黃土高原旱地麥田26年免耕覆蓋對(duì)土壤肥力及原核微生物群落多樣性的影響*

張貴云, 呂貝貝, 張麗萍, 劉 珍, 范巧蘭, 魏明峰, 姚 眾, 袁嘉瑋, 柴躍進(jìn)

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黃土高原旱地麥田26年免耕覆蓋對(duì)土壤肥力及原核微生物群落多樣性的影響*

張貴云1, 呂貝貝1, 張麗萍1, 劉 珍1, 范巧蘭1, 魏明峰1, 姚 眾1, 袁嘉瑋1, 柴躍進(jìn)2

(1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 運(yùn)城 044000; 2. 山西省臨汾市農(nóng)機(jī)局 臨汾 041000)

為明確黃土高原旱作麥田長(zhǎng)期保護(hù)性耕作對(duì)土壤肥力和土壤原核微生物的效應(yīng), 以位于山西省臨汾市實(shí)施保護(hù)性耕作26年的小麥田為試驗(yàn)基地, 采用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序等手段, 開展了不同耕作措施[免耕覆蓋(NTS)、深松免耕覆蓋(SNTS)和傳統(tǒng)耕作(TT1)]對(duì)土壤理化性質(zhì)和土壤原核微生物多樣性的影響分析。研究結(jié)果表明: 1)NTS和SNTS處理比TT1處理顯著提高了土壤全氮、堿解氮、速效磷及速效鉀的含量, 降低了土壤pH, 提高了土壤貯水能力和水分含量, 降低了0~10 cm土層的土壤容重, 但提高了10~20 cm土層的土壤容重; 同時(shí), SNTS處理顯著增加了土壤的有機(jī)質(zhì)含量。2)Illumina Hiseq高通量16S rRNA基因V4區(qū)測(cè)序結(jié)果表明: NTS和SNTS處理比TT1處理顯著降低了綠彎菌門的相對(duì)豐度; NTS比SNTS處理顯著降低了土壤中疣微菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度; NTS處理顯著增加了土壤原核微生物群落的多樣性, 但未顯著改變?cè)宋⑸锶郝涞呢S度; SNTS對(duì)原核微生物群落的多樣性和豐富度均未有顯著改變; NTS處理的顯著性差異物種(Biomarker)高于其他2個(gè)處理; 其他原核微生物門的相對(duì)豐度, 在3個(gè)處理間尚未有明顯差異。3)聚類分析可見: NTS和SNTS處理與TT1處理的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大; NTS處理與SNTS處理間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較小。4)CCA分析可知: 土壤pH、有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀含量對(duì)土壤原核微生物群落遺傳多樣性的變化起著重要作用; 與TT1處理相比, NTS和SNTS處理在一定程度上改變了土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu), 但仍存在結(jié)構(gòu)的相似性。綜上所述, 長(zhǎng)期進(jìn)行NTS和SNTS處理對(duì)黃土高原旱地麥田土壤微生物多樣性、豐富度以及土壤肥力因子等的正效作用明顯。

保護(hù)性耕作; 免耕覆蓋; 深松免耕; 高通量測(cè)序; 土壤原核微生物

保護(hù)性耕作是以秸稈覆蓋還田、農(nóng)田免耕或少耕、施肥、播種等復(fù)式作業(yè)為主要內(nèi)容的一種新型旱作機(jī)械化耕作方式[1-2]。與傳統(tǒng)耕作方式相比, 保護(hù)性耕作不僅省工、省力、減少投入, 而且可減少水土流失, 保持土層結(jié)構(gòu), 改善土壤理化性質(zhì), 促進(jìn)微生物的繁殖[3-5]。研究表明, 不同類型生境中, 微生物的群落組成存在明顯差異[6], 耕作方式不同, 土壤環(huán)境也會(huì)不同, 進(jìn)而引起土壤微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變[7]。Yan等[8]對(duì)耕作和免耕變性土微生物群落功能多樣性的研究顯示, 免耕比傳統(tǒng)耕作更有利于增加土壤微生物多樣性。李彤等[9]研究發(fā)現(xiàn)西北地區(qū)旱作麥田采用保護(hù)性耕作, 可以影響土壤微生物群落豐度, 并顯著影響土壤理化性質(zhì), 進(jìn)而影響土壤微生物空間結(jié)構(gòu)。

