原料：玉米芯原料購(gòu)買于市場(chǎng)，粉碎過(guò)篩(20目)。

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基均購(gòu)買廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

試劑：D-木糖：分析標(biāo)準(zhǔn)品，Aladdin公司。過(guò)氧化氫、尿素、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、四水酒石酸鉀鈉、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器與設(shè)備：SW-CJ超凈工作臺(tái)、上海新苗醫(yī)療器械；GX2型智力光照培養(yǎng)箱、寧波東南儀器有限公司；QYC-200恒溫培養(yǎng)搖床、上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)、湖南湘儀儀器開(kāi)發(fā)有限公司；微孔板分光光度計(jì)、美國(guó)伯騰儀器有限公司；JSM-6390LV掃描電鏡、JEOL公司；IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜、Eiko公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

釀酒酵母菌：將冷凍保存的釀酒酵母經(jīng)過(guò)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基活化48 h后，挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，接種于釀酒酵母種子液培養(yǎng)基中，置于28 ℃，120 rpm的搖床中培養(yǎng)24 h，備用。

枯草芽孢桿菌：將冷凍保存的枯草芽孢桿菌經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基活化24 h后，挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，接種于枯草芽孢桿菌種子液培養(yǎng)基中，置于36 ℃，120 rpm的搖床中培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 H2O2預(yù)處理玉米芯

分別將0%、0.5%、1%、2%、4%的雙氧水(相對(duì)于原料)與2 mL蒸餾水、1 g玉米芯粉混勻，室溫下放置0、0.5、1、2、4 h。然后經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，滅菌條件為121 ℃、0.15 MPa、20 min。以木聚糖含量為測(cè)定指標(biāo)，確定出H2O2的添加量和預(yù)處理時(shí)間。

1.2.3 預(yù)處理方法對(duì)比

分別將4%H2O2、0.5%尿素以及4% H2O2加0.5%尿素(相對(duì)于原料)與2 mL蒸餾水、1 g玉米芯粉混勻，室溫下放置1 h。經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，滅菌條件為121 ℃、0.15 MPa、20 min。以木聚糖含量為測(cè)定指標(biāo)，確定出最適預(yù)處理方法。

1.2.4 微生物發(fā)酵玉米芯

將經(jīng)預(yù)處理與未預(yù)處理的玉米芯分別進(jìn)行發(fā)酵，其發(fā)酵條件為：發(fā)酵菌種釀酒酵母和枯草芽孢桿菌接種比例為9∶1，發(fā)酵底物由15 g玉米芯、0.15 g尿素、0.15 g葡萄糖、18 g水組成，發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，接種量為10%。以木聚糖含量為測(cè)定指標(biāo)，考察H2O2預(yù)處理對(duì)微生物發(fā)酵提取玉米芯木聚糖的影響。

1.2.5 單因素優(yōu)化微生物發(fā)酵提取木聚糖的培養(yǎng)基組成

分別研究含水量、尿素添加量和葡萄糖添加量對(duì)玉米芯木聚糖提取率的影響。含水量為45%、50%、55%、60%；尿素添加量為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%；葡萄糖添加量為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化微生物發(fā)酵提取木聚糖的培養(yǎng)基組成

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定含水量(A)、葡萄糖添加量(B)、尿素添加量(C)的取值范圍，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以發(fā)酵底物中玉米芯木聚糖得率(Y)為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出微生物發(fā)酵提取玉米芯木聚糖的培養(yǎng)基組成。響應(yīng)面因素設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平

1.2.7 木聚糖含量測(cè)定

將處理后的玉米芯于45 ℃烘箱中烘干(24 h)，1 g干燥玉米芯加入10 mL蒸餾水，80 ℃水浴30 min后，放于5 000 rpm的高速離心機(jī)中離心15 min，上清液備用。取1 mL上清液，加入6 mol/L鹽酸3 mL，沸水浴2 h，迅速冷卻，用6 mol/L的NaoH中和水解液并調(diào)節(jié)pH為中性，用蒸餾水稀釋至10 mL[9]。本實(shí)驗(yàn)以木聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用DNS法測(cè)定還原糖含量，再將其乘以稀釋倍數(shù)10和換算系數(shù)0.88，即得到木聚糖含量[10]。

1.2.8 掃描電鏡

樣品用IB-3型離子鍍金儀噴金鍍膜后，使用JSM-6390LV掃描電鏡直接上機(jī)觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，并用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著；采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2預(yù)處理對(duì)玉米芯木聚糖含量的影響

玉米芯經(jīng)濃度0.5%～4% H2O2預(yù)處理不同時(shí)間后，木聚糖含量變化見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，隨著H2O2處理玉米芯的時(shí)間延長(zhǎng)，木聚糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化，各濃度H2O2預(yù)處理組中木聚糖含量最高均出現(xiàn)在處理1 h。且玉米芯木聚糖含量隨著H2O2濃度增加而增加，在4% H2O2處理玉米芯1 h后，木聚糖含量可達(dá)40.21±0.21 mg/g，較未經(jīng)H2O2處理組提高了98.56%(20.25±0.83 mg/g)。因此選擇4%H2O2預(yù)處理玉米芯1 h。

