雞Toll樣受體15的生物信息學分析及組織表達

邢波建，于 淼，吳 迪，徐 笑，李連艷，劉玉芬

(哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150025)

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類Ⅰ型跨膜糖蛋白模式識別受體，能夠通過識別保守的病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)參與機體的天然免疫過程。TLRs分布十分廣泛，在20多種細胞中均可檢測到其存在信號，主要分布于單核-巨噬細胞、NK細胞、T細胞等免疫細胞中[1]。TLRs可以激活相關信號分子，同時也可以引起胞內(nèi)炎性介質的轉錄和表達，進而激活非特異性和特異性免疫，共同清除抗原異物[2]。

近年來，有大量研究顯示[3-5]，TLRs與各種細菌感染導致的疾病發(fā)生有著密不可分的關系，這些研究對細菌感染的機制及疾病的預防、診斷和治療具有重要意義。迄今為止，已在人體中發(fā)現(xiàn)11種TLRs，即TLR1～TLR10和TLR14，在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)15種TLRs[6-7]，其中小鼠可表達TLR11～TLR13，但不表達TLR10。以往認為，TLR15為禽類所特有[8-9]，但最新研究證實，在釘螺中也存在TLR15，其生物學功能是否與禽類的TLR15相同，目前尚不清楚[10]。

chTLR15作為雞體內(nèi)的一種天然免疫分子，在如何參與免疫應答、保護機體方面已經(jīng)具有了一定的研究基礎[11]，但是對于不同品種雞該因子詳細的生物信息學分析和組織表達譜尚不夠豐富。因此，本研究通過克隆海蘭褐雞TLR15全長基因，獲得生物信息學特征，并對其胞外區(qū)進行原核表達，制備相應的多克隆抗體，檢測TLR15在雞體內(nèi)的分布規(guī)律，旨在為進一步研究禽類TLR相關的免疫調(diào)節(jié)機制提供基礎材料。

1 材料和方法

1.1 試驗動物、菌種、質粒和試劑

海蘭褐雞購自哈爾濱市松北區(qū)興旺養(yǎng)殖場；成年昆明鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、pGM-T載體均購自天根生化科技(北京)有限公司；pET32a表達載體由哈爾濱師范大學生物化學與分子生物學實驗室保存。KpnⅠ、Hind Ⅲ和T4DNA連接酶購自全式金(TRANS)生物有限公司；鼠抗His標簽單克隆抗體、HRP-羊抗鼠IgG二抗和DAB顯色試劑盒購自博奧森生物技術(北京)有限公司；其他試劑為進口或者國產(chǎn)分析純。

表1 chTLR15引物序列Tab.1 Primer pairs of chTLR15

注：pTLR15擴增序列為胞外區(qū);chTLR15擴增區(qū)域為跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。

Note:The amplified sequence ofpTLR15 is extracellular region;The region ofchTLR15 amplification was transmembrane and intracellular.

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的三黃雞chTLR15(登錄號：JN112024.1)序列，利用Primer 5.0和Primer-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計第1對特異性引物，用于擴增chTLR15的胞外區(qū)，分別在上游引物和下游引物引入KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。同時設計第2對引物，用于擴增跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)序列(表1)。

1.3 chTLR15基因的RT-PCR擴增

從雞脾臟中提取總RNA，依據(jù)TRIzol LS plus RNA Extraction Kit說明書進行操作，獲得完整的RNA樣品，再按照 Golden 1stcDNA Synthesis Kit(with gDNA Remover)說明書進行反轉錄操作，37 ℃孵育10 min去除gDNA，55 ℃孵育1 h后，85 ℃再孵育10 min，得到完整的cDNA。依照SuperTaqDNA Polymerase說明書進行PCR反應體系的配置，反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，72 ℃終延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物進行純化回收后，委托博仕(哈爾濱)生物技術有限公司進行序列測定，獲得序列后將進行全序列拼接。

