連作植煙土壤酚酸類物質(zhì)變化特征及其與主要環(huán)境因子的Mantel Test分析*

白羽祥, 楊成翠, 史普酉, 賈 孟, 楊煥文, 徐照麗, 王 戈**

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連作植煙土壤酚酸類物質(zhì)變化特征及其與主要環(huán)境因子的Mantel Test分析*

白羽祥1, 楊成翠1, 史普酉1, 賈 孟1, 楊煥文1, 徐照麗2, 王 戈1**

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 昆明 650201; 2. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 昆明 650021)

為明確酚酸類物質(zhì)在連作植煙土壤中的變化特征, 探討土壤主要環(huán)境因子對酚酸類物質(zhì)的影響, 以不同連作年限(4 a, 6 a, 8 a, 14 a和16 a)植煙土壤為對象, 研究了不同連作年限植煙土壤酚酸類物質(zhì)、理化性狀、酶活性和細(xì)菌多樣性的變化特征, 并利用Mantel Test分析了酚酸類物質(zhì)與土壤主要環(huán)境因子的相關(guān)性。結(jié)果表明, 隨連作年限增加, 土壤酚酸類物質(zhì)和速效鉀含量升高, pH、有機(jī)質(zhì)含量、細(xì)菌菌群豐度和多樣性降低, 水解性氮和有效磷含量呈先降低后升高趨勢, 酶活性呈先升高后降低趨勢。Mantel Test分析表明, 土壤酚酸類物質(zhì)含量與理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度顯著相關(guān), 且與理化性狀相關(guān)性最高; 不同酚酸類物質(zhì)含量與土壤主要環(huán)境因子相關(guān)性存在差異, 其中, 對羥基苯甲酸和闊馬酸與植煙土壤理化性狀、酶活性以及細(xì)菌豐度的相關(guān)性最高。因此, 在本試驗(yàn)條件下, 連作植煙土壤酚酸類物質(zhì)具有明顯積累特征, 植煙土壤環(huán)境惡化; 酚酸類物質(zhì)積累受理化性狀、酶活性和細(xì)菌多樣性影響, 且理化性狀影響最大; 不同酚酸類物質(zhì)受主要土壤環(huán)境因子的影響存在差異, 其中對羥基苯甲酸和闊馬酸積累所受影響最大。

烤煙; 連作; 酚酸類物質(zhì); 土壤環(huán)境; Mantel Test

烤煙()是忌連作作物, 長期連作嚴(yán)重影響其生長發(fā)育及產(chǎn)質(zhì)量形成[1]。雖然我國一直提倡輪作, 但在耕地面積逐年減少和利益驅(qū)使下, 烤煙連作現(xiàn)象依然普遍, 嚴(yán)重制約了植煙土壤的可持續(xù)發(fā)展[2]。研究表明, 連作會導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡[3-4]、酶活性變化[5-6]、微生物多樣性降低[7]和自毒物質(zhì)積累[8]等一系列土壤問題, 以上各因素相互作用并對土壤環(huán)境產(chǎn)生綜合影響進(jìn)而導(dǎo)致植株生長發(fā)育受抑。

目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為有毒物質(zhì)積累是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要因素, 主要通過植物揮發(fā)、淋溶、根系分泌、凋落物及其殘?bào)w分解等方式釋放到土壤環(huán)境中[9-10], 其中酚酸類物質(zhì)在其中扮演的角色備受關(guān)注[11-14]。研究表明, 在連作條件下酚酸可以間接刺激土傳病原微生物繁殖, 提高植株發(fā)病率[15], 如黃瓜()根系分泌物中的香豆素可以顯著影響根際土壤微生物群落并促進(jìn)土傳病原菌的生長[16], 香草醛可以顯著影響黃瓜根際鐮刀菌屬()和木霉屬()真菌群落結(jié)構(gòu)和豐富度[17]。酚酸類物質(zhì)在連作土壤中的積累特性已在水稻()、大豆()、花生()、黃瓜、中藥材以及林木等多種植物中被證實(shí)[18-20], 而有關(guān)連作植煙土壤中有毒物質(zhì)特別是酚酸類物質(zhì)種類和含量的變化特征研究相對薄弱, 尚未有直接證據(jù)表明其在土壤中是否存在積累特征[21-22]。另外, 土壤環(huán)境因子之間存在密切的相互關(guān)系并共同塑造著土壤環(huán)境, 那么酚酸類物質(zhì)通過根系分泌、淋溶、腐解等多種途徑進(jìn)入土壤環(huán)境后也必將參與到這一復(fù)雜的過程中[23]。然而, 進(jìn)入土壤后的酚酸類物質(zhì)與其他環(huán)境因子的相互作用關(guān)系并未受到太多關(guān)注, 但其對進(jìn)一步明確酚酸類物質(zhì)在土壤中的作用機(jī)制及其在連作障礙中的作用具有重要意義[24-26]。本試驗(yàn)擬通過研究土壤各環(huán)境因子與酚酸類物質(zhì)間相關(guān)性以明確酚酸類物質(zhì)與土壤其他環(huán)境因子的關(guān)系, 但目前采用的相關(guān)性分析方法僅可以判斷兩個(gè)變量之間的關(guān)聯(lián)程度, 無法對兩類變量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析, 這在一定程度上限制了對土壤各環(huán)境因子間關(guān)系的探究。