表2 H2O2濃度與處理時(shí)間對(duì)玉米芯木聚糖含量的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*表示存在差異顯著(P<0.05)；a,b,c同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05);肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note:Compared with control,*indicated significant difference (P<0.05 );a,b,c in the same column,values with different superscripts indicated significant difference (P<0.05 );While with the same superscripts indicated no significant difference (P>0.05 ).Same as below．

2.2 H2O2結(jié)合尿素預(yù)處理對(duì)玉米芯木聚糖含量的影響

如圖1所示，玉米芯經(jīng)H2O2、尿素、H2O2+尿素處理后，木聚糖含量分別達(dá)44.27 mg/g、31.11 mg/g、37.21 mg/g，木聚糖含量均較玉米芯原料有顯著提高，且H2O2處理組的木聚糖含量最高。盡管尿素具有破壞纖維素、木質(zhì)素的致密結(jié)構(gòu)[11]，促進(jìn)木聚糖的釋放，但本研究中玉米芯經(jīng)H2O2處理釋放木聚糖效果優(yōu)于尿素處理和H2O2+尿素處理，因此，選擇H2O2對(duì)玉米芯進(jìn)行預(yù)處理。

2.3 H2O2預(yù)處理對(duì)微生物發(fā)酵提取玉米芯木聚糖的影響

預(yù)處理的目的是破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)、脫去木質(zhì)素或半纖維素，同時(shí)增大微生物與底物的接觸面積，提高發(fā)酵效率。玉米芯經(jīng)H2O2預(yù)處理后，利用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵，其產(chǎn)物中木聚糖含量分別為52.72 mg/g，而未經(jīng)預(yù)處理的玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量為20.95 mg/g(如圖2)，H2O2預(yù)處理顯著提高了微生物發(fā)酵效率(P<0.01)，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量提高了151.64%。

圖1 不同預(yù)處理對(duì)木聚糖含量的影響Fig.1 Effect of Different Pretreatments on Xylan Content

圖2 H2O2預(yù)處理對(duì)微生物發(fā)酵玉米芯中木聚糖含量的影響Fig.2 Effect of H2O2 pretreatments on the content of xylan from microbial fermentation corncob

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖3 含水量(a)、尿素(b)和葡萄糖(c)對(duì)發(fā)酵玉米芯中木聚糖含量的影響Fig.3 Effects of water content,urea and glucose on the contents of xylan from fermented corncob

由圖3 a可知，含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量有一定的影響，隨著培養(yǎng)基中含水量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)。含水量50%時(shí)，木聚糖含量達(dá)到最高值60.04 mg/g，顯著高于其他料水比(P<0.05)。因此，選擇培養(yǎng)基中含水量為50%。同理由圖3 b和圖3 c可得，確定出尿素添加量為0.25%、葡萄糖添加量為0.75%，在此條件下，木聚糖含量可達(dá)65.06 mg/g。由SAS 9.2軟件方差分析可知，三因素不同添加量對(duì)木聚糖含量的影響均顯著(P<0.05)。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.5.1 響應(yīng)面結(jié)果

在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析方法對(duì)含水量(A)、葡萄糖添加量(B)和尿素添加量(C)進(jìn)一步優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

利用Design-Expert 8.0軟件，通過(guò)對(duì)多項(xiàng)式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=65.85+2.62A+0.11B+2.01C+1.38AB-0.65AC+1.04BC-4.09A2-1.62B2-3.62C2。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

回歸模型各項(xiàng)的方差分析見(jiàn)表4。由表4可知，該模型P值為0.037 8，表明回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)的P值為0.758 8大于0.05，模型失擬不顯著，試驗(yàn)誤差小[12]，由此說(shuō)明用該模型對(duì)微生物發(fā)酵提取玉米芯木聚糖的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化是可行的。由F值可知，三因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中玉米芯木聚糖含量影響的順序?yàn)椋汉?A)>尿素添加量(C)>葡萄糖添加量(B)。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

注:*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01)。

Note:*Significant difference (P<0.05);**extremely significant difference (P<0.01).

2.5.2 響應(yīng)面分析

圖4為各交互因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量影響的響應(yīng)面。由圖4可知，兩因素交互作用對(duì)木聚糖含量影響并不顯著(P>0.05)，圖4(A)表示，隨著含水量的增加，木聚糖含量呈逐漸上升后下降的趨勢(shì)。圖4(B)中，含水量和尿素添加量的增加，木聚糖含量也逐漸上升。表4中，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)木聚糖含量均有顯著影響(P<0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明各因素對(duì)木聚糖含量的影響不是簡(jiǎn)單地線性關(guān)系。

圖4 各因素之間的交互作用影響Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the content of xylan

