楊金偉 王志強(qiáng) 柴三明 王 琰 張 霖 安錦霞 倪亞莉
甘肅省婦幼保健院(蘭州,730050)
我國(guó)將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)定義為≥3次妊娠28周之前的胎兒丟失[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn),3次以上自然流產(chǎn)者妊娠,流產(chǎn)率會(huì)上升至40%[2]。植入前胚胎遺傳學(xué)篩查(PGS)技術(shù)的適應(yīng)證包括反復(fù)自然流產(chǎn)等,利用高通量測(cè)序、囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢技術(shù),有更強(qiáng)的時(shí)間優(yōu)勢(shì),可顯著提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率[3],有效解決遺傳因素造成的流產(chǎn)問題。本研究分組比較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者應(yīng)用PGS技術(shù)后的妊娠結(jié)局,探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。
收集本中心2016年1月—2018年4月復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者95例,其中對(duì)照組55例,行常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET);篩查組40例,接受PGS技術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn):①自然流產(chǎn)≥3次,或2次自然流產(chǎn)且其中至少1次流產(chǎn)物檢查證實(shí)存在病理意義的染色體異常;②夫婦雙方外周血染色體核型正常;③婦科檢查、陰道B超、宮腔腹腔鏡檢查提示無子宮解剖結(jié)構(gòu)異常;④內(nèi)分泌功能檢測(cè)正常,無高泌乳素血癥、無甲狀腺功能異常、無糖尿病或其它內(nèi)分泌疾病;⑤ 陰道微生態(tài)檢查正常,TORCH檢查陰性,無支原體和衣原體等感染;⑥生殖8項(xiàng)抗體檢測(cè)均陰性,凝血功能無異常;⑦男方精液檢查無異常;⑧無長(zhǎng)期吸煙、吸毒、酗酒和射線暴露等生活史。
1.2.1 取卵、受精和胚胎培養(yǎng) 通過個(gè)體化促排卵方案進(jìn)行控制性超促排卵,在注射hCG后36h,經(jīng)陰道B超指引下穿刺取卵。篩查組于取卵后培養(yǎng)30min后脫顆粒,觀察卵子成熟情況,成熟卵子在hCG日后38~40h行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。之后在卵裂胚培養(yǎng)液中洗滌卵子,并將其移入培養(yǎng)皿,放入CO2培養(yǎng)。第1天早晨觀察受精情況,將所有正常受精(2PN來源)的胚胎培養(yǎng)至第3天,進(jìn)行透明帶打孔并轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第5~6天。對(duì)照組于取卵后根據(jù)患者實(shí)際情況進(jìn)行IVF。加精后4h拆除顆粒細(xì)胞,觀察第二極體的出現(xiàn),未出現(xiàn)的成熟卵,加精后6h再次觀察,仍未出現(xiàn)或第二極體不足成熟卵的50%時(shí),即行補(bǔ)救ICSI(同篩查組),放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)胚胎發(fā)育情況和年齡要求,挑選1~3枚形態(tài)發(fā)育較好的胚胎移植入宮腔內(nèi)。
1.2.2 囊胚期胚胎活檢 擬進(jìn)行囊胚期活檢的胚胎于第5或6天采用Gardner的評(píng)分方法對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)定,如形成≥4級(jí)的囊胚即行滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞活檢[4]。將活檢后的囊胚移入培養(yǎng)皿對(duì)應(yīng)微滴,進(jìn)行玻璃化冷凍保存于液氮中,檢出樣本按預(yù)先標(biāo)記的號(hào)碼裝入PCR管檢測(cè)。
1.2.3 染色體篩查 應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù):①胚胎細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增;②取全基因組擴(kuò)增后的DNA,經(jīng)過片段化(超聲或酶切等)選擇一定片段大小的DNA分子(如150~250bp);③通過文庫(kù)構(gòu)建流程,在上述DNA分子兩端加上測(cè)序用接頭;④上機(jī)測(cè)序獲得一定長(zhǎng)度的序列(reads);⑤通過相應(yīng)的軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,獲得每條染色體的統(tǒng)計(jì)量。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)的原理、胚胎DNA測(cè)序數(shù)量的結(jié)果和染色體數(shù)量的相對(duì)變化,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)算法進(jìn)行差異區(qū)分,實(shí)現(xiàn)胚胎染色體非整倍體的植入前篩查。