Mantel Test是對兩個(gè)矩陣(兩類變量)相關(guān)關(guān)系的檢驗(yàn), 由Mantel在1967年提出[27]。該方法在種群遺傳學(xué)、群落生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用, 在生態(tài)學(xué)中多用于研究生物因素和非生物因素之間的相關(guān)性[28-29], 前人在黑胡椒()園[30]和熱帶雨林[31]等土壤環(huán)境因子和相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn), 相對于一般相關(guān)性分析方法, Mantel Test具有可以直接分析兩類變量(如土壤理化性狀和微生物多樣性)之間相關(guān)性的優(yōu)點(diǎn), 這對研究土壤各環(huán)境因子之間關(guān)系具有十分重要的意義, 但該方法在植煙土壤各環(huán)境因子關(guān)系的研究中少見報(bào)道。因此, 本研究在描述連作植煙土壤酚酸類物質(zhì)、理化性狀、酶活性和細(xì)菌多樣性變化特征基礎(chǔ)上, 利用Mantel Test方法探討了酚酸類物質(zhì)與土壤各環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系, 旨在為研究影響土壤酚酸類物質(zhì)含量的環(huán)境因素及其在連作障礙中的作用機(jī)理提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集區(qū)基本概況

試驗(yàn)地選擇在云南省保山市施甸縣姚關(guān)鎮(zhèn)陡坡村的連片烤煙種植示范區(qū)(99°14′E, 24°36′N, 海拔1 820 m), 年平均氣溫17 ℃, 年平均降雨量1 120 mm。該區(qū)域土地由同一農(nóng)戶承包, 植煙歷史可考。除連作年限外, 其他因素一致: 土壤質(zhì)地為砂壤土, 種植烤煙品種為‘K326’, 每年烤煙施氮量(純氮)為120 kg?hm-2, 施磷量(P2O5)為90 kg?hm-2、施鉀量(K2O)為321 kg?hm-2, 肥料由當(dāng)?shù)責(zé)煵莨咎峁? 栽培管理措施統(tǒng)一按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

試驗(yàn)田種植制度為“大麥()-烤煙”復(fù)種連作模式, 一年兩熟。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理, 分別為連續(xù)種植4 a(T4)、6 a(T6)、8 a(T8)、14 a(T14)和16 a(T16)烤煙的土壤, 每一處理設(shè)置3次重復(fù), 共計(jì)15個(gè)小區(qū), 每一小區(qū)面積為667 m2。于2017年9月20日利用五點(diǎn)取樣法采取每一小區(qū)植煙土壤0~20 cm土樣2 kg, 除去表層并混勻后每一重復(fù)用5 mL離心管裝取3管并立即放入液氮中保存待測, 其余土樣立即放入4 ℃冰箱中保存待測。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤酚酸類物質(zhì)的測定

儀器為Aglient 1200高效液相色譜儀, 色譜柱為SunFireTMC18(4.6 mm×250 mm, 5mm), 條件為流速 1 mL?min-1, 柱溫為25 ℃, 檢測波長為280 nm。流動相A(甲醇)和流動相B(pH=2.5的乙酸水溶液)設(shè)置的具體梯度為: 0 min, 流動相A 30%、B 70%; 15 min, 流動相A 50%、B 50%; 16 min, 流動相A 70%、B 30%; 30 min, 流動相A 0%、B 100%。標(biāo)準(zhǔn)樣品分別為闊馬酸、對羥基苯甲酸、間苯三酚、香草酸、香蘭素、阿魏酸、鄰苯二甲酸、苯甲酸、肉桂酸和水楊酸, 進(jìn)樣量為10 μL。每個(gè)周期分析結(jié)束后, 等待10 min, 以便去除干擾成分的影響, 保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.3.2 土壤理化性狀的測定