1.4 chTLR15基因的生物信息學分析

使用Blast (basic local alignment search tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上與海蘭褐TLR15同源的數(shù)據(jù)進行分析；采用SMART (simple modular architecture research tool, http://smart.embl-heidelberg.de/)對蛋白質的結構域進行預測；SWISS-MODEL (http://www.swissmodel.expasy.org/)對蛋白質的三級結構進行預測，并利用MEGA 7.0以及DNAMAN 6.0，對核苷酸序列進行建樹分析。

1.5 chTLR15胞外區(qū)原核表達載體的構建

以KpnⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切胞外區(qū)PCR產(chǎn)物和pET32a載體，回收目的片段，以T4DNA連接酶構建重組表達載體pET32a-TLR15ER，轉化大腸桿菌DH5α后進行鑒定，然后再轉化BL21(DE3)感受態(tài)菌，提取質粒，進行酶切和測序鑒定出陽性菌株。

1.6 重組蛋白的誘導表達、檢測及多克隆抗體的制備

將陽性菌株接種于2 mL LB培養(yǎng)基(Amp+, 100 μg/mL)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取上述菌液以1/100的比例接種于50 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基(Amp+, 100 μg/mL)中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600值達0.3～0.5，在超凈工作臺中取出1 mL菌液作為誘導前對照，在剩余菌液中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃誘導，每隔1 h收集菌體，離心收獲細菌沉淀。將收集的菌體用10 mmol/L的PBS (pH值8.0)懸浮進行超聲破碎、蛋白純化，進行SDS-PAGE分析，再轉印到NC膜上，5%的脫脂奶封閉后，加入鼠抗His單克隆抗體孵育，PBS清洗后加入1∶4 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG孵育，DAB顯色至條帶清洗，完成對表達產(chǎn)物的Western Blot檢測。純化的蛋白與等體積的弗氏完全佐劑進行充分混合，按照每只50 μg的劑量采用皮下多點注射法免疫四周齡昆明成年小鼠，對照組注射等劑量0.9%生理鹽水。14 d后，再進行2次加強免疫。加強免疫14 d后，眼眶采全血分離血清，采用ELISA方法測定抗體效價后，于-20 ℃分裝保存。

1.7 chTLR15的免疫組織化學檢測

采用石蠟包埋法對脾、肝、肺進行處理，以約5 μm厚度進行切片。脫蠟復水后用10%山羊血清進行封閉后加入一抗，37 ℃濕盒孵育20 min，之后滴加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育40 min，洗滌后滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室溫濕盒中孵育40 min，用DAB進行顯色。蘇木精復染、梯度脫水透明并樹膠封片。

2 結果與分析

2.1 chTLR15基因的PCR擴增

以提取的雞脾臟組織中總RNA為模板，根據(jù)GenBank上發(fā)表的chTLR15基因的序列設計2對引物，PCR反應后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均得到清晰的目的條帶(圖1-2)，全部基因長度約為2 607 bp，其中，胞外區(qū)目的基因片段大小約為1 980 bp，與預期相符。

M.DNA Marker DL2000;1,2.chTLR15基因胞外區(qū)的擴增。M.DNA Marker DL2000;1,2.Amplification of extracellular domain of chTLR15 gene.

M.DNA Marker DL5000;1.陰性對照;2.chTLR15基因全長的RT-PCR產(chǎn)物。M.DNA Marker DL5000;1.Negative control;2.Full-length RT-PCR products of chTLR15 gene.