胚胎移植后14~16d,測(cè)血絨毛膜促性腺激素(β-h CG)值≥5U/L,30d陰道B超示宮內(nèi)有孕囊和胎心搏動(dòng),判定為臨床妊娠。
采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料使用(±s)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
兩組女方年齡、Gn總量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、抗繆勒氏管激素(AMH)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌(FSH、LH、PRL、E2)、平均獲卵數(shù)和MⅡ卵數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表1。
表1 兩組一般資料比較(±s)
表1 兩組一般資料比較(±s)
項(xiàng) 目 對(duì)照組 篩查組女方年齡(歲) 31.4±5.0 29.3±3.5 Gn總 量(U) 2599.1±12.8 2615.8±9.0 BMI(kg/m2) 23.0±2.4 22.4±3.1 AMH(nmol/L) 17.5±2.8 12.9±1.7 b FSH(U/L) 5.7±2.1 6.1±2.6 b LH(U/L) 4.9±2.6 5.3±2.1 bPRL(m U/L) 411.9±44.5 322.7±21.4 bE2(pmol/L) 122.4±10.7 123.2±9.6平均獲卵數(shù)(個(gè)) 11.9±2.3 12.2±2.7 MII卵數(shù)(個(gè)) 10.8±1.7 11.4±1.4
篩查組40例共活檢212枚胚胎,經(jīng)過高通量測(cè)序檢出115枚整倍體胚胎,整倍體率為54.2%;非整倍體胚胎為97枚,非整倍體率為45.8%?!?0歲、31~35歲、36~40歲和>40歲患者,非整倍體率分別為39.4%(37/94)、39.3%(33/84)、76.9%(20/26)、87.5%(7/8),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.631,P<0.05)?!?0歲、31~35歲患者的非整倍體率均低于36~40歲和>40歲患者(χ2=11.523,P=0.001;χ2=7.422,P=0.006;χ2=11.265,P=0.001;χ2=7.380,P=0.007)。
本研究發(fā)現(xiàn)非整倍體胚胎中24條染色體均可出現(xiàn)異常,表現(xiàn)為染色體的缺失或重復(fù)。按照染色體編號(hào),對(duì)非整倍體胚胎染色體異常情況進(jìn)行分類計(jì)數(shù),異常比率為1.4%~15.7%,其中13,22,3,15,16和21號(hào)染色體出現(xiàn)異常比率均>10%。
篩查組胚胎種植率、臨床妊娠率高于對(duì)照組,而早期流產(chǎn)率較對(duì)照組低(P<0.05),見表2。
表2 兩組ICSI/IVF結(jié)局比較[(%)例]
胚胎非整倍性被認(rèn)為是輔助生殖技術(shù)中種植失敗的最常見原因[5],超過25%的流產(chǎn)是非整倍體胚胎導(dǎo)致的[6]。本研究使用高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞全染色體核型分析,非整倍體率為45.8%,與張磊[7]的研究結(jié)果接近。同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)通過PGS后種植率與臨床妊娠率增高,而早期流產(chǎn)率降低,說明經(jīng)過PGS技術(shù)篩選后移植的胚胎整倍體率、胚胎的后期發(fā)育潛能及種植潛能,均高于根據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇的胚胎移植對(duì)照組。因而PGS篩查不僅可以提高患者種植率,同時(shí)還可以減少患者移植次數(shù),減輕患者因流產(chǎn)帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理壓力,這與肖玉紅[8]的研究結(jié)論一致。
Battaglia等[9]研究顯示,女性卵子染色體異常主要與年齡相關(guān)。本研究探討了不同女性年齡胚胎非整倍體率的差異。結(jié)果表明:當(dāng)女性年齡<35歲時(shí),其胚胎的非整倍體率明顯較低,隨著年齡的不斷增加,胚胎的非整倍體率也將隨之增高,尤其對(duì)于>40歲的女性,胚胎的非整倍體率達(dá)到87.5%。
本研究還對(duì)所有胚胎的染色體異常類型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中,23條染色體均可出現(xiàn)異常,其中13-三體和22-三體占比最高。說明13號(hào)和22號(hào)染色體在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者的胚胎中最容易發(fā)生異常。
綜上所述,對(duì)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者行植入前胚胎遺傳學(xué)篩查,可提高胚胎種植率,降低早期流產(chǎn)率。但因本研究納入樣本量較小,本研究存在一定的局限,未來仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,探究植入前胚胎遺傳學(xué)篩查技術(shù)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值,為輔助生殖技術(shù)發(fā)展提供參考。