土壤pH采用2.5∶1的水土比, 用電位計(jì)法測定; 有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀-硫酸外加熱法測定; 堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測定; 有效磷采用NaHCO3浸提、鉬銻抗比色法測定; 速效鉀采用醋酸銨浸提、火焰光度計(jì)測定。測定的主要儀器分別為火焰光度計(jì)、分析天平、凱式定氮儀、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱和紫外分光光度計(jì)等。以上測試指標(biāo)分別按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1377—2007、NY/T 87—1988、LY/T 1229—1999、NY/T 1121.7—2006、NY/T 889—2004進(jìn)行測定。所有土樣的測定均為3次重復(fù)。

1.3.3 土壤酶活性的測定

過氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法、脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法、蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法、酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測定[32]。所有土樣測定均為3次重復(fù)。

1.3.4 土壤細(xì)菌多樣性的測定

1.3.4.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

利用CTAB法提取各處理樣本的基因組DNA, 然后利用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的純度和濃度。取適量樣品放在離心管中, 用無菌水稀釋樣品至濃度為1 ng×μL-1。以稀釋處理后的基因組DNA為模板, 依據(jù)細(xì)菌和真菌測序區(qū)域的選擇, 利用帶Barcode的特異引物(New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer)和高效高保真酶進(jìn)行PCR。

1.3.4.2 引物對應(yīng)區(qū)域

515F和806R(16S V4區(qū)引物)用于鑒定細(xì)菌多樣性。

1.3.4.3 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測, 依據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣, 充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物, 對得出的目的條帶進(jìn)行拍照記錄, 一次電泳條帶不清晰的目的條帶進(jìn)行二次電泳直至條帶清晰可用為準(zhǔn), 之后使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒對目的條帶產(chǎn)物進(jìn)行回收。

1.3.4.4 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用建庫試劑盒(TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit)進(jìn)行文庫的構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量檢測確定文庫是否合格。

1.3.4.5 土壤細(xì)菌基因組DNA信息分析

1)測序數(shù)據(jù)處理

首先從Illumina HiSeq測序平臺得到的下機(jī)數(shù)據(jù)中分離出樣品數(shù)據(jù), 使用FLASH[33]拼接截去Barcode和引物序列后的樣品reads, 得到Raw Tags, Raw Tags經(jīng)過過濾處理[34]后得到Clean Tags。然后按照Tags質(zhì)量控制流程[35]通過數(shù)據(jù)庫Gold database與UCHIME Algorithm[36]比對后將Clean Tags進(jìn)行檢測和去除嵌合體序列[37]的處理, 最終得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)Effective Tags。數(shù)據(jù)處理過程中各步驟得到的序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 不同連作年限烤煙土壤樣品細(xì)菌基因測序數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

2)OTU聚類和物種注釋

利用Uparse軟件[38]對各處理樣品Effective Tags進(jìn)行聚類。默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs, 同時(shí)選取OTUs的代表性序列, 依據(jù)其算法原則, 篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋, 用Mothur方法與Altschul等[39]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[40]進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8~1)。獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平[界(kingdom)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)]統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。最后對樣品的數(shù)據(jù)均一化處理, 以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。

3)樣品多樣性分析(Alpha diversity)

使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計(jì)算各處理樣本的Observed-species、Chao1(Chao1 estimator)、ACE (ACE estimator)、Shannon (Shannon index)、Simpson (Simpson index)、Goods-coverage (Good’s coverage)指數(shù)。Alpha多樣性指數(shù)的具體應(yīng)用為: Chao和ACE指數(shù)用于分析菌群豐富度(community richness), Shannon和Simpson指數(shù)用于分析菌群多樣性(community diversity), Coverage用于分析測序深度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office 2013進(jìn)行初步處理, 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 利用 Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較和分析, 利用PCORD 5.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行Mantel test分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作植煙土壤主要環(huán)境因子變化特征

