咪唑修飾萘酰亞胺與DNA的作用及其細胞毒性

高云燕，蔡溫姣，歐植澤，馬拖拖，倚 娜，李志遠

西北工業(yè)大學理學院應用化學系，空間應用物理與化學教育部重點實驗室，西安 710072

1 引言

萘酰亞胺為平面芳香性雜環(huán)化合物，可通過插入作用或溝槽結合與雙鏈DNA作用，影響DNA的復制，阻斷細胞的分裂過程，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性1。其中米托萘胺(mitonafide)和氨萘非特(amonafide)兩種萘酰亞胺衍生物已進入對實體腫瘤的藥物臨床III期研究階段2,3。但這些化合物還存在劑量限制性骨髓毒性、神經毒性和血液毒性等毒副作用。在萘酰亞胺芳香環(huán)上引入異惡唑烷4、炔基5、嗎啡啉6、多胺7,8等活性基團，或者在3位和4位并入各類芳香環(huán)如噻唑雜環(huán)、噻二唑、硫雜環(huán)等9–11，可得到相應的衍生物。這些衍生物與雙鏈DNA的結合常數(shù)可達105–106L·mol-1，能有效改善萘酰亞胺母體的抗腫瘤活性。傳統(tǒng)的萘酰亞胺藥物以雙鏈DNA為靶點，對DNA的序列或結構選擇性較差，容易引起毒副作用12,13。針對特定的核酸序列或者與 DNA作用相關的蛋白質進行藥物設計，是近年來抗腫瘤藥物研究的一個重要發(fā)展趨勢14–17。近年來進入臨床試驗的萘酰亞胺類藥物UNBS5162和DMP-840可與DNA作用，降低拓撲異構酶活性并發(fā)揮藥效，具有抗癌活性高、毒副作用小的特點，已用于實體腫瘤和淋巴瘤的治療18。進一步研究萘酰亞胺與DNA結合過程中對序列選擇性和結合強度的影響因素，有利于開發(fā)出靶向性更強的藥物19。

在人體端粒末端和原癌基因啟動子中存在大量可形成G-四鏈體的富含G-堿基序列20。G-四鏈體的形成會抑制端粒酶的活性或者相關基因的轉錄和表達，而 G-四鏈體 DNA解鏈后相關基因的轉錄或表達功能將恢復21,22。85%以上的惡性腫瘤細胞，如乳腺癌、結腸癌、以及小細胞肺癌等多種實體腫瘤中端粒酶表達呈陽性，而正常體細胞中通常無端粒酶的表達。部分以G-四鏈體為靶點的化合物對癌細胞有較強的抑制作用，而對正常細胞的毒性相對較小，其中Quarfloxin (CX-3543)已經進入臨床試驗階段并取得了良好的療效23,24。因此，設計合成能誘導G-四鏈體形成并穩(wěn)定其結構的化合物，已成為國內外腫瘤靶向治療的新策略25–28。萘酰亞胺衍生物作為一類臨床使用藥物，與G-四鏈體的相互作用也受到了研究者的關注。單取代萘酰亞胺與G-四鏈體的作用較弱，而多取代萘酰亞胺衍生物與G-四鏈體作用較強，并表現(xiàn)出良好的抗癌活性29,30。三聯(lián)吡啶鉑配合物和硫脲基團修飾的萘酰亞胺與G-四鏈體具有很強的相互作用，表現(xiàn)出對癌細胞的選擇性細胞毒性31,32。但是萘酰亞胺衍生物對G-四鏈體穩(wěn)定性的影響，以及靶向G-四鏈體萘酰亞胺衍生物的結構與活性的關系尚未得到深入研究33。

含有咪唑及其衍生物的藥物被廣泛用于臨床。近年來的研究表明，多取代咪唑基團可作為G-四鏈體穩(wěn)定劑34–36。咪唑陽離子化合物與磷酸根有很強的靜電相互作用，常用于識別磷酸基團37,38。含咪唑陽離子的芘或萘二酰亞胺等芳香化合物對G-四鏈體有良好親和性和選擇性39,40。本文將咪唑和N-烷基化的咪唑陽離子基團引入萘酰亞胺，以增強萘酰亞胺衍生物與G-四鏈體的結合能力。了解咪唑衍生物結構對萘酰亞胺與 DNA作用和抗癌活性的影響，利用AutoDock分子對接方法進行計算機虛擬篩選，為開發(fā)新型萘酰亞胺類抗癌藥物提供理論據(jù)。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