20世紀(jì)60年代保護(hù)性耕作傳入我國(guó)[10], 由于其能夠增加土壤蓄水, 增強(qiáng)土壤抗旱能力, 提高作物產(chǎn)量, 降低生產(chǎn)成本等, 在我國(guó)北方旱地得到了廣泛應(yīng)用[11]。為提高我國(guó)北方干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平, 1992年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)和山西省農(nóng)機(jī)局受澳大利亞國(guó)際農(nóng)業(yè)研究中心資助, 在山西省臨汾市開展了旱地保護(hù)性耕作體系研究。張貴云等[12]以該試驗(yàn)基地為平臺(tái), 開展了長(zhǎng)期保護(hù)性耕作對(duì)叢枝菌根真菌多樣性的影響研究, 結(jié)果表明, 保護(hù)性耕作提高了叢枝菌根真菌(AMF)多樣性, 且深松與免耕相結(jié)合的保護(hù)性耕作方式, 更有利于提高土壤AMF多樣性。土壤細(xì)菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的部分, 參與多種土壤生理生化過程, 如土壤有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)等, 土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康與土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化有很大關(guān)系[13-14], 因而對(duì)土壤微生物的研究尤其是原核微生物群落結(jié)構(gòu)的研究尤為重要。近年來, 人們運(yùn)用高通量手段研究土壤微生物的技術(shù)日趨成熟, 這為深入分析微生物資源提供了可能[15]。

高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的一次革命性創(chuàng)新[16], 其產(chǎn)生的16S rRNA基因的測(cè)序數(shù)據(jù), 覆蓋深度高, 可以用來估計(jì)微生物群落的物種組成, 能更真實(shí)地揭示環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜度和多樣性[17]。目前為止, 國(guó)內(nèi)外有關(guān)保護(hù)性耕作田土壤微生物多樣性的研究有了一定的報(bào)道, 但是黃土高原旱作麥田長(zhǎng)期保護(hù)性耕作對(duì)土壤原核微生物群落的影響, 尚鮮見研究報(bào)道。本研究以山西臨汾旱地實(shí)施保護(hù)性耕作26年的小麥田為試驗(yàn)平臺(tái), 采用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序土壤16S rDNA, 結(jié)合土壤質(zhì)量環(huán)境因子的典型相關(guān)分析(CCA), 對(duì)不同保護(hù)性耕作措施對(duì)土壤原核微生物群落和土壤環(huán)境的影響進(jìn)行研究, 探尋保護(hù)性耕作技術(shù)應(yīng)用的新理論和新策略, 為在微生物水平上研究黃土高原旱作地區(qū)保護(hù)性耕作技術(shù)提供重要理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

試驗(yàn)基地位于山西省臨汾市堯都區(qū)城隍村(36°01￠53″N, 111°37￠46″E, 海拔555 m)。試驗(yàn)區(qū)域年平均氣溫12.2 ℃, 年0 ℃以上積溫4 600 ℃, 無霜期195 d, 年平均地溫13.8 ℃。年均降水量515.7 mm, 且均集中在7—9月份; 年均蒸發(fā)量1 933.1 mm。土壤類型為碳酸鹽褐土, 試驗(yàn)地種植制度為長(zhǎng)期單一種植冬小麥()。

1.2 耕作處理方式

2017年5月, 借助1992年在山西省臨汾市開始的保護(hù)性耕作體系長(zhǎng)期定位試驗(yàn)[18], 開展了黃土高原旱作麥田長(zhǎng)期保護(hù)性耕作對(duì)土壤原核微生物群落多樣性及土壤肥力的影響研究。本試驗(yàn)選擇26年的免耕覆蓋(NTS)、連續(xù)深松覆蓋4年后免耕22年的免耕覆蓋(SNTS)以及26年的傳統(tǒng)耕作(TT1)3種耕作處理方式。其中, NTS為全年不耕作, 播種時(shí)用免耕播種機(jī)一次性完成施肥和播種, 收獲后將各小區(qū)秸稈粉碎全覆蓋; SNTS是深松(深度約40 cm)后, 進(jìn)行長(zhǎng)期的免耕覆蓋處理; TT1是小麥?zhǔn)斋@后用鏵式犁耕翻(深度約25 cm), 無秸稈覆蓋, 播前旋耕(深度約15 cm)整地。各處理重復(fù)3次, 每小區(qū)面積為600 m2。試驗(yàn)地?zé)o灌溉條件, 作物靠自然降水生長(zhǎng)。播種時(shí)間: 2016年9月25日, 小麥品種為‘長(zhǎng)6359’, 播種量為120 kg·hm-2。試驗(yàn)田化肥使用量:尿素為225 kg·hm-2, 磷酸二銨為150 kg·hm-2。

1.3 土壤樣品采集

于2017年5月8日(小麥灌漿期)采取小麥根際土樣, 每小區(qū)隨機(jī)選3點(diǎn), 每個(gè)樣點(diǎn)先去掉表土, 再?gòu)?~20 cm土層取小麥根際土樣, 每點(diǎn)采集3份土樣均勻混合成一個(gè)樣品。將所采集的土樣分為兩部分, 一部分保存于滅菌的塑封袋中, 于低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室, 保存于-80 ℃冰箱中用于提取DNA, 供土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析; 另一部分保存于普通塑封袋中, 帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干, 根據(jù)試驗(yàn)需要分別過18目、100目篩子用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。土壤水分和容重指標(biāo)則分別取自同一樣點(diǎn)0~10 cm、10~20 cm土層。