2.1.1 土壤酚酸類物質(zhì)及其含量變化特征

在5個(gè)連作年限植煙土壤中檢出8種酚酸類物質(zhì), 分別為間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸(表2)。隨連作年限增加, 間苯三酚含量依次顯著升高; 連作4 a和6 a處理的闊馬酸和阿魏酸含量無顯著差別, 但顯著低于連作14 a和16 a處理; 除連作8 a處理外, 隨連作年限增加, 對羥基苯甲酸、香草酸和香蘭素含量升高, 且除連作6 a和連作14 a處理的香蘭素含量差異不顯著外, 其余處理間差異達(dá)到顯著水平(表2)。以上結(jié)果表明, 在連作條件下, 土壤間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素和阿魏酸含量出現(xiàn)富集效應(yīng), 且連作年限越長富集效應(yīng)越明顯。對于苯甲酸和肉桂酸而言, 兩者含量的峰值均出現(xiàn)在連作8 a處理, 說明在長期連作條件下, 苯甲酸和肉桂酸含量呈先升高后降低趨勢。結(jié)合土壤酚酸類物質(zhì)總含量變化趨勢并綜合分析可知, 長期連作導(dǎo)致植煙土壤酚酸物質(zhì)含量升高, 呈現(xiàn)顯著的積累特征。

表2 不同連作年限植煙土壤酚酸類物質(zhì)種類和含量

不同小寫字母代表不同連作年限在5%水平顯著。Different lowercase letters represent significant differences among different continuous cropping years at 0.05 level.

2.1.2 土壤理化性狀變化特征

對不同連作年限植煙土壤理化性狀的分析(表3)可知, 隨連作年限增加, 植煙土壤pH呈下降趨勢, 其中連作14 a和16 a處理顯著低于其他處理; 相對于連作4 a處理而言, 其他處理土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著降低, 其中連作14 a處理最低, 但與連作8 a和16 a處理差異不顯著; 除連作16 a處理顯著高于其他處理外, 隨連作年限增加, 水解性氮含量降低, 總體呈先下降后升高趨勢; 連作4年處理的有效磷含量顯著高于其他處理, 隨連作年限增加呈先降低后升高趨勢, 但連作8 a、14 a和16 a處理之間的差異不顯著; 隨連作年限增加, 速效鉀含量呈升高趨勢, 其中連作4 a、6 a和8 a處理間差異不顯著, 但均顯著低于連作14 a和16 a處理。以上結(jié)果表明, 連作導(dǎo)致植煙土壤酸化和各養(yǎng)分發(fā)生非均衡變化。

表3 不同連作年限植煙土壤理化性狀的影響

不同小寫字母代表不同連作年限在5%水平顯著。Different lowercase letters represent significant differences among different continuous cropping years at 0.05 level.

2.1.3 土壤酶活性變化特征

隨連作年限增加, 植煙土壤中過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈先升高后降低趨勢, 但不同酶活性的峰值出現(xiàn)在不同年限, 其中, 連作8 a處理的過氧化氫酶和酸性磷酸酶活性顯著高于其他年限; 除連作6 a處理的蔗糖酶活性與連作8 a處理間差異不顯著外, 連作6 a處理的脲酶和蔗糖酶活性顯著高于其他年限(表4)。

表4 不同連作年限植煙土壤酶活性的變化

不同小寫字母代表不同連作年限在5%水平顯著。Different lowercase letters represent significant differences among different continuous cropping years at 0.05 level.

2.1.4 連作植煙土壤細(xì)菌變化特征

2.1.4.1 連作植煙土壤門水平細(xì)菌的相對豐度

不同處理細(xì)菌區(qū)系在門水平上的組成相似, 主要由變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)構(gòu)成, 占到總量的88.72%, 其中變形菌門占49.92%。連作4 a和6 a處理的土壤細(xì)菌群落組成相似, 但連作8 a后的細(xì)菌群落組成差異較大。連作8 a和連作14 a處理檢出的變形菌門的相對豐度較連作4 a處理分別降低了19.46%和37.41%, 擬桿菌門分別降低了40.90%和56.36%。另外, 隨連作年限增加, 放線菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes)呈先升高后降低趨勢, 且峰值分別出現(xiàn)在8 a、14 a和14 a(表5)?？傮w來看, 連作導(dǎo)致植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

表5 不同連作年限植煙土壤中門水平細(xì)菌的相對豐度

不同小寫字母代表不同連作年限在5%水平顯著。Different lowercase letters represent significant differences among different continuous cropping years at 0.05 level.