碘代正辛烷(分析純)，溴代正辛烷(分析純)，溴代十六烷(分析純)，購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。1-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基甲臢(MTT，分析純)，4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，分析純)，小牛胸腺DNA (CT DNA，分析純)，4-溴-1,8-萘二甲酸酐(分析純)購自 Sigma-Aldrich 公 司 (美 國)。 FHtelo(5′-FAM-GGG-TTAGGG-TTAGGG-TTA-GGG-TAMRA-3′)和 Htelo(5′-GGG-TTA-GGG-TTA-GGG-TTA-GGG-3′)均 由 上海生工合成并純化。其他溶劑和化學藥品均為分析純，購自北京化工。除非另有說明，光譜滴定實驗都在含有 0.1 mol·L-1K+的 Tris-HCl (10 mmol·L-1，pH 7.4)的緩沖溶液進行。所有有機溶劑均經過干燥重蒸后使用。

所用儀器：核磁共振氫譜由BrukerAvance 400核磁共振儀(瑞士，400 MHz)測定，核磁共振碳譜由BrukerAvance 600 (瑞士)核磁共振儀(碳譜 150 MHz)測定，熒光數(shù)據(jù)皆在 Hitachi F-4500熒光光譜儀(日本)上測定，紫外可見吸收光譜用 Hitachi UV-3010紫外可見分光光度計(日本)測定，細胞成像實驗所用儀器為Olympus IX70 (日本)。

2.2 化合物合成

2.2.1 化合物2的合成

4-溴-1,8萘二甲酸酐(1.5 g，5.4 mmol)分散于10 mL乙二醇乙醚中，加入嗎啡啉(0.94 mL，10.8 mmol)，在氮氣氣氛下130 °C反應24 h。除去溶劑后，利用硅膠柱色譜分離(THF/CHCl3的體積比為1/4)，得黃色固體1.33 g，產率86%。1H NMR(CDCl3，400 MHz) δ：8.60–8.58 (d，1H，J = 7.2)，8.54–8.48 (m，2H)，7.78–7.75 (m，1H)，7.29–7.26(m，1H)，4.07–4.05 (m，4H)，3.36–3.33 (m，4H)。

2.2.2 化合物3的合成

化合物2 (0.5 g，1.7 mmol)溶于15 mL吡啶中，逐漸加入 1-(3-氨基丙基)-咪唑(248 g，2.04 mmol)，在氮氣氣氛下100 °C反應24 h得到棕紅色澄清液，除去溶劑后，利用硅膠柱色譜分離(THF/CHCl3的體積比為 1/2)。得黃色固體 0.573 g，產率 83.2%。1H NMR (CDCl3，400 MHz) δ：8.61–8.59 (d，1H，J = 7.2)，8.55–8.53 (d，1H，J =8.0)，8.46–8.44 (d，1H，J = 8.0)，7.75–7.71 (m，1H)，7.59 (s，1H)，7.29–7.24 (m，1H)，7.06–7.03(d，2H，J = 10.4)，4.26–4.29 (m，2H)，4.11–4.03(m，6H)，3.30–3.28 (m，4H)，2.31–2.24 (m，2H)。13CNMR (CDCl3，150 MHz) δ：164.50，164.01，155.96，137.08，132.81，131.41，130.43，129.94，129.18，126.15，125.92，123.02，118.78，116.74，115.03，66.95，53.46，45.10，37.56，29.69。MS(MALDI-TOF)：[M+] 391.1，cacld for C22H22N4O3，390.4。

2.2.3 化合物4a–c的合成

化合物3 (0.3 g，0.76 mmol)分散于15 mL重蒸乙腈中，并轉移至水熱反應釜中，攪拌，緩慢滴加鹵代烷(2.28 mmol)，100 °C反應24 h。得到黃色澄清液，除去溶劑后采用硅膠柱色譜分離(甲醇/CHCl3的體積比為1/25)，得黃色固體。

