藏綿羊EGLN1基因表達(dá)、變異特征及其適應(yīng)性分析

劉 秀，張亞強(qiáng)，李少斌，王繼卿，胡 江，沙玉柱，張 偉，羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

藏綿羊是中國最古老的綿羊品種和三大粗毛綿羊品種之一，繁育在3 000～6 000 m氣候寒冷、氧分壓低的青藏高原地區(qū)。在漫長(zhǎng)的適應(yīng)性進(jìn)化過程中，藏綿羊在生理、生化和形態(tài)學(xué)上具有了穩(wěn)定適應(yīng)高原低氧環(huán)境的遺傳學(xué)特性，逐漸在形態(tài)、細(xì)胞和分子水平上形成了適應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制，是適應(yīng)青藏高原低氧環(huán)境的優(yōu)勢(shì)物種[1]。

脯氨酸羥化酶(Proline hydroxylase, PHDs)是一類雙加氧酶，主要參與調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子及低氧反應(yīng)[2]。有PHD1、PHD2、PHD3和PHD4 4種亞型[3]，PHD2(Proline hydroxylase domain protein 2，PHD2)即脯氨酸羥化酶2，又名EGLN1(Egl nine homolog 1)基因。綿羊EGLN1基因位于其25號(hào)染色體上，有7個(gè)外顯子，長(zhǎng)約5 kb，編碼661個(gè)氨基酸[4]。EGLN1基因是一重要的氧氣傳感基因[5]，具有負(fù)調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子1a(Hypoxia-inducible factor-1a, HIF-1a)的作用，對(duì)低氧環(huán)境較為敏感，能夠調(diào)控低氧環(huán)境條件下HIF-1a的表達(dá)，是其蛋白降解的主要因子[6]。EGLN1基因表達(dá)的降低可減少HIF-1a的降解，可形成HIF-1a的蓄積，使HIF-1a誘導(dǎo)的低氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)低氧環(huán)境適應(yīng)反應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血紅素氧化酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Induced nitric oxide synthase, iNOS)、促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)等，從而提高細(xì)胞和組織對(duì)低氧的耐受力，使細(xì)胞較好的適應(yīng)低氧環(huán)境，從而達(dá)到低氧適應(yīng)形成對(duì)細(xì)胞的保護(hù)。

EGLN1基因的變異分析可有效研究動(dòng)物的高原低氧適應(yīng)性進(jìn)化。利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome wide association study, GWAS)方法對(duì)藏族人進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGLN1基因是藏族與漢族人基因頻率差異最大的基因，他們與藏族血紅蛋白濃度以及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)呈顯著相關(guān)，并直接參與了藏族的低氧適應(yīng)進(jìn)化過程[7]。EGLN1 基因在人的跨種族基因檢測(cè)中表現(xiàn)出了很強(qiáng)的自然選擇性[8]，與蒙古人血紅蛋白含量具有顯著的相關(guān)性[9]，以及慢性高原病[10]、高原水腫[11]和紅細(xì)胞增多癥[12]等均具有相關(guān)性。

截至目前， 對(duì)EGLN1基因的研究對(duì)象主要以世居高原上的土著居民為主，如EGLN1基因與藏族人群的高原性疾病、癌癥、高原環(huán)境的適應(yīng)等方面研究。以海拔高度不同進(jìn)行的遺傳特征差異以及基因表達(dá)差異研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以藏綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，低海拔湖羊?yàn)閷?duì)照，采用qRT-PCR技術(shù)和PCR-SSCP方法分析EGLN1基因在高低海拔綿羊品種間、不同組織間的表達(dá)差異以及遺傳變異特征與低氧適應(yīng)的相關(guān)性。進(jìn)而為藏綿羊高原低氧適應(yīng)性機(jī)制以及耐低氧分子標(biāo)記篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

樣品包括340只藏綿羊和249只湖羊血樣(表1)，用于基因組DNA提取。部分血液滴至FTA卡(Whatman Bioscience, Middlesex, UK)上，自然晾干后保存?zhèn)溆谩＝M織樣分別采集3只藏綿羊和3只湖羊的心、肝、脾、肺、腎和骨骼肌組織，立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 FTA卡基因組DNA提取 FTA卡基因組提取采用兩步法[13]。