2.1.4.2 連作植煙土壤細(xì)菌的Alpha多樣性

覆蓋率(coverage)是指樣本中序列被檢測出的概率, 其值越高, 代表本次測序結(jié)果越符合樣本中微生物的實(shí)際情況。在本試驗(yàn)中, 連作4 a、6 a、8 a、14 a和16 a的烤煙土壤樣本的覆蓋率分別為97.0%、96.8%、98.4%、96.8%和97.5%, 表明測序讀長可以進(jìn)行此項(xiàng)分析。從圖1可知, 隨連作年限增加, 各處理Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈降低趨勢, 其中連作4 a、6 a和8 a處理間差異不顯著, 連作14 a后, 兩者則顯著降低; 對于ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)而言, 連作4 a和6 a處理顯著高于其他處理, 連作16 a處理最低, 且顯著低于其他處理, 總體而言, 表現(xiàn)出隨連作年限增加而降低的趨勢。以上結(jié)果表明, 連作導(dǎo)致烤煙土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性降低, 且連作年限越長降低越明顯。

圖1 不同連作年限植煙土壤細(xì)菌群落的Shannon、Simpson、ACE和Chao1指數(shù)

不同小寫字母代表不同連作年限在5%水平顯著。Different lowercase letters represent significant differences among different continuous cropping years at 0.05 level.

2.2 基于Mantel Test的酚酸類物質(zhì)與土壤主要環(huán)境因子關(guān)系分析

2.2.1 酚酸類物質(zhì)與土壤主要環(huán)境因子的Mantel Test結(jié)果比較

以酚酸類物質(zhì)為一矩陣, 分別與其他土壤環(huán)境因子進(jìn)行Mantel Test分析, 可以得出酚酸類物質(zhì)與其他環(huán)境因子之間的相關(guān)性。從結(jié)果(圖2)看, 酚酸類物質(zhì)與土壤理化性狀、酶活性以及細(xì)菌豐度之間的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平, 且與理化性狀的相關(guān)性顯著高于酶活性、細(xì)菌豐度。表明酚酸類物質(zhì)與各環(huán)境因子之間具有顯著的相關(guān)性, 且與土壤理化性狀相關(guān)性最高。

圖2 連作植煙土壤酚酸類物質(zhì)與環(huán)境因子相關(guān)性

**表示在0.01水平顯著相關(guān)。** indicates significant correlation at 0.01 level.

2.2.2 各酚酸類物質(zhì)與土壤主要環(huán)境因子的Mantel Test結(jié)果比較

分別將各種酚酸類物質(zhì)作為一個(gè)矩陣, 依次與土壤理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度做Mantel Test, 可以得出各酚酸類物質(zhì)分別與三者的相關(guān)性。結(jié)果表明, 除苯甲酸外, 其余酚酸類物質(zhì)與土壤主要環(huán)境因子之間的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平。其中, 與土壤理化性狀相關(guān)性最高的前4位酚酸類物質(zhì)依次為對羥基苯甲酸、肉桂酸、間苯三酚、闊馬酸; 與酶活性相關(guān)性最高的前4位依次為肉桂酸、闊馬酸、對羥基苯甲酸和香蘭素; 與細(xì)菌豐度相關(guān)性最高的前4位依次為闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素。各酚酸類物質(zhì)與土壤主要環(huán)境因子之間的相關(guān)性有一定的差異, 總體來看, 各酚酸類物質(zhì)與土壤理化性狀之間的相關(guān)性較高, 其次為細(xì)菌豐度(圖3)。

2.2.3 受環(huán)境因子影響較大的酚酸類物質(zhì)的確定

根據(jù)2.2.2結(jié)果, 分別取與理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度相關(guān)性最高的前4種酚酸類物質(zhì)做韋恩圖, 發(fā)現(xiàn)與這三者相關(guān)性均較高的酚酸為對羥基苯甲酸和闊馬酸(圖4), 說明理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度對對羥基苯甲酸和闊馬酸含量的影響最大。

