利用微滴式數(shù)字PCR技術檢測大豆毛油中的轉(zhuǎn)基因成分

柴成梁 唐柏飛 常曉嬌 林振泉 孫長坡

(國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油加工研究所1，北京 100037)(中國糧食研究培訓中心2，北京 100031)

轉(zhuǎn)基因大豆是利用現(xiàn)代生物技術，將外源基因?qū)氩⒄系酱蠖够蚪M中，通過外源基因的穩(wěn)定遺傳和表達，實現(xiàn)大豆的品質(zhì)創(chuàng)新和性狀改良[1]，是世界上商品化最早、推廣應用速度最快、種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因糧食作物[2]。我國是轉(zhuǎn)基因大豆的進口大國，且呈逐年增加的趨勢，2017年我國進口9 553萬t大豆，其中主要為轉(zhuǎn)基因大豆[3]。由轉(zhuǎn)基因大豆加工而成的大豆油、色拉油成為進入消費者生活的食用油。判定食用的大豆油是否含有轉(zhuǎn)基因成分，以及含有哪種外源轉(zhuǎn)基因成分，是國家監(jiān)管部門、大豆加工企業(yè)和公眾密切關心、關注的問題。然而，大豆油在制備精煉過程中破壞了大豆的DNA[4-5]，造成檢驗時DNA富集難度增加，嚴重影響了大豆油轉(zhuǎn)基因檢測的準確度。到目前為止，國家已經(jīng)頒布的標準中沒有涉及轉(zhuǎn)基因大豆油的檢測標準，而對轉(zhuǎn)基因大豆的檢測標準無法應用于大豆油的轉(zhuǎn)基因成分檢測[6]。

數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)技術是近些年來興起的一項針對單分子目標DNA的定量分析技術，其原理是將待測樣品分成幾十到幾萬份，相應分配到不同的反應單元中，每個反應單元中不含有或含有一個至多個拷貝的目標DNA分子，在每個反應單元中分別對目標DNA分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后采用泊松概率分布公式等統(tǒng)計學公式分析單個反應單元的陽性信號，來定量DNA拷貝數(shù)[7]。數(shù)字PCR技術擺脫了對標準曲線的依賴，具有更高靈敏度和準確度。數(shù)字PCR技術可以分為兩類:微滴式數(shù)字PCR(droplet dPCR，ddPCR)和芯片式數(shù)字PCR(chip dPCR，cdPCR)[8]。數(shù)字PCR作為更精確和更靈敏的DNA檢測新技術，為轉(zhuǎn)基因成分的分析提供了新的手段，近年來國內(nèi)外研究者不斷探索利用數(shù)字PCR技術對轉(zhuǎn)基因成分進行分析。Corbisier等[9]利用數(shù)字PCR分析了玉米種子中外源基因和內(nèi)標準基因的拷貝數(shù)之比，該結(jié)果熒光定量PCR技術檢測的結(jié)果相同，證明了數(shù)字PCR技術應用于轉(zhuǎn)基因成分檢測的可行性。Dany等[10]應用微滴數(shù)字PCR技術對食品和飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進行了精確定量分析。隋志偉等[11]應用數(shù)字PCR技術成功研制了轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1標準物質(zhì)。潘廣等[12]基于微滴式數(shù)字PCR平臺在國內(nèi)首次建立了轉(zhuǎn)基因玉米品系T25的單/雙重微滴式數(shù)字PCR定量方法。

數(shù)字PCR技術作為高靈敏度、高精確度的DNA檢測技術，在植物的轉(zhuǎn)基因成分檢測方面已有了一定的應用[13-17]，但鮮見其應用于植物油中的轉(zhuǎn)基因成分檢測。本研究利用微滴式數(shù)字PCR技術對3份大豆毛油樣品進行轉(zhuǎn)基因成分檢測，確定其中1份大豆毛油含有外源轉(zhuǎn)基因成分，另外2份為非轉(zhuǎn)基因大豆油。同時，運用常規(guī)PCR方法和熒光定量PCR方法對提取的大豆毛油DNA樣品進行外源目標基因的擴增，未檢測到轉(zhuǎn)基因成分，說明高靈敏度的數(shù)字PCR技術更適用于植物油樣品的轉(zhuǎn)基因成分檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實驗檢測的大豆毛油樣品及非轉(zhuǎn)基因大豆油樣品均由北京某糧油公司提供，大豆毛油樣品是該公司運用浸出法提取獲得；PCR反應所需的引物和TaqMan探針均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，TaqMan探針所用的熒光基團和淬滅基團分別為FAM和BHQ1，實驗所用引物和探針序列列于表1中。

1.1.2 試劑與儀器

數(shù)字PCR反應液、常規(guī)PCR反應液：TAKARA公司；DNA marker：Genstar公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：中科瑞泰公司； DNA熒光染料Goldview：北京鼎國昌盛生物技術公司；TE緩沖液由本實驗室配制保存:0.01 mol/L Tris-HCl(pH8.0) + 0.001 mol/L EDTA(pH 8.0)。