1.2.2 總RNA提取 采用RNA simple Total RNA Kit試劑盒(北京天根)提取各組織的總RNA。利用Fast King RT Kit(With gDNase)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光定量引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中綿羊EGLN1基因CDS序列(No：XM_012156646.2)，利用在線Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，內(nèi)參基因18S參考文獻(xiàn)[14]引物(P1和P2)，引物序列見表2，引物合成由華大基因科技有限公司完成。利用Applied Biosystems Q6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)量測(cè)定，總反應(yīng)體系為20 μL，包括熒光定量PCR預(yù)混液(AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix)10.0 μL、ROX Reference Dye1 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 2.0 μL、滅菌蒸餾水6.8 μL，每個(gè)組織重復(fù)3個(gè)樣品檢測(cè)。機(jī)設(shè)條件為：預(yù)變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，10 s，退火，60 ℃，30 s，延伸，72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解反應(yīng)為，變性95 ℃，15 s；然后60 ℃，60 s。

1.4 綿羊EGLN1基因PCR-SSCP檢測(cè)

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的綿羊EGLN1基因序列(NC_019482.2)，利用Primer 6.0設(shè)計(jì)特異引物P3(表2)，擴(kuò)增intron6-intron7部分區(qū)域。

反應(yīng)體系為20 μL：包括Taq預(yù)混酶10 μL(Vazyme)，ddH2O 7.6 μL，引物0.8 μL和DNA模板0.8 μL。

PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，30 s，退火，62 ℃，30 s，延伸，72 ℃，30 s，35個(gè)循環(huán)；延伸，72 ℃，7 min；4 ℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

SSCP檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物2.5 μL，加入變性緩沖液7.5 μL混勻，在105 ℃進(jìn)行加熱變性5 min，然后置冰水混合物中。在14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=37.5∶1)和0.5×的TBE液中電泳，外循環(huán)溫度為15 ℃(恒溫)的條件下，220 V電泳20 h。電泳結(jié)束后，將非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染顯色，判型。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequence

1.5 測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

根據(jù)銀染結(jié)果，確定SSCP帶型，將純合型樣品直接測(cè)序，雜合型則進(jìn)行切膠測(cè)序[15]。采用MEGA 5.0軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行比較，利用Popgene 32.0軟件對(duì)基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后對(duì)序列純合度(Homozygosity, Ho)、雜合度(Heterozygosity, He)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles, Ne)進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析，采用PIC 6.0軟件對(duì)樣品多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content, PIC)進(jìn)行計(jì)算。

采用2-ΔΔCT法[16]計(jì)算EGLN1基因mRNA的表達(dá)情況，ΔCT和ΔΔCT計(jì)算采用以下公式計(jì)算；ΔCT=CTEGLN1-CT18S，ΔΔCT=ΔCT試驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組，腎的表達(dá)數(shù)據(jù)為對(duì)照。應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊EGLN1基因組織差異表達(dá)分析

2.1.1 熒光定量PCR熔解曲線 綿羊EGLN1基因和內(nèi)參基因18S的熔解曲線如圖1所示，兩者均為單一波峰，可知熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異，可進(jìn)行定量表達(dá)測(cè)定分析。

2.1.2 綿羊EGLN1基因表達(dá)量測(cè)定 藏綿羊和湖羊2個(gè)品種的EGLN1基因組織表達(dá)量測(cè)定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，在2個(gè)綿羊品種中，心、肝、肺、脾、腎和骨骼肌中均有表達(dá)。其中，肝在湖羊各組織中表達(dá)量最高，分別是心、脾、肺和腎和骨骼肌表達(dá)量的9.7，15.4，2.8，29.7和7.5倍；在藏綿羊中表達(dá)量最高的為脾，是心、肝、肺、腎和骨骼肌的1.7，3.4，2.1，1.3和1.1倍。2個(gè)品種相同組織間，湖羊各組織表達(dá)量均高于藏綿羊。尤其在心、肝和肺組織中最為明顯。

圖1 EGLN1基因和18S rRNA熔解曲線Fig.1 EGLN1 gene and 18S rRNA fluorescence melt curve plot

1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺臟；5.腎臟；6.骨骼??；湖羊腎為對(duì)照。1. Heart;2. Liver;3. Spleen;4. Lung; 5. Kidney;6. Skeletal muscle; Kidney of Hu sheep represents control group.