1.4 測(cè)定方法

土壤理化性質(zhì)測(cè)定: pH采用1∶2.5土水比浸提酸度計(jì)法, 土壤水分采用烘干法, 土壤容重采用環(huán)割法, 有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法—稀釋熱法, 全氮采用半微量開氏法, 堿解氮采用堿解擴(kuò)散法, 速效磷采用0.5 mol×L-1NaHCO3法, 速效鉀采用NH4OAc浸提—火焰光度法測(cè)定[19]。

土壤總DNA的提取及16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增: 土壤總DNA基因組的提取采用DNA提取試劑盒進(jìn)行。采用引物515F(5￠-GTGCCAGCMGCCGC-GGTAA-3￠)和806R(5￠-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3￠)擴(kuò)增土壤微生物16S rRNA基因V4區(qū)。30 μL PCR反應(yīng)體系: Phusion Master Mix (New England Biolabs, 2×)15 μL, Primer (2 μmol×L-1) 3 μL, Genomic DNA (1 ng×μL-1) 10 μL, dd H2O 2 μL。PCR反應(yīng)條件: 98 ℃預(yù)變性1 min; 98 ℃ 10 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30個(gè)循環(huán); 72 ℃, 5 min。每個(gè)樣本3次重復(fù), 根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣, 充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物, 選擇主帶大小在400~450 bp之間的序列, 割膠回收目標(biāo)條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒。

原核微生物16S rRNA基因V4區(qū)高通量測(cè)序: 經(jīng)純化檢測(cè)之后的土樣送至北京諾禾致源科技股份有限公司, 進(jìn)行基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的混樣和純化, 使用New England Biolabs公司的NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后, 使用Illumina公司的HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái), 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

運(yùn)用Uparse軟件對(duì)序列進(jìn)行聚類, 以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs。采用軟件RDP classifier進(jìn)行物種分類。分別在門(phylum)和屬(genus)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成, 并對(duì)OTU進(jìn)行生態(tài)學(xué)分析, 使用Qiime軟件計(jì)算土壤物種相對(duì)豐度、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)等, 使用R軟件繪制稀釋曲線。對(duì)OTUs進(jìn)行多序列比對(duì), 用Qiime軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹, 獲得不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異, 通過UPGMA樣品聚類樹進(jìn)行展示。選用LEfSe統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。同時(shí), 進(jìn)行CCA分析和多樣性指數(shù)與環(huán)境因子間的相關(guān)性分析, 得到顯著影響組間群落變化的環(huán)境因子。

采用SPSS 20.0對(duì)土壤理化數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 使用R語(yǔ)言分析微生物多樣性數(shù)據(jù), 運(yùn)用Canoco軟件進(jìn)行環(huán)境因子對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)性耕作措施對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可以看出, 在0~20 cm土層土壤中, NTS和SNTS 2個(gè)處理的土壤全氮、堿解氮、速效磷及速效鉀含量均顯著高于TT1處理, 而其pH顯著低于TT1, SNTS處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著高于NTS和TT1處理。TT1處理的土壤含水量和容重與其他處理間差異均顯著, NTS和SNTS處理間差異不顯著, 3個(gè)處理土壤含水量依次為NTS>SNTS>TT1; 0~10 cm土層土壤容重依次為TT1>NTS>SNTS, 10~20 cm土層土壤容重為NTS>SNTS>TT1。結(jié)果顯示, 保護(hù)性耕作與傳統(tǒng)耕作相比, 顯著提高了土壤中的全氮、堿解氮、速效磷及速效鉀的含量, 顯著降低了土壤pH, 且深松免耕處理顯著增加了土壤有機(jī)質(zhì)的含量; 同時(shí), 保護(hù)性耕作還可以增加土壤貯水能力, 提高土壤水分含量, 降低0~10 cm土層的土壤容重, 但提高10~20 cm土層的土壤容重。

表1 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤的理化性質(zhì)

同列數(shù)字后不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)。NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at 0.05 level. NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

2.2 土壤樣品測(cè)序深度及合理性分析

為檢測(cè)樣本的數(shù)據(jù)量是否合理, 從樣品中隨機(jī)抽取一定測(cè)序量的數(shù)據(jù), 統(tǒng)計(jì)它們所代表物種數(shù)目(即OTUs數(shù)目), 以抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量與對(duì)應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建稀釋曲線, 不同耕作方式土壤樣品原核微生物稀釋曲線見圖1。由圖1可知, 隨著測(cè)序量的增加, 原核微生物稀釋曲線逐漸趨于平坦, 但尚未達(dá)到飽和, 更多的測(cè)序量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU, 表明本次試驗(yàn)的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理, 能夠較真實(shí)地反映這3組土壤樣品的原核微生物群落, 說明測(cè)序結(jié)果包含了大多數(shù)原核微生物類群, 基本可以反映不同耕作下土壤生境中原核微生物群落結(jié)構(gòu)與組成, 但仍有少量的原核微生物種類未被發(fā)現(xiàn)。