Bio-rad電泳槽、恒壓/恒流電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)；PCR熱循環(huán)擴增儀；QX 200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆毛油樣品DNA提取

取4個50 mL離心管，每管取20 mL毛油樣品和20 mL正己烷，常溫下置于磁力攪拌器上混勻攪拌30 min，即為油相；取混勻好的油相20 mL和TE緩沖液20 mL，振蕩搖床混勻1 h；8 000 r/min、4 ℃離心5 min，取下層水相到新的4個50 mL離心管中；向水相中加入等體積的混勻好的油相，振蕩搖床混勻1 h；重復上述8 000 r/min離心加入等體積混勻好的油相，振蕩裝勻1 h，至毛油使用量為100 mL；最后一次取水相到新的4個離心管后，再離心8 000 r/min、4 ℃離心5 min，小心取水相到新的4個離心管中，加30 μL 助沉劑，1倍體積的預冷的異丙醇，-20 ℃放置過夜；15 000 r/min、4 ℃離心30 min，倒掉液體，用100 μL TE緩沖液反復沖洗有沉淀的部位，收集并移到1.5 mL離心管中，加1倍體積的酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)溶液，混勻，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取水相到新離心管中；加10 μL carrier RNA和1倍體積的預冷的異丙醇，-20 ℃放置過夜；14 000r/min、4 ℃離心30 min，棄上清；向沉淀中加入800 μL 70%乙醇，混勻，14 000 r/min、4 ℃離心30 min；棄上清，室溫晾干沉淀15～20 min，加50 μL TE緩沖液，即為從大豆毛油提取的DNA溶液。

大豆毛油樣品DNA提取結(jié)束后，立即進行數(shù)字PCR檢測，以防DNA降解。

1.2.2 微滴式數(shù)字PCR檢測大豆毛油樣品DNA的轉(zhuǎn)基因成分

1.2.2.1 微滴式數(shù)字PCR擴增方法

提取的大豆毛油樣品DNA轉(zhuǎn)基因成分數(shù)字PCR擴增實驗設陽性對照、陰性對照和空白對照作為質(zhì)量控制。陽性對照為含有待測序列的質(zhì)粒，陰性對照為非轉(zhuǎn)基因大豆毛油，空白對照是以水代替DNA模板。每個樣品數(shù)字PCR反應設置2個平行。

表1 引物和探針列表

擴增體系和程序：配制探針法微滴式數(shù)字PCR反應體系20 μL，引物終濃度為900 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L，振蕩混勻，離心除氣泡，加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，通過形成油包水結(jié)構(gòu)實現(xiàn)體系的分割。將生成的微滴全部轉(zhuǎn)入熒光PCR反應板中，進行PCR擴增，反應程序為：1)95 ℃，10 min(預變性)；2)94 ℃，30 s； 60 ℃，60 s；40循環(huán)(變性，復性)；3)98 ℃，10 min(終止反應，并使微滴結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定)；4)4 ℃，Hold(結(jié)束)。

反應結(jié)束后用微滴分析儀對擴增產(chǎn)物進行計數(shù)分析。

1.2.2.2 微滴式數(shù)字PCR檢測結(jié)果判定

空白對照樣品無擴增信號，陰性對照樣品只有大豆內(nèi)源基因擴增，各目標基因陽性對照均有擴增，表明數(shù)字PCR體系正常工作。在數(shù)字PCR體系正常工作條件下，根據(jù)目標基因有無擴征信號判斷檢測的大豆毛油樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分。

1.2.3 常規(guī)PCR檢測大豆毛油樣品DNA的轉(zhuǎn)基因成分

以提取獲得的毛油DNA樣品為模板，并設置好陰性對照和空白對照，進行常規(guī)PCR反應，以對比兩種方法檢測大豆毛油轉(zhuǎn)基因成分的優(yōu)劣。

20 μL的常規(guī)PCR反應體系包括模板2 μL，正向引物及反向引物各0.3 μL，2×PCR Mix 10 μL和7.4 μL超純水。反應程序為：(1)95 ℃變性5 min；(2)94 ℃變性30 s；(3)54 ℃退火30 s；(4)72 ℃延伸(延伸時間根據(jù)目的基因片斷長度計算)；(5)步驟(2)到步驟(4)進行30個循環(huán)；(6)72 ℃延伸10 min；(7)20 ℃ 10 min。

反應結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆毛油樣品DNA提取

各取每個大豆毛油樣品100 mL，按本實驗所設計的DNA提取方法對大豆毛油樣品進行DNA提取，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。

注：A～C分別為提取的A、B、C 3個毛油樣品的基因組；Marker從上至下依次為：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