2.5.3 優(yōu)化培養(yǎng)基組成的驗(yàn)證

用 Design-expert 8.0 軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得出的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為含水量50%、葡萄糖添加量0.75%、尿素添加量0.25%，在該條換下玉米芯木聚糖含量為69.337 mg/g，在此條件下進(jìn)行5次重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，實(shí)際玉米芯木聚糖含量為70.84 mg/g。與理論值偏差2.16%，說(shuō)明此模型有效且優(yōu)化結(jié)果可靠。該優(yōu)化結(jié)果比未發(fā)酵玉米芯木聚糖含量提高249.82%。

2.6 電鏡掃描

玉米芯原料、H2O2預(yù)處理玉米芯、微生物發(fā)酵+H2O2預(yù)處理玉米芯本研究利用掃描電鏡觀察經(jīng)過(guò)一系列處理后玉米芯微觀結(jié)構(gòu)變化。SEM掃描結(jié)果如圖5，玉米芯(圖5 a)表面光滑，結(jié)構(gòu)致密，沒(méi)有孔洞損傷。玉米芯經(jīng)過(guò)H2O2預(yù)處理后，表面出現(xiàn)較多坑洞，結(jié)構(gòu)變得疏松，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到一定破壞，木質(zhì)素與纖維素和半纖維素之間連接的共價(jià)鍵發(fā)生了斷裂(圖5 b)；玉米芯經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵+H2O2預(yù)處理后，玉米芯表面孔洞更大更多，結(jié)構(gòu)更疏松(圖5 c)。H2O2預(yù)處理后玉米芯較疏松的結(jié)構(gòu)可顯著增加微生物菌體細(xì)胞及其產(chǎn)生的酶與玉米芯表面的接觸，提高微生物對(duì)玉米芯中木質(zhì)纖維素的降解效率[13],促進(jìn)木聚糖的釋放。

圖5 預(yù)處理前后玉米芯的掃描電鏡圖(100×，20×)Fig.5 SEM of corncob before and after pre-treatment(100×，20×)

3 結(jié)論

玉米芯內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而木質(zhì)素又緊密包裹在纖維素和半纖維素周圍，形成天然抗降解屏障，保護(hù)纖維素和半纖維素不受微生物的破壞[14]。因此，去除木質(zhì)素是解除玉米芯天然抗降解屏障、提高微生物發(fā)酵效率的首要任務(wù)。預(yù)處理可以增加底物的多孔性，進(jìn)而增加可及性，顯著提高微生物發(fā)酵效率[15]。H2O2作為去除木質(zhì)素的去除試劑，玉米芯的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被H2O2氧化后，細(xì)胞壁外面包圍的木質(zhì)素被軟化，半纖維素和纖維素與木質(zhì)素之間的氫鍵發(fā)生斷裂，微生物可更好的利用纖維素和半纖維素從而提高發(fā)酵效率，釋放更多木聚糖[14-16]。本實(shí)驗(yàn)中玉米芯經(jīng)H2O2預(yù)處理后再發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量52.72 mg/g，較未經(jīng)H2O2預(yù)處理玉米芯發(fā)酵產(chǎn)物中木聚糖含量提高了186.76%。

將H2O2預(yù)處理玉米芯作為培養(yǎng)基，利用釀酒酵母和枯草芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵，其產(chǎn)物中木聚糖含量可達(dá)70.84 mg/g，較H2O2預(yù)處理玉米芯中木聚糖含量提高了60.01%(44.27 mg/g)，由此可見(jiàn)微生物發(fā)酵可顯著提高玉米芯木聚糖含量。這可能是由于釀酒酵母屬于真菌，真菌降解纖維素的主要機(jī)制是分泌大量的胞外酶來(lái)破壞木質(zhì)纖維素的緊密結(jié)構(gòu)，從而有效降解玉米芯?？莶菅挎邨U菌屬于細(xì)菌，細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的機(jī)制是主要通過(guò)分泌的纖維素酶的纖維素結(jié)合域附著在木質(zhì)纖維素的表面，纖維素受細(xì)菌作用易于膨脹而被破壞分解[17，18]，從而促進(jìn)玉米芯木聚糖的釋放。

通過(guò)H2O2預(yù)處理能夠提高微生物發(fā)酵效率，提高玉米芯木聚糖釋放，其結(jié)構(gòu)的變化是玉米芯木聚糖含量提高的內(nèi)在原因。SEM圖像表明，玉米芯纖維素、木質(zhì)素相互纏繞的致密結(jié)構(gòu)及其表層均被H2O2破壞，更容易被微生物利用，從而經(jīng)微生物發(fā)酵后的玉米芯表面孔洞更大更多，結(jié)構(gòu)變得更疏松。本實(shí)驗(yàn)采用微生物發(fā)酵結(jié)合H2O2預(yù)處理提取玉米芯中木聚糖，其最佳工藝為：4%H2O2預(yù)處理玉米芯原料1 h后，采用釀酒酵母：枯草芽孢桿菌9∶1比例發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為含水量50%、葡萄糖添加量0.75%、尿素添加量0.25%，該條件下玉米芯木聚糖含量可達(dá)70.84 mg/g。