圖3 chTLR15蛋白的結構域預測Fig.3 The prediction of chTLR15 domain structures

2.2 chTLR15基因的生物信息學分析

經(jīng)序列拼接，獲得的海蘭褐雞TLR15基因全長2 607 bp，編碼868個氨基酸，其中，胞外區(qū)1 962 bp。該克隆序列已提交GenBank，登錄號為：MH143572。使用SMART在線軟件，模擬出chTLR15的功能區(qū)(圖3)。chTLR15蛋白胞外區(qū)位于肽鏈的N端區(qū)，有1個典型亮氨酸富集亞家族區(qū)(Leucine-rich repeats, typical subfamily, LRR_TYP)，6個明顯的亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeat, LRR)，1個C端亮氨酸富集區(qū)(Leucine-rich repeat C-terminal domain, LRR_CT)，1個跨膜結構區(qū)和胞內(nèi)C端TIR結構域，符合TLR分子的典型結構特征[12]。應用SWISS-MODEL在線軟件，模擬出chTLR15氨基酸的三級結構(圖4)，N端的胞外區(qū)呈現(xiàn)出2個馬蹄形的折疊，中間的跨膜區(qū)由2個α螺旋組成，C端形成TIR結構域，通過三維模擬可以看出，該分子中α螺旋的含量較少，β折疊和β轉角相對較多。

經(jīng)DNAMAN 6.0的比對以及MEGA 7.0建立的核苷酸系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，與所選參考序列相比，三黃雞和海蘭褐雞的同源性高達99.85%，僅有4處位點發(fā)生變化，分別是168，449，925和1 362位堿基發(fā)生變化，但氨基酸的序列沒有變化；和草原松雞略有差異，同源性為92.13%，和鴻雁差異較大同源性為84.77%，與白腰叉尾海燕、紫水雞和其他物種差異較大。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，海蘭褐雞與家麻雀以及釘螺TLR15親緣關系較遠，序列差異也很大，與釘螺的核苷酸同源性是39.81%，氨基酸序列同源性僅有22.10%。

A圖與B圖是同一水平面，順時針旋轉90°。Figure A and Figure B are the same horizontal plane with clockwise rotation 90°.

圖5 基于不同物種TLR15的核苷酸序列進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of TLR15 from different species

2.3 chTLR15胞外區(qū)重組表達載體的構建

以KpnⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切胞外區(qū)PCR產(chǎn)物和pET32a表達載體，回收目的片段后連接。連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，進行雙酶切鑒定和測序驗證。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到一條約5 900 bp的片段和一條約2 000 bp的片段，與預期片段大小相符(圖6)。經(jīng)最后測序表明，目的基因片段已經(jīng)與表達載體相連接，并且正確插入到了表達載體的目的位點處，由此構建了重組表達質粒，命名為pET32a-TLR15ER。

M1.DNA Marker DL15000;M2.DNA Marker DL2000;1.酶切產(chǎn)物;2.對照質粒。M1.DNA Marker DL15000;M2.DNA Marker DL2000;1.Enzyme-digested product;2.Control plasmid.

2.4 胞外區(qū)的誘導表達和多克隆抗體的制備

將重組質粒pET32a-TLR15ER轉化大腸桿菌BL21(ED3)受體菌中，經(jīng)過IPTG誘導后每隔1 h收集菌樣，提取包涵體蛋白，進行SDS-PAGE電泳分析(圖7)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IPTG誘導后，在5 h為最佳誘導條件，誘導菌在72 ku處增加了一條特異的誘導表達條帶。取誘導后菌液，經(jīng)超聲波破碎后對收集的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析(圖8)，結果發(fā)現(xiàn)，在裂解沉淀物中有與目的蛋白大小相符的條帶，而上清中無此條帶，表明該表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。經(jīng)過3次免疫制備鼠抗雞TLR15胞外區(qū)抗體，經(jīng)ELISA 檢測，抗體效價為1∶10 000。采用Western Blot方法檢測重組蛋白的特異性(圖9)，抗His單克隆抗體與pET32a-TLR15ER重組蛋白發(fā)生反應，在分子量約為72 ku處出現(xiàn)一條特異性條帶。

M.蛋白分子量標準;1.細菌無誘導對照;2-8.誘導不同時間的表達產(chǎn)物。M.Protein Marker;1.Bacteria without induction control;2-8. Induction of expression products at different times.