2.2 微滴式數(shù)字PCR檢測大豆毛油樣品DNA

大豆毛油樣品DNA提取結(jié)束后，為防止DNA降解對檢測結(jié)果的影響，立即對所獲得的DNA進行數(shù)字PCR反應，結(jié)果如圖2所示。

數(shù)字PCR反應結(jié)束后，通過Bio-rad QX 200軟件分析直接讀出檢測結(jié)果。

如圖2所示，此結(jié)果為陽性對照和空白對照樣品檢測大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測結(jié)果。藍斑表示檢測到熒光信號，黑斑表示無熒光信號。A02、B02、C02這3個孔分別是A、B、C樣品的空白對照，D02是陽性對照。由圖2的結(jié)果可知，只有陽性對照樣品能檢測到Lectin基因。

由圖3可見，A、B、C 3個毛油樣品和陰性對照樣品均能檢測出大豆內(nèi)源基因Lectin。由圖4可知，陰性對照樣品未能檢測出外源基因成分。結(jié)合圖2～圖4可知，A、B、C 3個大豆毛油樣品基因組DNA提取成功，且數(shù)字PCR體系工作正常，在此情況下，得到的外源轉(zhuǎn)基因成分檢測結(jié)果真實可靠。

圖2 對照樣品大豆內(nèi)源基因Lectin檢測結(jié)果

圖3 A、B、C 3個毛油樣品和陰性對照樣品大豆內(nèi)源基因Lectin檢測結(jié)果

圖4 陰性對照樣品外源基因CaMV35S、NOS和EPSPS檢測結(jié)果

圖5 A、B、C 3個毛油樣品外源基因檢測結(jié)果

由圖5可知，A樣品能檢測出外源基因CaMV35S和Pat，未檢測出外源基因NOS 、EPSPS和CryIA(c)，說明A毛油樣品是由混有除草劑大豆A5547-127的大豆原料加工而成，而B、C毛油樣品未檢測出外源基因，說明B、C為非轉(zhuǎn)基因大豆油。

2.3 常規(guī)PCR檢測大豆毛油樣品DNA

作為對比，用常規(guī)PCR方法和熒光定量PCR方法檢測所提取的大豆毛油DNA樣品。由圖6結(jié)果可見，提取3個大豆毛油樣品的基因組DNA后進行常規(guī)PCR，未檢測到外源轉(zhuǎn)基因成分，且大豆內(nèi)源基因Lectin也未檢測到。同樣，由圖7結(jié)果可見運用熒光定量PCR也未檢測到外源轉(zhuǎn)基因成分及大豆內(nèi)源基因Lectin。

注：1、2、3、4泳道分別檢測Lectin基因(118 bp)、CaMV35S啟動子(195 bp)、NOS終止子(165 bp)、EPSPS基因(320 bp)；Marker從上至下依次：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

圖7 熒光定量PCR檢測A、B、C毛油樣品外源基因

圖7為檢測Lectin基因、CaMV35S啟動子、NOS終止子、EPSPS基因的熒光定量PCR擴增曲線，橫坐標表示擴增循環(huán)數(shù)，縱坐標表示反應樣品的熒光信號強度；Ct值為25的4個擴增曲線分別為4個基因的陽性對照。

3 討論與結(jié)論

2017年6月14日，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部公布了《2017年農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(進口)批準清單》，批準16個轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進口，用途皆為“加工原料”，其中包括5個轉(zhuǎn)基因大豆品種。隨著大豆等轉(zhuǎn)基因作物進入我國市場及百姓的視野和餐桌，為了給國家監(jiān)管部門制定相關制度和政策提供可靠的技術支撐，同時，強化轉(zhuǎn)基因成分檢測技術儲備，保障公眾對于轉(zhuǎn)基因食品的知情權(quán)，必需研發(fā)精確、有效、快速的轉(zhuǎn)基因檢測技術。

大豆油在生產(chǎn)過程中，先后經(jīng)過多次高溫、脫水、中和等步驟，大豆DNA在此過程中已被嚴重降解，大豆油中DNA含量較低，用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測方法很難得到真實可信的結(jié)果。本研究利用靈敏度和準確度更高微滴式數(shù)字PCR技術，完成了3份大豆毛油的外源轉(zhuǎn)基因成分檢測，確定了其中1份樣品含有外源轉(zhuǎn)基因成分。針對大豆毛油樣品中DNA含量較低、降解嚴重的特點，本研究首先優(yōu)化了大豆毛油樣品的DNA提取方法，減少DNA在提取過程中的損失，并用較多量的毛油樣品提取DNA以提高其濃度；其次，所選的外源轉(zhuǎn)基因目的片段盡量短且為GC含量高的區(qū)域，以防毛油樣品中的DNA降解。通過方法的優(yōu)化，成功的檢測到了大豆毛油樣品中的外源轉(zhuǎn)基因成分，由此建立了一套微滴式數(shù)字PCR方法檢測大豆毛油中轉(zhuǎn)基因成分的技術標準。同時，運用本方法對市售的精煉大豆油樣品的外源轉(zhuǎn)基因成分檢測工作正在開展。未來，隨著數(shù)字PCR技術平臺的發(fā)展，其成本將會更低，通量更高，在植物油的轉(zhuǎn)基因成分檢測領域?qū)l(fā)揮更重要的作用。