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    麻風生物樣本庫的建立和應用

    2019-03-07 13:08:10王真真于功奇付希安暴芳芳孫勇虎糜自豪孫樂樂初同勝周桂芝楊榮德李進嵐熊俊浩熊明洲段啟志曠燕飛李俊華王臘梅操秋陽肖邦忠張連華藺兆星王耀斐沈云良1嚴麗英1武文斌1虎1占先發(fā)1李旺華1尚修建1許玉軍1巧1嚴良斌張國成陳樹民張福仁22
    中國麻風皮膚病雜志 2019年2期
    關鍵詞:麻風病麻風標本

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    麻風是由于麻風分枝桿菌感染易感個體,侵犯皮膚和外周神經的慢性傳染病,晚期可導致畸殘。自上世紀80年代以來,由于治療學上的進步使現癥病人顯著減少[1]。自上世紀末,我國多數省市已達到世界衛(wèi)生組織(WHO)和我國政府控制麻風的標準,但由于缺乏一級預防措施,在達標后的10余年里,全國新發(fā)麻風病例并無明顯減少,麻風所導致的畸殘依然存在。為消除麻風危害,衛(wèi)生部聯合十一部委聯合下發(fā)了“消除麻風危害中長期規(guī)劃(2011-2020)”[2]。

    麻風的危害表現主要表現為致殘和在治療過程中發(fā)生的重癥藥物不良反應所導致的死亡。欲從根本上消除麻風危害,只有在基礎研究領域取得重大突破。有效的生物樣本是開展基礎研究和國際合作的前提。

    有鑒于此,研究團隊自2005年開始在省內外收集麻風生物樣本,以生物樣本為基礎開展了系列研究并取得預期結果。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 儀器設備 立式-80℃冰箱(SANYO,MDF-U73V;Thermo Fisher,88700V62);臥式-20℃冰箱(澳柯瑪,DW-25W525);標簽打印機(BRADY,BP-IP300);低溫離心機(Eppendorf,5430R);各種規(guī)格移液器(Eppendorf);電泳儀(EC3000-90);凝膠成像系統(tǒng)(Tanon,4100);高通量微量紫外可見光光度計(Nanodrop8000);核酸提取儀(KURABO,QuickGene-610L;天根生化,TGuide-M16)。

    1.1.2 試劑 全血總DNA提取試劑盒(QuickGene DNA whole blood kit;TGuide 大體積血液基因組DNA提取試劑盒)。

    1.1.3 耗材 1.5 mL離心管、各種規(guī)格吸頭(Axygen);5ml抗凝采血管、促凝管(山東威高);專用凍存盒(AVANTECH);拭子(揚州曉康醫(yī)療器械有限公司)。

    1.1.4 軟件 樣本庫管理軟件(山東艾創(chuàng)信息技術有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 樣本采集前準備工作

    1.2.1.1 倫理申請 項目負責人向山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會提出倫理申請,通過倫理委員會審批。

    1.2.1.2 樣本采集對象 根據全國麻風病防治管理信息系統(tǒng)錄入的麻風患者信息,導出全國麻風患者數據,然后委托各省市麻風防治工作人員進行摸底調查,確定具體樣本采集數量和地點。

    1.2.2 樣本采集入庫流程

    1.2.2.1 知情同意 在樣本采集之前,需要麻風患者充分了解樣本采集的種類,數量和樣本用途,簽署知情同意書。

    1.2.2.2 樣本采集 采集麻風患者樣本,每例患者利用標準試管采集EDTA抗凝血1管,促凝血1管,鼻黏膜拭子2支(左右鼻孔各1支),皮損組織1塊(體積不大于0.5 cm3),在所采集的每例樣本管上做唯一標識用于暫時區(qū)分不同患者的樣本。樣本采集后立即保存于4℃條件,低溫運輸至實驗室。

    1.2.2.3 樣本分離 采集到的促凝血樣本需4000 rpm,離心5分鐘分離血細胞與血清,待離心完畢,一次性移液管將上層血清樣本轉移至無菌凍存管中。采集到的抗凝血需利用QIAamp DNA Blood Mini Kit完全抽提為3份基因組DNA,共1 mL,保存至無菌離心管中。

