M1/M2型巨噬細胞在尖銳濕疣皮損中的表達

劉 睿 孫 弦 胡 珍 吳 庭 曹育春 彭才智

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是一種好發(fā)于泌尿生殖器皮膚黏膜部位的增生性性傳播疾病，是由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起，常用治療包括CO2激光、液氮冷凍、光動力、藥物等，但其治療后容易復發(fā)，是臨床中面臨的一大難題[1]。有研究表明，尖銳濕疣治療后復發(fā)的根本原因是HPV感染后營造了局部免疫抑制的微環(huán)境，使其逃避了機體免疫系統(tǒng)的清除，進而引起尖銳濕疣的反復發(fā)作[2]。在人體皮膚黏膜抗HPV感染的免疫過程中，巨噬細胞發(fā)揮了重要作用，它屬于一類髓性的自然免疫細胞，可通過吞噬病毒顆粒、釋放細胞因子等方式抑制病毒感染而產生抗病毒效應。在不同的局部微環(huán)境中，巨噬細胞的功能表型可發(fā)生不同的極化，其中最常見的兩種極化形式為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞[3]。在腫瘤的相關研究中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤實體和間質組織中有較多腫瘤相關性巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)，多表現(xiàn)為M2型巨噬細胞樣功能表型，可以促進腫瘤的發(fā)生和惡性進展等，不利于腫瘤的預后[4]。臨床上尖銳濕疣皮損組織的生長模式類似腫瘤組織，已經有研究發(fā)現(xiàn)[5]，尖銳濕疣組織內有較多的巨噬細胞，而不同表型的巨噬細胞浸潤情況及其對尖銳濕疣復發(fā)的影響尚不清楚。本文通過檢測尖銳濕疣組織中誘導型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)+巨噬細胞(M1型)、CD163+巨噬細胞(M2型)的浸潤情況，以探討其對尖銳濕疣免疫逃逸的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料 尖銳濕疣標本取自武漢市第三醫(yī)院皮膚科2017年1月至2018年1月的30例門診患者，均經組織病理確診為尖銳濕疣。其中男21例，女9例；年齡16～53歲，平均26.5歲；病程1～6個月。所有患者就診前1個月均未接受任何治療，均無其他皮膚病及系統(tǒng)免疫疾病。對照組15例正常皮膚組織來自色素痣整形手術切除后遺棄的正常皮膚組織。CA標本和正常組織的獲取，均已得到患者的知情同意。

1.2 主要試劑 即用型鼠抗人CD163單克隆抗體、即用型鼠抗人iNOS單克隆抗體、即用型免疫組化Elivision-plus 試劑盒(鼠|兔)、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 標本處理及免疫組織化學染色 所有標本獲得后在10%中性福爾馬林溶液中固定24小時，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，行免疫組織化學染色。石蠟切片脫蠟，水化，檸檬酸高壓修復抗原，按試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。用已知的陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 CD163、iNOS主要表達于巨噬細胞的細胞膜或細胞質，以細胞質或細胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性細胞。首先低倍鏡(×100)觀察每張切片的陽性細胞密集區(qū)，然后每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，計數(shù)陽性細胞，取平均值，15天后再用上述方法計數(shù)陽性細胞，兩次結果的平均值作為最后統(tǒng)計結果。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據分析，實驗結果以均數(shù)±標準差表示。采用t檢驗、Pearson線性相關分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 M1/M2型巨噬細胞在尖銳濕疣和正常組織中浸潤情況 iNOS+M1型巨噬細胞在CA皮損組織中數(shù)量為(6.16±3.32)/HP，正常組織中數(shù)量為(6.76±0.87)/HP(圖1)；CD163+M2型巨噬細胞在CA皮損組織中數(shù)量為(22.30±6.27)/HP，正常組織中數(shù)量為(9.81±4.23)/HP(圖2)。在CA皮損組織中，iNOS+M1型巨噬細胞的浸潤與正常組織相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而CD163+M2型巨噬細胞的浸潤與正常組織相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 iNOS+M1型巨噬細胞在CA組織(1a)和正常組織(1b)中的浸潤(SP，×400)圖2 CD163+M2型巨噬細胞在CA組織(2a)和正常組織(2b)中的浸潤(SP，×400)