3 討論

前人對茄子()[9]、大豆[10]、蘋果()[41]和草莓()[42]的連作土壤研究表明, 酚酸類物質(zhì)在連作土壤中積累并在某種程度上導(dǎo)致了連作障礙的發(fā)生。此類研究在植煙土壤中涉及較少, 大都以植煙土壤浸提液為研究對象, 證明土壤浸提液中具有自毒物質(zhì), 但未明確自毒物質(zhì)的種類和含量[21-22]。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上, 利用高效液相色譜法在不同連作年限植煙土壤中均檢測出8種酚酸類物質(zhì), 分別為間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸。隨連作年限增加, 間苯三酚含量依次顯著升高; 闊馬酸和阿魏酸含量在連作小于8 a時(shí)積累并不明顯, 但連作達(dá)到14 a后則表現(xiàn)出顯著的積累趨勢; 除連作8 a處理外, 對羥基苯甲酸和香草酸含量隨連作年限增加依次呈顯著積累趨勢?？傮w而言, 長期連作導(dǎo)致植煙土壤間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素和阿魏酸含量出現(xiàn)富集效應(yīng), 且連作年限越長富集效應(yīng)越明顯, 這可能是長期的連作降低了微生物對這類酚酸的降解能力導(dǎo)致的。苯甲酸和肉桂酸含量隨連作年限增加呈先升高后降低趨勢, 且峰值出現(xiàn)在連作8 a處理, 原因可能是連作初期導(dǎo)致苯甲酸和肉桂酸積累, 而后長期的連作改變了微生物群落結(jié)構(gòu), 使降解這兩種物質(zhì)的菌群增加。結(jié)合植煙土壤酚酸類物質(zhì)總含量變化趨勢并綜合分析各酚酸類物質(zhì)含量變化情況可知, 長期連作導(dǎo)致植煙土壤酚酸物質(zhì)積累, 進(jìn)一步驗(yàn)證了酚酸類物質(zhì)在連作障礙中扮演重要角色。

圖3 基于Mantel Test的連作植煙土壤酚酸類物質(zhì)與土壤環(huán)境因子相關(guān)性

**表示在0.01水平顯著相關(guān)。P: 間苯三酚; HA: 闊馬酸; PA: 對羥基苯甲酸; VA: 香草酸; V: 香蘭素; FA: 阿魏酸; BA: 苯甲酸; CA: 肉桂酸; A: 總量。** indicates significant correlation at 0.01 level.P: phloroglucinol; HA: caramelic acid; PA: p-hydroxybenzoic acid; VA: vanillic acid; V: vanillin; FA: ferulic acid; BA: benzoic acid; CA: cinnamic acid; A: total amount.

圖4 連作植煙土壤中與土壤環(huán)境因子相關(guān)性最高的前4種酚酸類物質(zhì)的韋恩圖

A: 理化性狀; B: 酶活性; C: 細(xì)菌門水平相對豐度。A: soil physic-chemical properties; B: soil enzyme activity; C: relative abundances of bacterial phyla.

連作導(dǎo)致土壤酶活性變化、理化性狀惡變和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性改變[3-7], 本研究也得出相似結(jié)論。隨連作年限增加, 4種酶活性的變化趨勢均為先升高后降低, 且酶活性峰值出現(xiàn)在不同年限, 原因可能是由于連作未達(dá)到酶活性峰值年限時(shí), 表層土壤中煙株和根系殘留物逐年積累, 為酶提供了足夠的底物, 酶活性升高, 連作超過酶活性峰值年限后, 土壤中病菌和有毒物質(zhì)等的積累, 導(dǎo)致酶活性降低。綜合以上分析可知, 長期的連作導(dǎo)致土壤酶活性先升高后降低。目前普遍認(rèn)為, 土壤理化性狀的改變是導(dǎo)致作物連作障礙發(fā)生的主要原因之一[3]。本研究中, 隨烤煙連作年限增加, 植煙土壤pH呈顯著下降趨勢, 表明連作導(dǎo)致植煙土壤酸化, 酸化的土壤為病原菌提供了滋生條件, 形成了連作障礙發(fā)生的一個(gè)因子; 除連作16 a處理外, 水解性氮和有效磷含量隨連作年限增加呈下降趨勢; 隨連作年限增加, 土壤有機(jī)質(zhì)含量呈降低趨勢而速效鉀含量呈升高趨勢, 土壤鉀含量激增可能是烤煙為喜鉀作物, 在生產(chǎn)上人為追加了過量的硫酸鉀導(dǎo)致的, 過量的K+又與Ca2+、Mg2+等陽離子交換, 進(jìn)一步導(dǎo)致土壤板結(jié), 使有機(jī)質(zhì)含量下降, 進(jìn)而加劇了連作障礙的發(fā)生。本研究表明, 連作6 a以下的植煙土壤優(yōu)勢菌群相似, 主要分布在變形菌門、擬桿菌門和放線菌門, 連作8 a后的細(xì)菌群落組成則差異較大, 除變形菌門外, 其余優(yōu)勢菌群則不盡相同, 且不同菌門的豐度在不同處理間下降或升高的趨勢也有一定的差異, 表明短期連作(6 a以下)對植煙土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響不是很大, 但連作達(dá)到一定年限時(shí)(8 a以上)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)則發(fā)生劇變; 從Alpha多樣性指數(shù)上來看, 連作4 a、6 a和8 a處理的Shannon 指數(shù)和Simpson變化不明顯, 而連作14 a和16 a處理則顯著下降, 表明長期連作導(dǎo)致細(xì)菌豐富度明顯降低, 對于ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)而言, 隨連作年限增加呈顯著下降趨勢, 表明連作導(dǎo)致植煙土壤細(xì)菌多樣性降低。以上結(jié)果表明, 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、菌群豐度和多樣性的改變也是造成連作障礙的原因之一?？傮w而言, 長期連作導(dǎo)致植煙土壤酶活性發(fā)生變化、土壤酸化、養(yǎng)分失衡和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化以及菌群豐度和多樣性降低。