4a:產率 63.6%。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：10.05 (s，1H)，8.54–8.47 (m，2H)，8.41–8.39(d，1H，J = 8.4)，7.78–7.68 (m，2H)，7.52 (s，1H)，7.23–7.21 (d，1H，J = 8.0)，4.50–4.38 (m，4H)，4.21–4.18 (m，2H)，4.03–4.01 (m，4H)，3.18–3.27(m，4H)，2.45–2.41 (m，2H)，2.02–1.88 (m，3H)，1.38–1.26 (m，9H)，0.88–0.84 (m，3H)。13C NMR：(DMSO-d6，150 MHz) δ：163.77，163.24，155.55，136.11，132.22，130.68，130.66，129.22，126.12，125.23，122.61，122.42，122.34，115.84，115.04，66.15，53.02，48.84，46.98，36.46，31.12，29.25，28.44，18.29，25.42，22.02，13.89。MS (MALDITOF)：[M-I]+503.3，cacld for C33H39N4O3，503.6。

4b:產率70%。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：10.50 (s，1H)，8.55–8.40 (m，3H)，7.77–7.67(m，2H)，7.47 (s，1H)，7.24–7.22 (d，1H，J = 8.0)，4.50–4.39 (m，4H)，4.22–4.19 (m，2H)，4.04–4.02(m，4H)，3.29–3.26 (m，4H)，2.46–2.40 (m，2H)，2.00–1.93 (m，2H)，1.30–1.23 (m，9H)，0.88–0.85(m，3H)。13C NMR (DMSO-d6，150 MHz) δ：163.78，163.25，155.57，136.13，132.22，130.69，130.61，129.27，126.11，125.26，122.63，122.43，122.35，115.85，115.05，66.15，53.03，48.84，46.99，36.47，31.11，29.25，28.43，28.29，25.42，22.01，13.88。MS(MALDI-TOF)：[M-Br]+503.2，cacld for C30H39BrN4O3，503.6。

4c:產率 70%。1H NMR(CDCl3，400 MHz) δ：10.48 (s，1H)，8.55–8.40 (m，3H)，7.76–7.68 (m，2H)，7.45 (s，1H)，7.23–7.21 (d，1H，J = 8.0)，4.51–4.39 (m，4H)，4.22–4.19(m，2H)，4.04–4.02(m，4H)，3.28–3.27 (m，4H)，2.45–2.40 (m，2H)，2.03–1.93(m，3H)，1.24(m，25H)，0.90–0.86(m，3H)。13C NMR (DMSO-d6，150 MHz) δ：(163.75，163.24，155.56，136.16，132.22，130.69，130.66，129.22，126.10，125.25，122.61，122.44，122.38，115.84，115.02，66.15，53.03，48.84，46.97，36.43，31.25，29.24，28.99，29.94，28.87，28.79，28.65，28.34，28.25，25.39，22.05，13.91。MS(MALDITOF)：[M-Br]+615.5，cacld for C38H55N4O3，615.8。

2.3 搖瓶法測定化合物親脂性系數(shù)(log P)

將 4 mL 化合物 (50 μmol·L-1)的緩沖溶液(Tris-HCl，pH 7.4，10 mmol·L-1)與等體積的正辛醇混合，室溫攪拌24 h后，在2500 r·min-1條件下離心 9 min，利用紫外-可見吸收光譜測定化合物在緩沖溶液相濃度Cw和正辛醇相中的濃度Co，采用公式log P = log (Co/Cw)計算出化合物的親脂性系數(shù)log P，每次實驗均重復進行三次，取平均值。

2.4 滴定實驗

配制 40 μmol·L-1的萘酰亞胺衍生物的緩沖溶液 1.0 mL (Tris-HCl，pH 7.4，0.1 mol·L-1KCl)，逐漸滴加DNA溶液，并在參比溶液中加入相應濃度的 DNA，室溫靜置 15 min后，測定化合物與DNA混合溶液的紫外-可見吸收光譜。利用公式(1)求得化合物與DNA的結合常數(shù):

