香蕉-甘蔗輪作模式防控香蕉枯萎病的持續(xù)效果與土壤微生態(tài)機理(Ⅱ)*

林威鵬, 曾莉莎, 呂 順**, 伍朝榮, 王 芳, 周建坤, 劉文清, 蔡昆爭, 杜彩嫻, 夏 玲

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香蕉-甘蔗輪作模式防控香蕉枯萎病的持續(xù)效果與土壤微生態(tài)機理(Ⅱ)*

林威鵬1,2,3?, 曾莉莎1?, 呂 順1**, 伍朝榮2, 王 芳1, 周建坤1, 劉文清1, 蔡昆爭2, 杜彩嫻1, 夏 玲1

(1. 東莞市香蕉蔬菜研究所 東莞 523061; 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院 廣州 510642; 3. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 廣州 510642)

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；蚚f. sp.]侵染引起維管束壞死的一種毀滅性真菌病害, 是世界范圍內(nèi)分布最廣、毀滅性最強的植物病害之一。我們在古籍《廣東新語》找到有關(guān)香蕉-甘蔗輪作的記載, 經(jīng)大田試驗證明, 連作蕉地輪作甘蔗2年后, 后茬香蕉枯萎病發(fā)病率大幅下降至1.79%。在本研究中, 我們試圖探明連作蕉地輪作甘蔗, 后茬香蕉的持續(xù)抑病效果及其機理。連作蕉地輪作甘蔗2年后, 測定回種不同年限香蕉枯萎病發(fā)病率和土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量, 并通過高通量測序技術(shù)分析土壤細菌微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的變化。結(jié)果表明: 連作蕉地輪作甘蔗2年后, 甘蔗地后茬香蕉枯萎病發(fā)病率僅為1.79%, 后續(xù)3年發(fā)病率逐年遞增, 分別為21.93%、25.80%和28.81%, 但均低于多年連作蕉地的平均發(fā)病率(49.15%)。土壤放線菌和尖孢鐮刀菌總數(shù)隨香蕉種植年限增加而顯著增加。高通量測序結(jié)果表明, 酸桿菌門(32.86%)、變形菌門(28.85%)和綠彎菌門(12.33%)3個菌門為香蕉-甘蔗輪作系統(tǒng)香蕉根圍土細菌的優(yōu)勢菌門。酸桿菌目(Acidobacteriales)細菌相對豐度隨回種香蕉逐年增加, 并與香蕉枯萎病發(fā)病率呈顯著正相關(guān)的關(guān)系; 而假單胞菌目(Pseudomonadales)、浮霉菌目(Planctomycetales)、球桿菌目(Sphaerobacterales)、乳酸桿菌目(Lactobacillales)和土壤紅桿菌目(Solirubrobacterales)細菌隨香蕉回種年限的增加呈下降趨勢, 并與香蕉枯萎病發(fā)病率呈顯著負相關(guān)的關(guān)系。連作蕉地輪作甘蔗2年后, 4年內(nèi)仍能保持較好的抑病效果。本模式具有輪作時間短、抑病效果好、持續(xù)時間長、經(jīng)濟效益高等特點。

香蕉-甘蔗輪作; 香蕉枯萎病; 尖孢鐮刀菌; 持續(xù)效果; 控病機理

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；蚮. sp(FOC)侵染引起的維管束類疾病(又稱香蕉黃葉病、巴拿馬枯萎病), FOC在土壤中可存活15年以上, 生存和傳播能力極強[1]。由于氣候條件的限制, 我國可種植香蕉(spp.)的耕地面積有限, 加之該病害在我國的迅速蔓延, 已嚴重阻礙現(xiàn)代香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-4]。