2.3 保護(hù)性耕作措施對(duì)土壤原核微生物物種豐度的影響

不同處理土壤原核微生物種類OTU數(shù)量關(guān)系韋恩圖如圖2所示, 3個(gè)處理共產(chǎn)生9 235個(gè)OTU, 共同包含的OTU個(gè)數(shù)為4 466, 占總OTU數(shù)量的48.36%。其中, NTS共得到7 257個(gè)OTU, SNTS共得到6 547個(gè)OTU, TT1共得到6 384個(gè)OTU。NTS中特有的OTU為1 314個(gè), 占總OTU數(shù)量的14.23%; SNTS中特有的OTU為732個(gè), 占總OTU數(shù)量的7.93%; TT1中特有的OTU為702個(gè), 占總OTU數(shù)量的7.60%。表明3個(gè)處理原核微生物的群落結(jié)構(gòu)差異較大。分別將3組兩兩比較發(fā)現(xiàn), TT1和NTS共有的OTU為5 138個(gè), TT1和SNTS共有的OTU最少, 為5 010個(gè), NTS和SNTS共有的OTU最多, 為5 271個(gè)。

圖1 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤原核微生物稀釋曲線

NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

圖2 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤原核微生物Venn圖

NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

2.4 保護(hù)性耕作措施對(duì)土壤原核微生物群落組成及相對(duì)豐度的影響

門分類水平上, 不同耕作方式下原核微生物群落組成及相對(duì)豐度見圖3。從圖3可知, 3個(gè)處理土壤原核微生物群落在門水平上的組成基本相同, 但平均相對(duì)豐度所占比例略有差異。各處理中原核微生物類群相對(duì)豐度排名前10的有變形菌門(Proteobacteria, 占31.45%)、酸桿菌門(Acidobacteria, 占16.51%)、放線菌門(Actinobacteria, 占14.94%)、厚壁菌門(Firmicutes, 占3.69%)、擬桿菌門(Bacteroidetes, 占8.74%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes, 占6.51%)、浮霉菌門(Planctomycetes, 占3.09%)、奇古菌門(Thaumarchaeota, 占2.87%)、疣微菌門(Verrucomicrobia, 占3.08%)、綠彎菌門(Chloroflexi, 占2.65%), 它們占總類群的92.43%~93.84%。其中, 變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為明顯優(yōu)勢(shì)菌群, 分別占3個(gè)處理平均相對(duì)豐度10%以上, NTS處理3次重復(fù)平均相對(duì)豐度分別為34.24%、13.23%、14.06%, SNTS處理分別為28.02%、18.48%、17.02%, TT1處理分別為32.07%、17.83%、13.73%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示, 3個(gè)處理中優(yōu)勢(shì)菌門平均相對(duì)豐度均未達(dá)到顯著性差異水平(0.05)。其他7個(gè)菌門的平均相對(duì)豐度較低, 所占比例均小于10.0%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示, 除疣微菌門在NTS和SNTS處理中平均相對(duì)豐度達(dá)到顯著差異水平(0.05), 綠彎菌門在NTS和SNTS、NTS和TT1處理中平均相對(duì)豐度達(dá)到顯著差異水平(0.05)外, 厚壁菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、奇古菌門在3個(gè)處理中均未有明顯差異。此外, 還有6.47%的原核微生物類群未被分類。結(jié)果表明, 與傳統(tǒng)耕作相比, 免耕顯著降低了綠彎菌門的相對(duì)豐度; 與深松免耕相比, 免耕顯著降低了土壤中疣微菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度, 其他原核微生物門的相對(duì)豐度在3個(gè)處理間尚未有明顯差異。

圖3 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤原核微生物群落在門水平上的組成及相對(duì)豐度

NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

屬水平上, 不同耕作方式下原核微生物群落的組成及相對(duì)豐度如圖4所示。在屬水平上, 3個(gè)處理中原核微生物類群的平均相對(duì)豐度均小于5.0%, 其中RB41屬是3個(gè)處理共同的優(yōu)勢(shì)菌群(占3.26%), 在TT1處理中的相對(duì)豐度最高, 未被分類的原核微生物類群占到86.02%。在3種處理的土壤樣品中, 未分類的原核微生物成了第一大類群, 說明隨著分類的細(xì)化, 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中可用信息量越來越少, 同時(shí)也說明土壤中含有一定數(shù)量的潛在原核微生物類群。

圖4 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤原核微生物群落在屬水平上的組成及相對(duì)豐度

TT1: 傳統(tǒng)耕作; NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋。TT1: traditional tillage; NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

使用Qiime軟件計(jì)算Unifrac距離, 并基于Weighted Unifrac方法構(gòu)建UPGMA樣品聚類樹, 對(duì)3個(gè)處理的土壤原核微生物群落構(gòu)成的相似性進(jìn)行聚類分析, 并將聚類結(jié)果與各樣品在門水平上的物種相對(duì)豐度進(jìn)行整合展示(圖5)。結(jié)果表明, 3個(gè)處理可分為2大類, 其中NTS和SNTS處理的土壤原核微生物群落組成趨于一類, 在聚類關(guān)系上趨同性較強(qiáng), TT1處理單獨(dú)為一類。表明免耕土壤原核微生物種群結(jié)構(gòu)與深松免耕覆蓋并沒有明顯差異, 親緣關(guān)系較近, 說明深松4年之后免耕覆蓋22年土壤原核微生物種群結(jié)構(gòu)變化趨于免耕。