式中 D 為 DNA 的濃度。Δεap= ?εa- εf?，Δε = ?εb-εf?。εa為化合物的表觀摩爾消光系數(shù) εa= Aobs/[化合物]，即用加入不同濃度 DNA后化合物的吸光度值Aobs除以化合物濃度得到。εf為未加入DNA時，化合物的摩爾消光系數(shù)。εb為所有的化合物與DNA結合后的摩爾消光系數(shù)。Ka為化合物與DNA的結合常數(shù)。采用D/Δεap與D作圖，利用線性擬合后得到的斜率除以相應的截距，進而求得Kα。

熒光光譜滴定實驗過程中，先配制化合物(5 μmol·L-1)的緩沖溶液，分別加入不同濃度DNA，室溫靜置15 min進行熒光光譜測試，激發(fā)波長為402 nm，掃描范圍為425–700 nm。

2.5 CT DNA粘度測定

將烏氏粘度計置于 25 °C恒溫水浴槽中，分別測定Tris-HCl緩沖溶液、DNA溶液和萘酰亞胺衍生物與DNA的混合溶液流經毛細管所需時間。CT DNA 的濃度固定為 100 μmol·L-1，每個樣品重復測定5次，取平均值，各次測量值相差小于0.5 s。按照公式η = (t - t0)/t0計算相對粘度，其中t0為緩沖溶液流經毛細管所需時間，t為不同濃度萘酰亞胺衍生物與 DNA的混合溶液流經毛細管所需時間，η0為沒有加入萘酰亞胺衍生物時DNA溶液的相對粘度。以(η/η0)1/3對萘酰亞胺衍生物濃度與DNA濃度的比值作圖，得到DNA的粘度變化曲線。

2.6 圓二色譜(CD)光譜實驗

在緩沖溶液中加入 20 μmol·L-1的 G-四鏈體和 40 μmol·L-1的化合物，4 °C 靜置過夜后，在230–500 nm范圍內掃描CD光譜圖。掃描速率100 nm·min-1，帶寬1 nm，讀數(shù)5次，響應時間1 s。

2.7 熒光共振能量轉移 (FRET)熔溫測定實驗

配制 Tris-HCl (10 mmol·L-1，pH 7.4)，0.1 mol·L-1Li+，20 mmol·L-1K+的緩沖溶液，加入FHtelo G-四 鏈 體 (0.2 μmol·L-1)， 化 合 物 (1.0 μmol·L-1)，混合均勻后，冰箱靜置過夜。由 27 °C逐漸加熱到 96 °C，升溫速度控制為 1 °C·min-1。以 494 nm為激發(fā)波長，測定 FHtelo在 505–700 nm范圍內的熒光光譜。將G-四鏈體在523 nm處的熒光強度變化值進行歸一化后對溫度作圖，中間拐點處的溫度即為G-四鏈體的熔解溫度。

2.8 分子對接

為深入了解目標化合物與G-四鏈體的結合模型，采用AutoDock (4.2版本)對目標化合物和G-四鏈體的相互作用進行了分子對接模擬。運用Gaussian 09中密度泛函理論方法B3LYP41，選取6-31G(d)基組對化合物進行幾何優(yōu)化，獲得目標化合物能量最低的構象。人體端粒G-四鏈體的晶體結構模型在蛋白質數(shù)據(jù)庫獲得，其 PDB文件為1KF1，AutoDock過程進行了簡化處理，將 DNA整體結構始終設定為剛性，而允許對接化合物有可以轉動的鍵。使用拉馬克遺傳算法(LGA)對可能的構象和結合位點進行搜索，計算出最有可能的100種構象，從而分析得到化合物與DNA的結合模式和作用方式。

2.9 細胞熒光成像

將細胞與化合物和 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育 4.0 h后，用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌三次。使用 Olympus IX70熒光顯微鏡進行細胞成像。DAPI的熒光用405 nm的激光激發(fā)，測量范圍為425到475 nm；萘酰亞胺衍生物的熒光用488 nm的激光激發(fā)，測量范圍為500–600 nm。熒光圖像用Olympus FV10-ASW 1.6 viewer software處理。