輪作、間作、套作等種植模式是我國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)主要種植方式, 在一定程度上能有效防控作物土傳病害的發(fā)生。前人研究表明, 輪作能減少土傳病害的發(fā)生[5-6], 促進土壤養(yǎng)分的釋放[7-8], 改善根際微生物環(huán)境[9-10]。對黃瓜()、當歸()、馬鈴薯()等作物的研究表明, 輪作均能有效緩解連作障礙[11-13]。已有研究表明, 連作香蕉地輪作水稻()[14]、木薯()[15]、玉米()[5]、菠蘿[5]()、韭菜()[16]均能不同程度降低后茬香蕉枯萎病的發(fā)病率。因此, 合適的輪作模式可以降低香蕉枯萎病的發(fā)病率, 最終獲得香蕉種植的最大經(jīng)濟效益。目前與香蕉進行輪作的作物, 經(jīng)濟效益遠低于香蕉。尋找一種輪作周期短、抑病效果好、持續(xù)時間長、經(jīng)濟效益高、前后茬操作模式相近的輪作模式對當前解決香蕉連作障礙具有重要的現(xiàn)實需求與經(jīng)濟意義。清代屈大均所著文獻《廣東新語》(成書于康熙17年左右)記載的香蕉-甘蔗()輪作模式為香蕉輪作甘蔗2年再復(fù)種香蕉3~4年, 周而復(fù)始[17]。我們的同期研究表明[18], 連作蕉地分別輪作甘蔗1年、2年和3年后, 下茬香蕉枯萎病的發(fā)病率分別為17.86%、1.79%和1.79%, 即香蕉輪作甘蔗2年即可達到較優(yōu)抑病效果。承接前文的研究, 本試驗試圖探明甘蔗輪作2年后茬的持續(xù)抑病效果。通過測定土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量, 以及通過高通量測序技術(shù)揭示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化, 探明其中的原理及香蕉-甘蔗輪作模式抑制后茬香蕉枯萎病發(fā)病的可能機制, 為建立合理的香蕉輪作體系提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

田間試驗位于廣東省東莞市沙田鎮(zhèn)中圍村, 面積1.4 hm2, 為同一農(nóng)戶耕種同一幅地塊平坦的多年連作香蕉地。土質(zhì)為輕黏壤土, 土層深厚, 土質(zhì)疏松, 有機質(zhì)豐富。起始時土壤耕層含有機質(zhì)12.30 g?kg-1、全氮164.9 mg?kg-1, pH 5.2。2003年個別植株出現(xiàn)香蕉枯萎病, 至2007年枯萎病發(fā)病率達80%以上, 2008年開始改種中等抗病品種‘農(nóng)科1號’香蕉, 當年‘農(nóng)科1號’枯萎病發(fā)病率達30%以上, 2009年開始進行香蕉-甘蔗輪作試驗, 樣品測定在東莞市香蕉蔬菜研究所及華南農(nóng)業(yè)大學(xué)進行。

試驗共設(shè)4個處理(表1), 每個處理3個重復(fù), 每個重復(fù)250 m2, 種植42棵香蕉。CK: 輪作甘蔗2年處理(連作香蕉多年—輪作甘蔗2年—種植香蕉0年); XJ1: 輪作后回種香蕉1年處理(香蕉連作多年—輪作甘蔗2年—種植香蕉1年); XJ2: 輪作后回種香蕉2年處理(香蕉連作多年—輪作甘蔗2年—種植香蕉2年); XJ3: 輪作后回種香蕉3年處理(香蕉連作多年—輪作甘蔗2年—種植香蕉3年)。

輪作后種植的香蕉品種仍為‘農(nóng)科1號’(AAA Cavendish, 廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育), 采用高畦深溝, 雙行春植的栽培方式。每公頃種植1 650株, 行距為2.60 m, 株距為2.40 m; 畦面寬4.5 m, 畦間溝寬0.5 m、深0.7 m。采用常規(guī)方法進行種植管理。種植的甘蔗品種為‘廣東黃皮果蔗’, 每米植蔗溝約種12個芽, 每公頃有效莖約75 000條。種莖以品字形或雙軌窄幅排放, 兩行種莖之間距離10 cm左右, 種莖與土壤緊貼, 芽排向兩側(cè)。種前施足基肥, 采用常規(guī)方法進行種植管理。

表1 不同處理2007—2014年香蕉和甘蔗的輪作模式

‘巴西蕉’和‘農(nóng)科1號’為香蕉品種。‘Baxijiao’ and ‘Nongke No. 1’ are varieties of banana.

1.2 土壤樣品的采集

在香蕉抽蕾掛果階段(甘蔗收獲期)的枯萎病發(fā)生高峰期, 于2013年10月14日統(tǒng)一采集土壤樣本, 用于測定輪作甘蔗2年后回種不同年限香蕉[0年(CK)、1年(XJ1)、2年(XJ2)、3年(XJ3)]土壤可培養(yǎng)微生物及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。于試驗地每個小區(qū)內(nèi)采用5點取樣法取樣, 去掉0~5 cm的表土, 采距植株20~30 cm的根圍土壤, 深約20 cm, 每個處理采集3個重復(fù)小區(qū)共12個土壤樣品, 將所采每個小區(qū)的土樣混勻后分成2份, 一份于-20 ℃冷凍保存用于土壤DNA提取, 一份用于測定土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 發(fā)病率及相對防效