圖5 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤原核微生物群落相似性聚類樹

NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

2.5 保護(hù)性耕作措施對(duì)土壤原核微生物多樣性的影響

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表征物種的豐富度, 其值越高表明原核微生物群落的物種豐富度越高; Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征微生物多樣性程度, Shannon指數(shù)越高表明原核微生物群落的多樣性越高, Simpson指數(shù)與之相反; Coverage是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率[20-22]。

表2是不同耕作方式下土壤原核微生物的多樣性指數(shù)。從表2可以看出, 3個(gè)處理文庫(kù)覆蓋率均在98%以上, 能夠較為全面地反映不同耕作措施下土壤原核微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)。綜合豐富度指數(shù)Chao1和ACE以及多樣性指數(shù)Shannon和Simpson指數(shù), 3個(gè)處理土壤環(huán)境原核微生物群落多樣性由高到低排序?yàn)? NTS>SNTS>TT1。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果, 3個(gè)處理的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)差異不顯著。不同耕作處理對(duì)原核微生物群落的多樣性影響程度均不同, 與傳統(tǒng)耕作相比, 免耕顯著增加了土壤原核微生物群落的多樣性, 未顯著改變?cè)宋⑸锶郝涞呢S富度; 深松免耕處理對(duì)原核微生物群落的多樣性和豐富度均未有顯著改變。

表2 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤原核微生物群落的多樣性指數(shù)

同列數(shù)字后不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)。NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at 0.05 level. NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

2.6 不同耕作措施下土壤原核微生物群落組間差異性

通過LEfSe分析, 可以找出組間具有顯著差異的Biomarker, 以及顯著影響組間差異性的物種或群落[23]。不同耕作方式下土壤原核微生物群落組間差異LEfSe分析柱狀圖和進(jìn)化分支圖如圖6所示, 不同處理對(duì)應(yīng)不同的Biomarker, NTS處理的顯著性差異物種(Biomarker)最多, SNTS次之, TT1最少。在門水平上, TT1樣品中有1個(gè)主要門(疣微菌門)的細(xì)菌存在顯著差異, SNTS樣品中有1個(gè)主要門(奇古菌門)的古菌存在顯著差異, TT1樣品在門水平上無顯著差異。在屬水平上, SNTS中放線菌門的、變形菌門的共2屬的細(xì)菌存在顯著差異, NTS中變形菌門的、衣原體門的、擬桿菌門的共3屬的細(xì)菌存在顯著差異。

圖6 長(zhǎng)期不同耕作方式下土壤原核微生物群落處理間差異LEfSe分析圖(A)和進(jìn)化分支圖(B)

NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

圖7 門水平下長(zhǎng)期不同耕作處理的土壤原核微生物群落與土壤理化因子的典型對(duì)應(yīng)分析

TN、AN、AP、AK、OM分別代表土壤全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量。NTS: 免耕覆蓋; SNTS: 深松免耕覆蓋; TT1: 傳統(tǒng)耕作。TN, AN, AP, AK and OM represented total N, available N, available P, available K and organic matter, respectively. NTS: no-tillage with stubble; SNTS: no-tillage with stubble after subsoiling; TT1: traditional tillage.

2.7 土壤原核微生物群落組成與土壤環(huán)境因子的相關(guān)分析

土壤理化性質(zhì)的變化會(huì)直接或間接的影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成[24-25]。為分析不同耕作方式土壤生境中原核微生物群落與土壤環(huán)境因子特性間的關(guān)系, 以原核微生物群落在門水平上的相對(duì)豐度數(shù)據(jù)為物種數(shù)據(jù), 土壤理化數(shù)據(jù)為土壤環(huán)境變量, 采用Canoco軟件進(jìn)行了CCA, 其結(jié)果排序如圖7所示, 第1排序軸對(duì)土壤原核微生物群落變化解釋最多, 達(dá)62.35%; 第2排序軸僅解釋了原核微生物群落變化的23.75%, 前兩軸共解釋了原核微生物群落總變異的86.10%, 在對(duì)原核微生物群落變異的解釋中起主導(dǎo)作用。其中, pH(=0.968 5)、速效氮(=-0.836 8)、速效磷(=-0.898 4)、速效鉀(=-0.994 1)與第1排序軸相關(guān)性較高, 全氮(=-0.719 6)、有機(jī)質(zhì)(=-0.917 7)與第2排序軸相關(guān)性較高。結(jié)果表明, 土壤pH、有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀含量對(duì)土壤原核微生物群落遺傳多樣性的變化起著重要作用。3個(gè)處理樣本中, TT1.1、TT1.2、NTS.3相距較近, 說明這3個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu)相近, NTS.1、NTS.2、SNTS.2、TT1.3相距較近, 說明這4個(gè)樣本的群落結(jié)構(gòu)相近; NTS.1及NTS.2與NTS.3相距較遠(yuǎn), TT1.1及TT1.2與TT1.3相距較遠(yuǎn), SNTS.1、SNTS.2、SNTS.3相距較遠(yuǎn), 說明取樣過程中空間分布的不均勻及復(fù)雜性也會(huì)影響原核微生物的群落結(jié)構(gòu)。同時(shí), TT1的3個(gè)樣本與NTS.3、SNTS.1相距較遠(yuǎn), 說明這3組樣本之間群落結(jié)構(gòu)存在差異。結(jié)果表明, 與傳統(tǒng)耕作相比, 保護(hù)性耕作在一定程度上能夠改變土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu), 但仍存在結(jié)構(gòu)的相似性。