2.1 0 體外細胞毒性實驗

采用MTT還原法進行檢測。取對數(shù)生長期的A549和 MRC-5細胞，調整細胞密度為 1 × 106mL-1，分裝于96孔板中，每孔加入上述細胞懸液100 μL。第2天分別加入不同濃度的目標化合物，每個濃度設6個平行孔，細胞培養(yǎng)72 h。棄去培養(yǎng)基后，用磷酸緩沖溶液沖洗兩次，每孔中各加入200 μL 新鮮的培養(yǎng)基和 MTT (5 mg·mL-1) 10 μL，再繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后取出。吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，再將培養(yǎng)板震蕩均勻20 min左右，在酶標儀上測定各孔的吸光度(OD)，測定波長為570 nm，記錄結果，并按下列公式計算出被測物對癌細胞生長的抑制率。根據(jù)公式(2)計算細胞生長抑制率：

3 結果與討論

3.1 化合物的合成

G-四鏈體是一種有別于雙鏈 DNA的核酸二級結構，它由G堿基通過Hoogsteen氫鍵作用形成G-四集體，并進一步堆積形成。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在寨卡病毒和艾滋病毒(HIV)的基因末端也存在富含G-堿基的鏈段，并能形成G-四鏈體42,43，因此以G-四鏈體為靶點進行篩選和結構設計是抗腫瘤藥物研究的熱點之一。與G-四鏈體作用的化合物大多具有平面芳香大共軛結構且?guī)д姾?，可通過堆積作用和靜電作用等多種結合模式穩(wěn)定G-四鏈體結構。將咪唑和咪唑陽離子等基團引入萘酰亞胺衍生物，有望提高與G-四鏈體的結合能力及抗癌活性44,45。本文以 4-溴萘二甲酸酐為原料，通過親核取代反應合成4-嗎啡啉萘二甲酸酐，進一步與胺丙基咪唑反應得到含咪唑基團的萘酰亞胺衍生物3 (圖1)。將3與鹵代烷反應，得到含有咪唑陽離子的萘酰亞胺衍生物 4a–c，利用1H NMR，13C NMR和質譜對化合物的結構進行了表征(圖 S1–S13 (Supporting Information))?；衔?4a和4b均為正辛基取代的咪唑陽離子衍生物，對離子分別為碘離子和溴離子，其親脂性系數(shù)(log P)分別為 1.43和 0.76?；衔?4c的烷基鏈為十六烷基，其親脂性更強(log P = 1.71，表S1)?；衔?和4a–c的親脂性有利于提高細胞吸收，增強細胞毒性46。

圖1 含咪唑基團萘酰亞胺衍生物的合成路線Fig.1 Synthetic route for the naphthalimide derivatives containing imidazole moiety.

3.2 紫外-可見吸收光譜滴定

在3的緩沖溶液中加入雙鏈CT DNA后，285和402 nm處的吸收峰強度下降，且402 nm處的減色效應大于30% (圖2a)。以402 nm處吸光度的變化值對DNA濃度作圖，并進行線性擬合，求得3 與 CT DNA 的結合常數(shù)為 1.40 × 104L·mol-1(表1)。加入CT DNA后，化合物4a–c在300–500 nm范圍內的吸光度也明顯下降(圖 S14 (Supporting Information))。與雙鏈DNA作用的強弱順序為：4c ＞ 4b ≈ 4a ＞ 3，說明咪唑正離子的修飾可增強萘酰亞胺衍生物與雙鏈DNA的作用47。

圖2 (a) CT DNA和(b) Htelo G-四鏈體DNA對3(40 μmol·L-1)吸收光譜的影響Fig.2 UV-Vis titration of 3 (40 μmol·L-1) with (a) CT DNA and (b) Htelo G-quadruplex in Tris-HCl buffer(10 m mol·L-1,pH 7.4) containing 0.1 mol·L-1 KCl.