2014年11月3日(采集土壤1年以后), 在香蕉抽蕾期跟蹤調(diào)查香蕉枯萎病的發(fā)病情況, 計算各處理的香蕉枯萎病發(fā)病率及相對防效。

枯萎病發(fā)病率(%)=發(fā)病植株數(shù)/供試植株總數(shù)×100 (1)

相對防效(%)=(連作蕉地的發(fā)病率-處理的發(fā)病率)/連作蕉地的發(fā)病率×100 (2)

1.3.2 可培養(yǎng)微生物

土壤微生物的測定參照林先貴[19]方法, 采用平板培養(yǎng)法測定土壤中的微生物數(shù)量。細菌測定用牛肉汁蛋白胨瓊脂, 真菌用馬丁氏瓊脂, 放線菌用高氏1號瓊脂, 尖孢鐮刀菌采用Komada改良培養(yǎng)基[20-21]。

1.4 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的檢測方法及測序流程

1.4.1 土壤DNA的提取

稱取0.5 g新鮮土樣置于Fast DNA cube中, 使用FastDNA土壤DNA提取試劑盒提取土壤DNA。提取的DNA使用微量紫外分光光度計測定濃度, 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA片段大小。

1.4.2 基因擴增與純化

選用引物27F(5￠-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3￠)和533R(5￠-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3￠)[22]對原核生物16s片段的V1-V3片區(qū)進行擴增, 產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫, 建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢, 質(zhì)檢合格的文庫用Roche 454 FLX+系統(tǒng)進行測序。

1.4.3 生物信息學(xué)分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾, 得到有效序列和優(yōu)質(zhì)序列[23-24]?；趦?yōu)質(zhì)序列按照97%相似度進行OTUs(operational taxonomic units)聚類和物種分類分析[25], 并將OTUs和物種注釋結(jié)合, 從而得到每個樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。再對OTUs進行豐度、多樣性指數(shù)等分析[26-27], 同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。由上海派森諾生物科技有限公司完成測序及初步分析, 廣州基迪奧生物科技有限公司完成進一步分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)的整理, 使用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析, 統(tǒng)計前對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和組件方差齊性分析, 如果無法滿足以上兩個條件, 則對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og10轉(zhuǎn)化, 然后對數(shù)據(jù)進行方差分析(one-way ANOVA),采用最小顯著極差法(LSD法)進行數(shù)據(jù)的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉地輪作甘蔗2年對后茬香蕉枯萎病發(fā)病率的影響

連作香蕉地輪作甘蔗2年后, 回種不同年限香蕉, 后茬香蕉枯萎病發(fā)病率如圖1所示。根據(jù)同期研究[18],連作蕉地枯萎病平均發(fā)病率為49.15%。輪作2年甘蔗后, 甘蔗地(CK)的后茬香蕉枯萎病發(fā)病率為1.79%, 回種香蕉1年(XJ1)的后茬香蕉發(fā)病率為21.93%, 回種香蕉2年(XJ2)的后茬香蕉發(fā)病率為25.80%, 回種香蕉3年(XJ3)的后茬香蕉發(fā)病率為28.81%。與香蕉連作地相比, 輪作甘蔗兩年后, 甘蔗地CK的相對防效高達96.36%, XJ1、XJ2、XJ3的相對防效分別為55.38%、47.50%和41.38%。以上結(jié)果表明連作蕉地輪作甘蔗2年后, 回種香蕉4年內(nèi)對香蕉枯萎病均具有一定的防控效果, 但防控效果隨著回種香蕉年數(shù)的增加而逐步降低, 但仍低于連作蕉地的平均發(fā)病率。

圖1 連作香蕉地輪作2年甘蔗后茬香蕉枯萎病發(fā)病率和相對防效

不同字母表示處理間差異顯著(<0.05)。Different letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

2.2 香蕉地輪作甘蔗2年復(fù)種香蕉對土壤可培養(yǎng)微生物的影響

連作香蕉地輪作2年甘蔗后, 回種不同年限香蕉, 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量如圖2所示。與甘蔗地CK相比, 回種香蕉后土壤微生物總數(shù)增加, 其中土壤細菌數(shù)量在回種香蕉1年(XJ1)有所提高, 回種2年(XJ2)顯著提高, 回種3年(XJ3)開始回落?；胤N香蕉1年, 真菌數(shù)量并沒有顯著變化, 回種2年開始顯著增加, 回種3年回落。放線菌在回種香蕉1和2年無顯著提高, 回種3年顯著提高, 并隨回種香蕉年數(shù)的增加而顯著提高。尖孢鐮刀菌隨著回種香蕉年數(shù)的增加而逐年增加。