2.2 EGLN1基因變異特征分析

2.2.1 SSCP檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)SSCP檢測(cè)，在藏綿羊和湖羊EGLN1基因intron6-intron7部分區(qū)域共發(fā)現(xiàn)4個(gè)(A～D)等位基因，形成AA、BB、CC、AB、AC、BC、AD、BD、CD共9種基因型(圖3)。其中在湖羊群體中未發(fā)現(xiàn)BD基因型。序列分析表明，擴(kuò)增區(qū)域共發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs(c.1921-125A>G、c.1921-122A>G、c.1921-73C>A、c.1895G>A、c.1921+33G>A、c.1921+85T>G)以及1個(gè)堿基插入(c.1921-72插入G)和1個(gè)堿基缺失位點(diǎn)(c.1921-44缺失T)。變異位點(diǎn)c.1895G>A位于第6外顯子區(qū)，未引起氨基酸的改變，屬于同義突變。

2.2.2 群體遺傳特征 藏綿羊和湖羊的遺傳變異特征分析見表3，4。結(jié)果顯示，藏綿羊和湖羊的優(yōu)勢(shì)等位基因分別為等位基因B和A，藏綿羊優(yōu)勢(shì)基因型為AB，湖羊優(yōu)勢(shì)基因型為AA，其中，在湖羊中未檢測(cè)到基因型BD。經(jīng)χ2適應(yīng)性檢驗(yàn)，2個(gè)綿羊群體均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)(表4)，表明2個(gè)綿羊群體EGLN1基因處于Hardy-Weinberg平衡。

圖3 綿羊EGLN1基因intron6-intron7區(qū)PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection the region of intron6-intron7 of EGLN1 gene in sheep by PCR-SSCP

表3 綿羊EGLN1基因的基因型頻率和基因頻率Tab.3 Genotype frequencies and gene frequencies of EGLN1 gene in sheep

2個(gè)綿羊群體的遺傳變異參數(shù)見表4。藏綿羊的多態(tài)信息含量為0.63(PIC>0.5)，屬于高度多態(tài)；湖羊的多態(tài)信息含量為0.42，屬于中度多態(tài)。

表4 綿羊EGLN1基因的遺傳變異參數(shù)Tab.4 Genetic variation parameters of EGLN1 gene in sheep

注：PIC>0.5高度多態(tài)；PIC<0.25低度多態(tài)；P.表示2個(gè)群體間基因型頻率差異。

Note: PIC>0.5 means high diversity; PIC<0.25 means low diversity;P.Indicating the difference in genotype frequencies between the two populations.

3 結(jié)論與討論

3.1 綿羊EGLN1基因組織表達(dá)分析

高原低氧適應(yīng)是指生活在高原的人及土著動(dòng)物，為生存和適應(yīng)高原低氧環(huán)境，所形成的可遺傳的表型特征，以及生理生化方面的變化。EGLN1基因是動(dòng)物低氧誘導(dǎo)通路上的關(guān)鍵調(diào)控基因，在其適應(yīng)高原低氧環(huán)境上具有重要作用。在低氧條件下，EGLN1基因的羥化活性明顯降低，從而使HIF-1α和HIF-2α累積，進(jìn)而特異的增強(qiáng)其下游靶基因VEGF、EPO及VEGFR、乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceral dehyde-3-Phosphate dehydrogenase,GAPDH)、內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)、血紅素氧化酶(Hemeoxygenase,HO)等基因的表達(dá)，進(jìn)而參與機(jī)體低氧適應(yīng)的代謝過程，增強(qiáng)生物體對(duì)高寒低氧的適應(yīng)性[17-19]。