3 討論

不同耕作方式對(duì)土壤養(yǎng)分的影響有所不同[26]。Dolan等[27]和Filho等[28]研究發(fā)現(xiàn), 長(zhǎng)期免耕提高了土壤表層有機(jī)質(zhì)的含量。本研究結(jié)果表明, 長(zhǎng)達(dá)26年的免耕和深松免耕處理, 改變了0~20 cm土層的理化性質(zhì), 其中土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀含量相對(duì)于傳統(tǒng)耕作均有不同程度的提高, 這一結(jié)論與楊培培等[29]、李友軍等[30]研究結(jié)果一致, 說明保護(hù)性耕作能夠提高土壤肥力, 促進(jìn)作物生長(zhǎng)。戴亮[31]在不同耕作方式對(duì)土壤微生物及土壤固碳能力影響的研究中指出, 深松免耕同時(shí)兼具翻耕和免耕的優(yōu)點(diǎn), 可以降低土壤有機(jī)質(zhì)的礦化速率, 加深土壤腐殖質(zhì)化程度, 減緩?fù)寥烙袡C(jī)碳的損失。許菁等[32]通過5年的定位試驗(yàn), 開展了長(zhǎng)期保護(hù)性耕作對(duì)小麥-玉米()兩熟農(nóng)田土壤碳儲(chǔ)量及固碳潛力的影響研究, 結(jié)果表明, 秸稈翻入土壤后在很大程度腐解, 與無秸稈還田土壤有機(jī)碳儲(chǔ)量之間的差距逐漸拉大, 土壤碳儲(chǔ)量達(dá)到峰值, 說明不同耕作方式使秸稈在土壤中的腐解環(huán)境不同, 引起秸稈腐解速率的不同, 土壤中秸稈腐解程度隨時(shí)間的推進(jìn)而提高。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 長(zhǎng)期保護(hù)性耕作與傳統(tǒng)耕作相比, 免耕處理和深松免耕處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量也均有不同程度的提高, 且深松免耕優(yōu)于免耕, 前者顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)的含量, 較傳統(tǒng)耕作提高了61.50%, 可能因?yàn)樯钏擅飧龠M(jìn)了腐生菌增殖, 更有利于土壤有機(jī)質(zhì)的提高。

保護(hù)性耕作可以增加土壤的貯水能力, 提高土壤水分含量, 這是因?yàn)楸Ｗo(hù)性耕作在土壤表面覆蓋有作物殘茬, 與傳統(tǒng)耕作相比其地表裸露面積減少, 從而土壤水分蒸發(fā)減少, 提高了土壤蓄水保墑能力[33]。本研究表明, 保護(hù)性耕作顯著提高了黃土高原旱作小麥田土壤含水量, 有較明顯的優(yōu)勢(shì)。土壤容重是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)之一[34]。相關(guān)研究表明, 傳統(tǒng)翻耕的土壤容重大于保護(hù)性耕作[35], 本研究發(fā)現(xiàn)0~10 cm土層傳統(tǒng)耕作處理土壤容重高于免耕和深松免耕, 這與上述觀點(diǎn)相一致, 可能是由于保護(hù)性耕作措施增加了土壤的透氣性和有機(jī)質(zhì)含量, 在一定年限后有利于降低土壤容重[36]。而本研究3個(gè)處理10~20 cm和0~10 cm土層土壤容重變化規(guī)律不一致, 10~20 cm土層土壤容重變化表現(xiàn)為免耕處理高于傳統(tǒng)耕作和深松免耕, 與上述觀點(diǎn)不一致。趙洪利等[37]研究發(fā)現(xiàn), 免耕與深松、翻耕處理相比, 土壤容重增大, 和本研究10~20 cm土壤容重結(jié)論一致, 可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)進(jìn)行的長(zhǎng)期免耕處理無土壤耕作, 在長(zhǎng)達(dá)26年的降水和自身重力影響下, 使得10~20 cm土層的土壤容重大于深松免耕和傳統(tǒng)耕作處理。CCA結(jié)果表明, 土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性是多個(gè)土壤環(huán)境因子共同作用的結(jié)果, 其中pH、有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀含量對(duì)于研究區(qū)土壤原核微生物群落遺傳多樣性的變化起著重要作用, 說明土壤碳、氮等營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)原核微生物的多樣性有顯著影響[24]。