化合物3與Htelo G-四鏈體的相互作用也可由吸收光譜檢測。Htelo G-四鏈體的加入可引起3的吸收峰強度下降(圖 2b)，利用線性擬合可求得二者的結合常數(shù)為 7.8 × 106L·mol-1(表 1)。化合物4a-c和Htelo G-四鏈體DNA也具有很高的親和性(Ka＞ 4 × 106L·mol-1) (圖 S15 (Supporting Information))，與文獻報道的多取代萘酰亞胺衍生物30，苝二酰亞胺衍生物48，金屬配合物等相當49?；衔?和4a-c與Htelo G-四鏈體的結合常數(shù)是其與雙鏈DNA結合常數(shù)的30倍以上，說明3和4a-c可作為G-四鏈體的穩(wěn)定劑?；衔?b對G-四鏈體 DNA的親和力高于 4a，表明陰離子種類也可影響化合物與DNA的作用50。在紫外滴定過程中沒有觀察到等吸收點，表明化合物與CT DNA及G-四鏈體的作用存在多種結合模式32。

表1 紫外-可見吸收光譜測定的萘酰亞胺衍生物與雙鏈CT DNA和Htelo G-四鏈體的結合常數(shù)(Kα,L·mol-1)Table1 Association constant (Kα,L·mol-1) of naphthalimide derivatives with duplex CT DNA and Htelo G-quadruplex DNA determined by UV-Vis spectroscopy.

表2 雙鏈CT DNA和Htelo G-四鏈體DNA對萘酰亞胺衍生物熒光強度的影響Table2 Effects of double-stranded CT DNA and Htelo G-quadruplex DNA on the fluorescence enhancement(F/F0) of naphthalimide derivatives.

3.3 熒光光譜滴定

4-胺基取代的萘酰亞胺衍生物的熒光對環(huán)境比較敏感，利用熒光光譜可以了解萘酰亞胺衍生物與DNA作用后所處化學環(huán)境的變化51。CT DNA的加入可使 3和 4a–c的熒光增強(圖 S16(Supporting Information))。當CT DNA與化合物的濃度比為20時，化合物的熒光可增強至1.48–3.68倍(圖3和表2)。Htelo G-四鏈體DNA的加入可使3和4a–b的熒光強度增加7倍以上，而4c的熒光增強 1.73倍(圖 S17 (Supporting Information))。這表明取代基對萘酰亞胺衍生物與 DNA的作用有影響52。萘酰亞胺衍生物3和4a-c可作用于G-四鏈體的疏水區(qū)域，減小水分子對化合物的熒光猝滅，從而使熒光增強，這與化合物在低極性溶劑中熒光較強的性質相符合(圖 S18 (Supporting Information))53。

圖3 不同濃度的(a) CT DNA和(b) Htelo G-四鏈體DNA后，萘酰亞胺衍生物的熒光強度變化Fig.3 The fluorescence enhancement (F/F0) of naphthalimide derivatives upon addition of(a) CT DNA and (b) Htelo G-quadruplex.

3.4 DNA的粘度研究

DNA的粘度對其分子長度的變化非常敏感，是判斷小分子與DNA結合方式的重要依據(jù)54。小分子與DNA發(fā)生插入作用會使DNA相鄰堿基之間的距離增大，雙螺旋伸長，粘度增加；而發(fā)生靜電作用或溝槽結合時，DNA的粘度不會發(fā)生明顯變化55,56。為進一步確定萘酰亞胺衍生物與雙鏈DNA的作用方式，用烏式粘度計在25 °C測定了CT DNA在3、4a-c、EB存在下的粘度變化。如圖4所示，CT DNA的相對粘度隨著萘酰亞胺衍生物濃度的增大而明顯增大，說明萘酰亞胺衍生物與 CT DNA的作用方式為插入作用1?；衔?a-c對 DNA粘度的影響與典型的 DNA插入劑EB相當，而3對DNA粘度的影響小于EB，表明在萘酰亞胺衍生物中引入正電荷有利于插入作用。

圖4 在含有 0.1 mol·L-1 KCl的 Tris-HCl (10 mmol·L-1，pH 7.4)緩沖溶液中不同濃度萘酰亞胺衍生物和EB對CT DNA (0.1 mmol·L-1)粘度的影響Fig.4 Effect of naphthalimide derivatives and EB on the relative viscosity of CT DNA (0.1 mmol·L-1) in Tris-HCl(10 mmol·L-1，pH 7.4) buffer containing 0.1 mol·L-1 KCl.