2.3 香蕉地輪作甘蔗2年復(fù)種香蕉對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 微生物多樣性

輪作2年甘蔗后回種不同年限香蕉, 土壤微生物多樣性如表2所示。結(jié)果表明, 土壤原核微生物群落豐度指數(shù)(Chao1、ACE)隨香蕉種植年數(shù)的增加而顯著提高,群落多樣性Shannon指數(shù)也隨香蕉種植年數(shù)的增加而顯著提高。即與甘蔗地(CK)相比, 連作香蕉地輪作2年甘蔗后, 回種香蕉時間越長, 土壤原核微生物群落的豐度和多樣性越高。

圖2 連作香蕉地輪作2年甘蔗后茬土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量

不同字母表示處理間差異顯著(<0.05)。Different letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

表2 連作香蕉地輪作2年甘蔗后種植不同年限香蕉土壤細菌多樣性

同列不同字母表示處理間差異顯著(<0.05)。Different letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level.

2.3.2 樣品間OTU聚類

根據(jù)OTU的表達譜數(shù)據(jù), 本研究對回種不同年限香蕉土壤細菌構(gòu)成進行分析(以O(shè)TU包含tags數(shù)量達總tags數(shù)量的0.1%作為閾值), 結(jié)果如圖3所示。輪作2年甘蔗后回種香蕉1年(XJ1)土壤細菌構(gòu)成與輪作2年甘蔗(CK)更加相似, 而輪作2年甘蔗后回種香蕉2年(XJ2)和3年(XJ3)具有相似的土壤細菌構(gòu)成, 這表明隨著香蕉種植年數(shù)的增加, 土壤細菌群落構(gòu)成特征由原來的甘蔗主導(dǎo)型向香蕉主導(dǎo)型遞變。

圖3 連作香蕉地輪作2年甘蔗后茬土壤16s rDNA(細菌OTUs)豐富度熱圖

紅色表示微生物豐度上調(diào), 藍色表示微生物豐度下調(diào)。Red means microbial abundance increased, blue means microbial abundance decreased.

根據(jù)OTU豐度變化趨勢可劃分為3大類: 第1類(紅色縱向聚類)的OTU豐度呈現(xiàn)藍-白-紅的趨勢, 表明這類細菌呈現(xiàn)隨回種香蕉年數(shù)增加而逐年增加的趨勢; 而第2類(藍色縱向聚類)的OTU豐度呈現(xiàn)紅-白-藍的趨勢, 表明該類細菌呈現(xiàn)隨種植年數(shù)的增加而逐年減少的趨勢。該結(jié)果表明, 土壤中存在特定的微生物會隨著香蕉回種年數(shù)而呈逐年遞增或者遞減少的趨勢。這些微生物的變化可能與枯萎病的發(fā)病率相關(guān)。另外, 第3類則是OUT豐度沒有隨香蕉種植年數(shù)增加而呈現(xiàn)規(guī)律性變化。

2.3.3 物種分類表達譜

根據(jù)OTU的物種注釋信息以及OTU在不同樣品中的表達(圖4), 按照界、門、綱、目、科統(tǒng)計了每一個分類水平上各樣品的表達情況, 并繪制出OTU分類樹。結(jié)果表明, 4個處理的土壤中, 細菌的優(yōu)勢門分別是變形菌門(Proteobacteria, 29.27%)、酸桿菌門(Acidobacteria, 28.20%)和綠彎菌門(Chloroflexi, 12.36%), 這3個門的相對豐度占比高達69%。以上各門微生物向下注釋, 優(yōu)勢目分別為酸桿菌目(Acidobacteriales, 6.76%)、黃單胞菌目(Xanthomonadales, 10.23%)、假單胞菌目(Pseudomonadales, 4.29%)、紅螺菌目(Rhodospirillales, 7.16%)、纖線桿菌目(Ktedonobacterales, 4.08%)和Thermogemmatisporales (3.31%), 這些優(yōu)勢目的相對豐度占比達35%。

圖4 連作香蕉地輪作2年甘蔗后茬土壤16s rDNA(細菌OTUs)表達譜

圖5 連作香蕉地輪作2年甘蔗后茬土壤細菌目水平上的物種分類熱圖