前人研究表明, 酚酸類物質(zhì)與土壤理化性狀之間具有顯著相關(guān)關(guān)系[43], 而土壤酶活性與土壤養(yǎng)分之間互相影響[44], 可以推測酚酸物質(zhì)與酶活性之間具有一定的相關(guān)關(guān)系; 酚酸物質(zhì)可以為土壤微生物提供碳、氮源, 因此, 土壤中微生物的數(shù)量和種類直接影響著土壤酚酸的含量[45]。綜合以上分析可以推測, 植煙土壤酚酸物質(zhì)的含量受理化性狀、酶活性和細(xì)菌多樣性的影響, 但由于研究方法和手段的限制, 前人并未對4者的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行探討[21-22]。本研究通過Mantel Test方法明確植煙土壤酚酸類物質(zhì)與理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度的相關(guān)關(guān)系, 研究結(jié)果對進(jìn)一步明確酚酸類物質(zhì)在連作土壤中的積累特征以及與環(huán)境因子的關(guān)系具有重要作用, 同時(shí)對今后開展酚酸類物質(zhì)與環(huán)境因子的相互作用研究也提供了一定的理論依據(jù)。從分析結(jié)果來看, 理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度與酚酸類物質(zhì)的相關(guān)性均為極顯著, 其中土壤理化性狀與酚酸類物質(zhì)相關(guān)性最高, 其次為細(xì)菌豐度, 酶活性相關(guān)性最低, 說明植煙土壤中酚酸類物質(zhì)含量受這3者影響, 且理化性質(zhì)影響較大, 表明土壤理化性狀、酶活性和細(xì)菌多樣性的改變可能是導(dǎo)致酚酸類物質(zhì)積累的原因之一。從單個(gè)酚酸與環(huán)境因子的Mantel Test結(jié)果上來看, 除苯甲酸外, 各酚酸類物質(zhì)與土壤主要環(huán)境因子之間均具極顯著相關(guān)關(guān)系, 其中理化性狀與對羥基苯甲酸、肉桂酸、間苯三酚和闊馬酸的相關(guān)性較高; 酶活性與肉桂酸、闊馬酸、對羥基苯甲酸和香蘭素相關(guān)性較高; 細(xì)菌豐度與闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸和香蘭素相關(guān)性較高。綜合以上分析并結(jié)合韋恩圖可知, 3種土壤環(huán)境因子均與對羥基苯甲酸和闊馬酸的相關(guān)性較高, 說明這兩種酚酸含量受土壤環(huán)境因子影響較大, 因此, 在今后對酚酸類物質(zhì)的研究中, 可側(cè)重對對羥基苯甲酸和闊馬酸的研究。以上結(jié)果從統(tǒng)計(jì)分析的角度闡述了酚酸類物質(zhì)與酶活性、理化性狀和細(xì)菌多樣性之間的相關(guān)關(guān)系, 為通過外源添加酚酸等方式進(jìn)一步驗(yàn)證土壤各環(huán)境因子對其的影響提供了一定的理論依據(jù), 豐富了酚酸類物質(zhì)在烤煙連作障礙中的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