土壤微生物類群中, 以細(xì)菌居多, 通常能占到70%~90%, 其種類繁多、功能多樣, 具有最為豐富的遺傳多樣性[25,38]。不同耕作方式對(duì)土壤原核微生物群落結(jié)構(gòu)、種類、數(shù)量存在一定的影響, 采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤原核微生物16S rRNA基因的V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序分析, 結(jié)果表明, 3種處理在97%的相似度水平上, 共產(chǎn)生9 878種屬分類水平的原核微生物(OTUs), 此外測(cè)序還發(fā)現(xiàn)了許多未被分類的原核微生物, 需通過深度測(cè)序或利用其他先進(jìn)手段對(duì)微生物進(jìn)行更細(xì)致地分類研究。在門分類水平上, 土壤主要優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門, 其中變形菌門的豐度最高。這與Roesch等[39]對(duì)土壤微生物的研究相一致, 可能是因?yàn)樽冃尉T是細(xì)菌中最大的一個(gè)門, 且該試驗(yàn)基地土壤呈弱堿性, 而變形菌門則是堿性土壤中的主要優(yōu)勢(shì)菌群[40]。有研究報(bào)道曾指出, 變形菌門中的許多類群可起到固氮作用, 并能適應(yīng)各種復(fù)雜環(huán)境, 環(huán)境條件的變化對(duì)其分布和相對(duì)豐度影響不大[41], 本試驗(yàn)中變形菌門在3個(gè)處理間差異并不顯著, 這一結(jié)論與上述觀點(diǎn)相符合。

Doran[42]曾認(rèn)為, 免耕由于對(duì)土壤的機(jī)械擾動(dòng)較小, 土體基本處于一種相對(duì)厭氧的狀態(tài), 土壤微生物的數(shù)量及活性維持在相對(duì)穩(wěn)定水平, 進(jìn)而可能導(dǎo)致了土體芽孢細(xì)菌數(shù)量上升。Liu等[43]曾認(rèn)為, 土壤擾動(dòng)會(huì)降低土壤微生物的多樣性和活性。Bending等[44]曾認(rèn)為, 秸稈或根茬還田能提高土壤微生物的多樣性。本研究結(jié)果表明不同耕作措施對(duì)土壤原核微生物的多樣性影響均不同, 總體表現(xiàn)出保護(hù)性耕作高于傳統(tǒng)耕作, 且免耕覆蓋顯著提高了土壤原核微生物群落的豐富度和多樣性, 這一結(jié)論與上述觀點(diǎn)相符合?？赡苁且?yàn)榻斩掃€田腐解過程中的部分產(chǎn)物, 如糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素及有機(jī)酸、酚類等, 為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了豐富營(yíng)養(yǎng); 另一方面, 保護(hù)性耕作能改善土壤結(jié)構(gòu), 增加土壤透氣性, 土壤微生物種類隨之增加, 從而引起土壤原核微生物多樣性的增加[45-46]。表明長(zhǎng)期保護(hù)性耕作對(duì)提高土壤原核微生物群落豐富度和多樣性更有利, 免耕可能會(huì)更有效地為當(dāng)季作物提供養(yǎng)分[7]。

4 結(jié)論

黃土高原旱作區(qū)長(zhǎng)期免耕覆蓋、連續(xù)深松覆蓋免耕覆蓋以及傳統(tǒng)耕作下, 0~20 cm土層土壤中主要優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門, 均未出現(xiàn)獨(dú)有種群。與傳統(tǒng)耕作相比, 保護(hù)性耕作的原核微生物差異物種(Biomarker)明顯多于傳統(tǒng)耕作。不同耕作措施雖在一定程度上不會(huì)改變土壤原核微生物的組成和種類, 但會(huì)影響其相對(duì)分布。

黃土高原旱作區(qū)長(zhǎng)期保護(hù)性耕作措施, 提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量、全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀含量, 降低了土壤pH, 改善了土壤性狀。其中, pH、有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷、速效鉀含量是影響土壤原核微生物群落遺傳多樣性重要理化因子。

本研究試驗(yàn)結(jié)果表明, 黃土高原旱作區(qū)連續(xù)多年的免耕處理是相對(duì)較優(yōu)的耕作處理措施, 適宜該地區(qū)積極推廣。

本研究中, 3個(gè)處理土壤樣品的16S rDNA高通量測(cè)序獲取了大量的序列, 在一定程度上為后續(xù)研究提供了一定的理論支撐, 但由于稀釋曲線仍未完全飽和, 因此, 還有待進(jìn)行更深一步的研究。另外, 有關(guān)保護(hù)性耕作對(duì)土壤微生物的影響還需結(jié)合多學(xué)科、多方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià), 以便獲得更有效和全面的研究結(jié)論。在后續(xù)研究中, 我們將增設(shè)不同年份的取樣試材, 以便能夠更完整地反映出不同耕作方式對(duì)土壤環(huán)境的動(dòng)態(tài)影響。