圖5 (a)含K+和(b)不含K+的Tris-HCl緩沖液中，加入化合物3，4a-c對Htelo G-四鏈體CD譜的影響Fig.5 CD spectra of Htelo (20 μmol·L-1) inTris-HCl (10 mmol·L-1,pH 7.4) upon addition of 3,4a-c(40 μmol·L-1) (a) in the presence of 0.1 mol·L-1·K+ and (b) in the absence of K+ .

圖6 化合物3，4a-c對FHtelo G-四鏈體熔解溫度(Tm)的影響Fig.6 Effect of naphthilimides 3,4a-c on the melting temperature (Tm) of FHtelo G-quadruplex[FHtelo] = 0.2 μmol·L-1;[3] = [4a] = [4b] = [4c] = 1.0 μmol·L-1

3.5 圓二色譜(CD)研究

在K+緩沖溶液中，Htelo G-四鏈體的CD譜在265、295 nm處各有一個正峰，是一種典型的混合型結構(圖5a)。隨著化合物3和4a–c的加入，CD信號峰基本不發(fā)生變化，表明Htelo G-四鏈體在這種條件下仍然保持混合型結構25–28。

在不含堿金屬離子的 Tris-HCl緩沖溶液中，Htelo G-四鏈體的CD譜在255，295 nm處各有一個正吸收峰，表明它以未折疊結構和四鏈體的混合形式存在(圖5b)。加入3和4c后，譜圖沒有明顯變化，表明3和4c不能誘導未折疊的Htelo序列形成四鏈體結構。但是隨著4a和4b的加入，在295 nm處的正峰強度增強，在265 nm左右出現(xiàn)負峰，但是與典型的反平行結構或平行結構G-四鏈體的 CD譜在峰位上還有差異，其具體構型還有待于進一步研究57。

3.6 熒光共振能量傳遞(FRET)研究

通過 FRET方法可以研究萘酰亞胺衍生物穩(wěn)定端粒G-四鏈體的能力。如圖6所示，F(xiàn)Htelo本身的熔解溫度為 52.7 °C。加入化合物 3和 4a–c后，F(xiàn)Htelo的熔解溫度分別變?yōu)?8.3、63.2、60.9和 60.3 °C，其ΔTm分別為 5.8、10.7、8.4 和 7.8 °C，表明3、4a–c能夠有效穩(wěn)定FHtelo的四鏈體結構.

3.7 分子對接研究

為進一步了解萘酰亞胺與端粒 G-四鏈體DNA的結合模式，我們進行了分子對接研究58。采用密度泛函(DFT)對化合物進行結構優(yōu)化后，再與端粒G-四鏈體DNA的晶體結構(PDB ID:1KF1)進行分子對接。在AutoDock分子對接過程中，常忽略 G-四鏈體穩(wěn)定劑中陰離子對 DNA結合的影響59。因此我們僅研究3、4a和4c的分子對接。由圖8可以看出，3、4a和4c的萘酰亞胺基團均位于TTA環(huán)和G-四分體形成的loop及溝槽區(qū)，存在疏水相互作用60。化合物 3的咪唑基團與DG16堿基2位上的氨基形成氫鍵，鍵長約為2.060 ? (1 ? = 0.1 nm，圖7a，b)。咪唑基與DNA堿基之間的氫鍵可增強藥物與DNA的相互作用61?；衔?a和4c中的季銨鹽N原子與G-四鏈體的磷酸骨架的距離為 3 ?左右，表明存在靜電相互作用(圖7c–f)62。4c中的酰胺羰基與DG14堿基2位上的氨基之間還存在氫鍵作用(圖 7e，f)?；衔?、4a和4c與G-四鏈體間存在疏水作用、靜電相互作用或氫鍵等多種結合方式，因而與Htelo G-四鏈體間的結合常數(shù)較高。

圖7 化合物 3 (a，b)，4a(c，d)和 4c (e，f)與端粒 G-四鏈體DNA (PDB ID:1KF1)對接作用的模式圖。紅色虛線表示化合物與G-四鏈體間的氫鍵或靜電作用Fig.7 Different views of the docked model of 3 (a,b),4a (c,d) and 4c (e,f) with telomeric G-quadruplex DNA(PDB ID:1KF1).The red dashed lines represent the hydrogen bonding or electrostatic interaction betweennaphthalimides and G-quadruplex.