2.2 M1/M2型巨噬細胞在尖銳濕疣組織浸潤的相關性 在CA組織中，CD163+M2型巨噬細胞浸潤明顯增多的同時，iNOS+M1型巨噬細胞的浸潤減少，經Pearson統(tǒng)計學處理，二者呈負相關性(r=-0.905，P<0.05)(圖3)。

圖3 iNOS+M1型和CD163+M2型巨噬細胞在CA組織中的浸潤呈負相關(直線為計算出的回歸直線)

3 討論

巨噬細胞是機體一類重要的髓性天然免疫細胞，主要通過吞噬作用及分泌細胞因子、致炎因子、活性氧化物等，參與機體的天然免疫和獲得性免疫過程。巨噬細胞的可塑性和異質性很強，效仿Th1/Th2細胞的分型方式，可將巨噬細胞極端的分為兩大類：經典活化的M1型巨噬細胞和選擇性活化的M2型巨噬細胞[6]。在微環(huán)境中干擾素(interferon，IFN)-γ)或/和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)的誘導刺激下，巨噬細胞可極化為經典活化的M1型，其主要參與Th1細胞免疫反應，發(fā)揮針對胞內微生物的免疫清除、抗腫瘤作用及宿主免疫功能等；而在微環(huán)境中白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-13或IL-10、糖皮質激素等的誘導刺激下，巨噬細胞可極化為選擇性活化的M2型，其在機體腫瘤生長及免疫調節(jié)方面發(fā)揮重要作用，參與腫瘤的生長、侵襲，促進血管、淋巴管生成以及抑制T細胞和自然殺傷細胞的免疫活性[6，7]。M1型巨噬細胞高表達HLA-DR、iNOS等，而M2型巨噬細胞高表達清道夫(如CD163)、甘露糖(如CD206)等表面受體以及精氨酸酶(arginase，ARG)1，低表達iNOS酶[7，8]。其中，iNOS酶主要由M1型巨噬細胞合成分泌，催化L-精氨酸產生NO和L-瓜氨酸，NO參與機體炎癥反應、殺滅微生物及抗腫瘤過程，可作為M1型巨噬細胞的標記物[8]。CD163屬于富含半胱氨酸的清道夫受體膜蛋白家族，主要表達于單核巨噬細胞系的表面，可以結合血紅蛋白-珠蛋白復合物，從而將血紅蛋白攝入單核-巨噬細胞中參與代謝，多被用來標記M2型巨噬細胞[8，9]。

本研究選用iNOS作為M1型巨噬細胞的標記，CD163作為M2型巨噬細胞的標記，進行免疫組織化學染色。免疫組織化學結果顯示，尖銳濕疣皮損組織中M1型巨噬細胞的浸潤數(shù)量較正常組織無明顯差異，而M2型巨噬細胞數(shù)量明顯多于正常組織，且M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的浸潤呈負相關，說明隨著M2型巨噬細胞的浸潤增多，M1型巨噬細胞浸潤隨之減少。該研究結果初步證實了尖銳濕疣皮損組織中有較多的M2型巨噬細胞浸潤，即M2型巨噬細胞在尖銳濕疣局部免疫中處于優(yōu)勢，結合M2型巨噬細胞具有負向免疫調節(jié)作用，故其可能在尖銳濕疣皮損組織局部免疫逃逸過程中發(fā)揮了重要作用。而對于尖銳濕疣組織中的巨噬細胞如何轉變?yōu)镸2型巨噬細胞的機制，目前還不完全清楚。已經有研究證實，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞可以影響巨噬細胞表型及功能的變化[10]，而尖銳濕疣皮損組織中存在較多的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞[5]。故我們推測尖銳濕疣皮損中的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞可能參與了巨噬細胞表型轉化過程，這需要進一步研究去證實。