1)連作導(dǎo)致植煙土壤酚酸類物質(zhì)積累, 土壤酸化和養(yǎng)分失衡, 酶活性先升高后降低, 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變以及菌群豐度和多樣性降低。

2)Mantel Test分析表明, 植煙土壤理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度與酚酸類物質(zhì)具有極顯著相關(guān)性, 且理化性狀相關(guān)性最高。

3)相對于其他酚酸類物質(zhì)而言, 植煙土壤理化性狀、酶活性和細(xì)菌豐度對對羥基苯甲酸和闊馬酸的影響最大。

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Correlation analysis of main environmental factors and phenolic acids in continuous tobacco cropping soils using Mantel Test*

BAI Yuxiang1, YANG Chengcui1, SHI Puyou1, JIA Meng1, YANG Huanwen1, XU Zhaoli2, WANG Ge1**

(1. College of Tobacco Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Yunnan Academy of Tobacco Science, Kunming 650021, China)

Flue-cured tobacco is a crop sensitive to continuous cropping. Continuous cropping over the long-term has seriously affected growth and production quality of flue-cured tobacco by affecting the soil environment. Phenolic acids can cause growth disorders under continuous cropping. Although the interaction between phenolic acids and other environmental factors after entering the soil environment has not much been investigated, it is clear that phenolic acids occur in soils under continuous tobacco cropping. The action process and the role in limiting continuous cropping are critical for successful tobacco cultivation. An experiment was conducted to determine the relationship between phenolic acids and soil environmental factors in the soil by analyzing the correlation between various environmental factors and phenolic acids in soil. The purpose was to identify the environmental factors affecting the concentration of phenolic acids in soils under continuous cropping systems. Soils of four tobacco fields with different durations of continuous cropping (4 a, 6 a, 8 a, 14 a and 16 a) were sampled. The changes in phenolic acids, physical and chemical properties, enzyme activities and bacterial diversities in soils under different continuous cropping years of tobacco were investigaed. The correlation between phenolic acids and soil environmental factors was analyzed using the Mantel Test. The results showed that long-term continuous cropping of tobacco resulted in an increase in soil phenolic acids content. Higher pH of soil under tobacco continuous cropping resulted in low soil organic matter content, but increased available potassium. The activities of catalase, urease acid phosphatase, and invertase first increased and then later decreased. When continuous cropping for less than 6 years, bacterial community structure changed little. However, bacterial community structure changed significantly after 8 years of continuous cropping. In general, continuous cropping changed bacterial community structure and reduced community diversity. Mantel Test analysis showed that phenolic acid content was significantly correlated with enzymes activities and physical and chemical properties of soil. Bacterial abundance had the highest correlation with soil physical and chemical properties. There were differences in correlation between different phenolic acids and soil environmental factors. P-hydroxybenzoic acid and phoronic acid had the highest correlation with physical and chemical properties of soil, enzyme activity and bacterial abundance in soils. Therefore, phenolic acids in soils under continuous tobacco cropping obviously accumulated over time with deteriorated soil environment. The accumulation of phenolic acids was affected by soil physical, chemical and biological properties of soil. P-hydroxybenzoic acid and tartaric acid were two kind phenolic acids most affected.

Flue-cured tobacco;Continuous cropping; Phenolic acid; Soil environmental factor; Mantel Test

, E-mail: wangge302@126.com

Jul. 27, 2018;

Oct. 15, 2018

S572; S154.1

A

2096-6237(2019)03-0369-11

10.13930/j.cnki.cjea.180703

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* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31860357)、云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015FB145)、云南省研究生學(xué)術(shù)新人獎(jiǎng)(A2008057)和云南煙用有機(jī)肥養(yǎng)分資源利用研究(2017YN07)資助

王戈, 主要從事煙草栽培生理生化研究。E-mail: wangge302@126.com

白羽祥, 主要從事煙草生理生化研究。E-mail: cotsbyx@163.com

2018-07-27

2018-10-15

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31860357), the Applied Basic Research Project of Yunnan Province (2015FB145), the Graduate Scholar Newcomer Award of Yunnan Province (A2008057) and the Study on Utilization of Organic Fertilizer of Tobacco in Yunnan Province (2017YN07).