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Effect of long-term no-tillage with stubble on soil fertility and diversity of prokaryotic microbiome in dryland wheat soils on the Loess Plateau, China*

ZHANG Guiyun1, LYU Beibei1, ZHANG Liping1, LIU Zhen1, FAN Qiaolan1, WEI Mingfeng1, YAO Zhong1,YUAN Jiawei1, CHAI Yuejin2

(1. Cotton Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Yuncheng 044000, China; 2. Agricultural Machinery Bureau of Linfen City, Linfen 041000, China)

In dryland regions, conservation tillage has the advantages of reducing soil erosion, maintaining soil structure, improving soil physical and chemical properties, and promoting microbial reproduction, compared with traditional farming methods. Up to now, the effect of long-term conservation tillage on soil prokaryotic microbial community has not been adequately reported for the China’s Loess Plateau region. To understand the effects of long-term conservation tillage on soil prokaryotic microbial community diversity and soil fertility in dryland wheat fields on the Loess Plateau, the Illumina Hiseq 2500 high-throughput sequencing and physicochemical test methods were used to analyze the effects of different tillage measures on soil physical and chemical properties and the diversity of soil prokaryotic microbial community in the wheat fields in Linfen City, Shanxi Province. Tillage measures adopted in the study area for 26 years included no-tillage with stubble (NTS), no-tillage with stubble after subsoiling (SNTS) and traditional tillage (TT1). The results showed that: 1) while soil contents of total nitrogen, available nitrogen, available phosphorus, available potassium, and soil water storage capacity and water content under NTS and SNTS treatments were significantly higher than those under TT1, soil pH under NTS and SNTS was lower than that under TT1. NTS and SNTS treatments reduced soil bulk density in the 0-10 cm soil layer, but increased it in 10-20 cm soil layer compared with TT1 treatment. Meanwhile, SNTS treatment significantly increased soil organic matter content. 2) The results of the Illumina Hiseq high-throughput 16S rRNA gene sequencing in area V4 indicated that: SNTS treatment significantly reduced the relative abundance of Chloroflexi, compared with TT1 treatment. NTS treatment significantly reduced the relative abundance of Verrucomicrobia and Chloroflexi, compared with SNTS treatment. NTS treatment significantly increased the diversity of soil prokaryote community, but not significantly changed the abundance of prokaryote community. SNTS treatment not significantly changed the diversity and richness of prokaryote community. Biomarkers under NTS treatment were higher than under other treatments. The relative abundance of other prokaryotes at the phylum division was not significantly different among three treatments. 3) UPGMA analysis showed that prokaryote community structures of NTS and SNTS were significantly different from those of TT1, and the differences between NTS and SNTS were small. 4) CCA analysis showed that soil pH, contents of organic matter, available nitrogen, available phosphorus and available potassium were important for changes in genetic diversity of soil prokaryote communities. Although NTS and SNTS treatments could change soil prokaryotic microbiome structure greatly, there was still structural similarity among the soil prokaryotic microbiomes among three treatments. To sum up, long-term conservation tillage had obvious positive effects on soil microbial diversity, richness and soil fertility in dryland wheat fields on the Loess Plateau.

Conservation tillage; No-tillage with stubble; No-tillage with stubble after subsoiling; High-throughput sequencing; Soil prokaryotic microbiome

, ZHANG Guiyun, E-mail: guiyunzhang@126.com

Jun. 28, 2018;

Oct. 25, 2018

S154.3

A

2096-6237(2019)03-0358-11

10.13930/j.cnki.cjea.180604

張貴云, 呂貝貝, 張麗萍, 劉珍, 范巧蘭, 魏明峰, 姚眾, 袁嘉瑋, 柴躍進(jìn). 黃土高原旱地麥田26年免耕覆蓋對(duì)土壤肥力及原核微生物群落多樣性的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(中英文), 2019, 27(3): 358-368

ZHANG G Y, LYU B B, ZHANG L P, LIU Z, FAN Q L, WEI M F, YAO Z, YUAN J W, CHAI Y J. Effect of long-term no-tillage with stubble on soil fertility and diversity of prokaryotic microbiome in dryland wheat soils on the Loess Plateau, China[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2019, 27(3): 358-368

張貴云, 主要從事植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)和菌根學(xué)研究。E-mail: guiyunzhang@126.com

2018-06-28

2018-10-25

* This work was supported by Shanxi Key Research and Development Project (201703D321009-3), the Natural Science Foundation of Shanxi Province (2014011029-3), and the Doctor Fund Project of Shanxi Academy of Agricultural Sciences (YBSJJ1405).

* 山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(201703D321009-3)、山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014011029-3)和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金項(xiàng)目(YBSJJ1405)資助