3.8 細胞熒光成像

4-氨基萘酰亞胺基團有很好的熒光特性，因此可以通過熒光成像了解化合物的細胞分布。將A549細胞分別用3、4b以及細胞核定位染料4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)在37 °C孵育4 h后，在細胞核內可以明顯觀察到 DAPI的藍色熒光，3和4b的黃綠色熒光(圖8)。但是3孵育的細胞，除了細胞核內有明顯的熒光外，在其他區(qū)域還可觀察到一些分散的弱綠色熒光(圖8a，c)。這說明4b比3能夠更快地進入細胞核?；衔?a和4c的細胞成像結果與4b相似，與A549細胞作用4 h后主要位于細胞核(圖S19 (Supporting Information))?；衔?a–c帶有正電荷，且具有合適的親疏水性，因而可以快速進入細胞核31,50。這些結果表明，本文合成的咪唑基團修飾萘酰亞胺具有與 DAPI相似的細胞滲透性并且可用于細胞核定位。

圖8 A549細胞用化合物(a) 3，(d) 4b，及DAPI (b，e)孵育4.0 h后的熒光成像。(c) 圖 (a)和(b)的疊加圖；(f) 圖(d)和(e)的疊加圖Fig.8 Fluorescence images of A549 cells incubated with(a) 3,(d) 4b ,and DAPI (b,e) for 4.0 h.(c) merged image of(a) and (b);(f) merged image of (d) and (e).

表3 萘酰亞胺衍生物對A549和MRC-5細胞的細胞毒性Table3 Data for the cytotoxicity (IC50,μmol·L-1) of naphthalimides against A549 and MRC-5 cells.

3.9 細胞毒性作用

文獻報道能夠穩(wěn)定端粒 G-四鏈體 DNA的小分子化合物能夠降低端粒酶的活性，從而抑制癌癥細胞的無限增殖，因此好的 G-四鏈體穩(wěn)定劑具有潛在的抗癌功效25–28。使用米托萘胺(Mitonafide)作為對照，通過MTT法測定3和4a–c對肺癌細胞A549的體外細胞毒性。經過72 h的孵育，3和4ac均表現(xiàn)出良好的抗癌活性(表 3和圖 S20(Supporting Information))?；衔?a-c的 IC50值分別為 2.64、2.23 和 3.34 μmol·L-1，與臨床藥物米托萘胺(IC50= 3.78 μmol·L-1)相當，但它們對腫瘤細胞A549 的抑制作用明顯強于 3 (IC50= 15.3 μmol·L-1)，可能是由于含咪唑正離子的化合物能夠更好的定位于細胞核(圖8)。作為對照，我們也測定了這幾種化合物對正常人胚肺成纖維細胞MRC-5的細胞毒性?；衔?a和4b對A549細胞比對非癌細胞MRC-5有更強的抑制作用，這表明4a和4b作為抗癌藥物具有良好的應用前景。

4 結論

本文設計合成了含咪唑基團和咪唑陽離子的萘酰亞胺衍生物，所得化合物可通過疏水作用、氫鍵或靜電作用等多種作用方式與人體端粒G-四鏈體 DNA結合，因而對 G-四鏈體具有較高的親和性和選擇性，并能夠提高其熔解溫度。咪唑修飾萘酰亞胺衍生物的化學結構對DNA結合，細胞毒性等性能有較大影響?；衔?a和4b可快速進入癌細胞A549的細胞核，表現(xiàn)出良好的細胞毒性。本文實驗結果表明在酰胺位置上引入咪唑基團是增強萘酰亞胺衍生物與G-四鏈體等特定核酸序列結合能力的一個有效途徑，并有望獲得抗癌活性高、毒副作用小的藥物。

Supporting Information: available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.