本研究qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，EGLN1基因在藏綿羊和湖羊2個(gè)品種的不同組織器官中均有表達(dá)，但表達(dá)具有組織特異性，且與其他動(dòng)物的相應(yīng)研究結(jié)果相似[20-21]。同時(shí)，EGLN1基因的表達(dá)具有品種特異性，藏綿羊和湖羊分別為繁育在高海拔與低海拔的品種。2個(gè)品種間，藏綿羊各組織表達(dá)量均低于湖羊，但在心、肝、腎組織中差異更為顯著，表明EGLN1基因的表達(dá)與海拔高度明顯相關(guān)。研究表明，心、肺、腎是動(dòng)物機(jī)體呼吸、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及信號(hào)傳遞等過程的主要調(diào)節(jié)器官。肝是機(jī)體新陳代謝的主要器官，在維持三大營養(yǎng)物質(zhì)平衡中發(fā)揮著重要作用，如肝糖原調(diào)節(jié)血糖濃度穩(wěn)定[22]。這些組織器官在動(dòng)物的適應(yīng)性方面所發(fā)揮的作用進(jìn)一步說明，EGLN1基因與動(dòng)物的高原低氧適應(yīng)性具有相關(guān)性。葉銀子[23]研究發(fā)現(xiàn)，EGLN1基因在不同海拔高度的沙蜥蜴心、肝中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.01)，如低海拔沙蜥蜴肝中表達(dá)量極顯著高于(P<0.01)高海拔沙蜥蜴。但在心臟中差異不顯著，與上述研究不一致，可能與研究物種不同有關(guān)。EGLN1基因?qū)Φ脱跽T導(dǎo)因子具有負(fù)調(diào)控作用，而藏綿羊EGLN1基因表達(dá)量下降，則可說明降低了對(duì)低氧誘導(dǎo)因子的抑制，增強(qiáng)其基因的表達(dá)量，發(fā)揮其在動(dòng)物低氧適應(yīng)過程中的重要作用，使動(dòng)物機(jī)體能夠更好地適應(yīng)高原低氧環(huán)境。

3.2 綿羊EGLN1基因群體遺傳及適應(yīng)性特征

本研究在藏綿羊EGLN1基因intron6-intron7區(qū)發(fā)現(xiàn)了6個(gè)SNPs、1個(gè)插入和1個(gè)缺失位點(diǎn)，以及相應(yīng)的4個(gè)等位基因。其中，1個(gè)SNPs位于外顯子區(qū)，屬于同義突變，其余均位于內(nèi)含子上。內(nèi)含子是基因上的一個(gè)重要原件，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行雙向調(diào)控，其發(fā)生突變可能會(huì)改變基因的表達(dá)效率[24-25]。結(jié)果顯示：EGLN1基因在2個(gè)品種間的基因型和等位基因頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，推測(cè)這種差異可能與其生活環(huán)境有關(guān)。由于藏綿羊繁育在青藏高原低氧環(huán)境，EGLN1基因可能在進(jìn)化過程中受到了自然選擇作用，使有利于高寒低氧適應(yīng)的基因型(AB、BB、BC)受到選擇并富集。李騫等[26]研究表明，在EGLN1基因5′UTR區(qū)和內(nèi)含子區(qū)有6個(gè)SNPs在高原藏族群體和低海拔漢族群體之間存在顯著差異，說明6個(gè)SNPs位點(diǎn)可能與藏族高原低氧適應(yīng)性有關(guān)。對(duì)藏綿羊和湖羊EGLN1基因的研究也得出相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子中的2個(gè)SNPs的純合型個(gè)體在2個(gè)綿羊間差異極顯著(P<0.01)，推測(cè)與藏綿羊的高原低氧環(huán)境適應(yīng)相關(guān)[27]，與本研究結(jié)果一致。根據(jù)PIC相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[28]，藏綿羊EGLN1基因的PIC值是0.63，大于0.5，呈高度多態(tài)，表明藏綿羊該基因遺傳變異程度較高，多態(tài)性也較為豐富，則選擇潛力較大。因此，藏綿羊EGLN1基因遺傳多樣性豐富，具有作為高原低氧分子標(biāo)記的潛力和優(yōu)勢(shì)。

EGLN1基因在藏綿羊和湖羊的6個(gè)不同組織均存在不同程度的表達(dá)。藏綿羊各組織表達(dá)量低于湖羊，尤其在心、肝、肺組織中。表現(xiàn)出明顯的品種特異性以及組織特異性，這可能與2個(gè)品種的生活環(huán)境相關(guān)。在EGLN1基因intron6-intron7區(qū)檢測(cè)到6個(gè)SNPs、1個(gè)堿基插入和1個(gè)堿基缺失，說明藏綿羊EGLN1基因遺傳多樣性豐富，且其優(yōu)勢(shì)等位基因B和優(yōu)勢(shì)基因型AB的頻率極顯著高于湖羊(P<0.01)，具有作為高原低氧分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)和潛力。