M.蛋白分子量標準;1-3.菌體裂解的沉淀;4-6.菌體裂解的上清。M.Protein Marker;1-3.Precipitation of cell cleavage；4-6.Supernatant of cell cleavage.

M.蛋白分子量標準；1.蛋白樣品的雜交條帶；2.未誘導重組菌。M.Protein Marker;1.Hybridization strip of protein sample;2.Uninduced recombinant bacteria.

2.5 chTLR15的免疫組織化學檢測

取海蘭褐雞脾臟、肝臟、肺的組織材料，經(jīng)免疫組織化學檢測(圖10)，A圖為脾臟，B圖為肝臟，C圖為肺。A、B、C組中1組為對照組，2組為試驗組。結果表明，對照組無陽性染色，在試驗組中，脾臟、肝臟、肺均有陽性染色，陽性染色細胞呈深黃色，脾臟染色最深；肝臟和肺染色較淺，少數(shù)陽性染色細胞呈淺黃色，表明脾臟是主要產(chǎn)生TLR15的部位且主要分布在細胞質中。

3 討論

眾所周知，早期對TLR的研究顯示，該基因可以參與果蠅背腹側極性的形成，所以命名為Toll受體[13]。隨后，Hashimoto等[14]研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼1種跨膜蛋白，進而闡述了該蛋白的結構。而在1996年，研究人員又發(fā)現(xiàn)該基因能夠激起成年果蠅的免疫反應，其表達產(chǎn)物在抗感染方面發(fā)揮重要作用[15-16]。chTLR15作為天然免疫的重要組成部分，在禽類感染性疾病中的作用已經(jīng)具有了一定的研究基礎。已有研究表明，chTLR15主要在雞抗細菌感染過程中發(fā)揮重要作用[17]，但Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)TLR15也能夠識別病毒和細菌的非甲基化的CpG-DNA序列，激活機體的抗病毒反應。而且，以往研究認為TLR15為禽類所特有，但在2018年，有報道稱，在釘螺中發(fā)現(xiàn)TLR15[10], 但對該分子在細胞中的定位、配體的誘導和傳導的信號通路都尚未明確，故不能確定二者是同系物。由于物種的親緣關系，可以看出海蘭褐雞與三黃雞的核苷酸同源性高達99.85%，氨基酸完全一致。這與Ruan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在不同地方品種雞chTLR15的胞外區(qū)會存在某些多態(tài)性位點的報道不一致。海蘭褐雞與其他鳥類之間相比親緣關系也較近，和貝類的親緣關系相對較遠[20]。

有研究表明，在受到細菌感染時chTLR15的表達量會上調(diào)[21]。王燕等[22]在用白痢沙門氏菌刺激雛雞時也得到了相同的結論。還有一些研究者通過免疫組化實驗也發(fā)現(xiàn)，chTLR15可以在脾臟中大量表達，說明脾臟在TLR15的表達中占有十分重要的地位，作為外周免疫器官，脾臟受到細菌感染之后，chTLR15的表達量會出現(xiàn)上調(diào)[23]。一些研究還揭示出禽類特異性的TLR15在功能上和TLR2相似[24]，這在雞感染沙門氏菌后，脾臟中TLR15和TLR2的mRNA表達量都會增加中得到證實[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，未受感染的狀態(tài)下，海蘭褐雞TLR15在脾臟中表達量也是最高，與前述研究具有一致性。

TLR15在發(fā)揮作用時，主要通過其胞外區(qū)識別病原微生物的PAMPS，故本研究選用胞外區(qū)進行原核表達，得到了與預計相符的重組目的蛋白，免疫動物后獲得了相關抗體。在驗證chTLR15組織分布譜時該抗體可以進行有效的結合，表明該重組蛋白屬于有活性的有功能的TLR15分子，可以用于今后進一步觀察分析TLR15的功能特征，并為開發(fā)出新型的生物制劑奠定了基礎，也為后續(xù)的相關領域的研究提供了充足的分子基礎。