    1.2.2.4 樣本入庫 在樣本分離處理完畢,根據實驗室不同樣本類型編號原則,對所采集樣本編制唯一編號,反應樣本數量、類型等指標,標簽貼于保存管壁。

    1.2.2.5 樣本信息管理 將所采集樣本的信息編制成EXCEL表格,導入至樣本庫管理軟件“生物銀行”中,然后與樣本實現一一對應。

    1.2.2.6 樣本質量控制 隨機抽取100份基因組DNA,移取3 μL利用1%瓊脂糖凝膠電泳30分鐘,拍照分析DNA質量。

    2 結果

    2.1 樣本的收集情況 從2005年至今已采集、處理、保存來自全國19個省份的標本81,532份。包括組織標本35,268份,血液標本33,320份,微生物標本(鼻黏膜拭子)12,944份。其中血液標本中麻風散發(fā)病例11,964例(多菌型8,135例,少菌型3,829例),麻風家系396個(含標本1,918例),對照全血標本19,438例(詳見表1);麻風散發(fā)病例和正常對照來自19個省份,其中42%麻風散發(fā)病例和64%的正常對照來自于山東省。其中麻風散發(fā)病例和正常對照來自漢、壯、彝等19個民族,漢族來源的樣本在麻風散發(fā)病例和正常對照中所占比例分別為72%和88%(詳見表2);其中HLA-B*13:01陽性并發(fā)生氨苯砜綜合征的患者104例,HLA-B*13:01位點陽性但未發(fā)生氨苯砜綜合征的麻風患者1,725例。

    所有樣本經處理后保存于超低溫冰箱中,臨床資料和存儲位置等信息全部導入樣本庫管理軟件,實現了對樣本儲存信息的可視化管理,同時具有檢索、歸類等多種功能,可以在較短時間內搜尋目的樣本。

    表1 麻風生物樣本庫總樣本量

    表2 麻風散發(fā)病例及正常對照全血樣本來源的民族分布

    2.2 麻風生物樣本庫的應用 以上述生物樣本為基礎,成功獲得國家自然科學基金(30771943、81072391、81071288、81101187、81271746、31200933、81371721、81402593、81472869、81472868、81573036、31601040、81602746、81601387、81703110、81701579)、973前期研究專項(2011CB512105)、863計劃青年科學家專題(2014AA020505)、國際(地區(qū))合作與交流項目(81620108025)、戰(zhàn)略性國際科技創(chuàng)新合作重點專項(2016YFE0201500)以及省部級項目支持,先后開展了麻風病因學系列研究和重癥藥物不良反應風險因子研究,發(fā)現麻風系列風險因子和氨苯砜綜合征風險因子,取得了一系列原創(chuàng)性成果(相關研究成果先后發(fā)表在《New England Journal of Medicine》[3,4]、《Nature Genetics》[5,6]、《The American Journal of Human Genetics》[7]、《Nature communications》[8]、《Human Molecular Genetics》[9]、《The Journal of investigative dermatology》[10]等國際知名學術期刊;獲得國內外專利ZL201210372030.6、ZL201210372029.3、ZL201210375609.8、ZL201210407149.2、ZL201410531166.6、ZL201410532195.4、ZL201410531170.2、ZL201410531168.5、ZL201410531724.9、ZL201410531143.5、14110274.0、10-2014-7018133、14/370,465、11201403447V、2015-537106、P00201403711)。上述科學發(fā)現的及時轉化使發(fā)現麻風高危個體從而實現精準化學預防成為現實,同時實現了對氨苯砜綜合征的成功預防,有效消除了麻風危害。

    資源庫的建立和不斷充實,不僅使本團隊引領了麻風相關研究的國際大合作[3-10],為國內外同行的研究提供了支持[11-18]及相關的生物信息學支持(dpGap study accession: phs000217.v2.p1)。

    2 討論

    近年來,隨著全基因組芯片掃描技術、高通量測序技術、各類組學與生物信息學的快速發(fā)展,個體化醫(yī)療、轉化醫(yī)學與精準醫(yī)學成為國際醫(yī)學前沿研究的重要概念。如何將基礎研究成果應用于臨床已成為科學研究成員關注的焦點,而高質量的樣本來源是一切的物質基礎,標準化的生物樣本庫是個體化醫(yī)療[19]、轉化醫(yī)學[20]與精準醫(yī)學計劃[21]的資源支撐。生物樣本庫的建立不僅有利于科學研究設計的整體規(guī)劃,還提高了存儲容器的利用率及取樣效率。

    麻風生物樣本庫具有來源廣泛、種族豐富、數量充足、樣本類型多樣等特點,而且每一份樣本都攜帶完整的臨床信息。本樣本庫在收集麻風散發(fā)樣本時,尤為注重與之年齡、性別、地域、民族匹配的正常對照樣本的采集,這些標準大大提高了生物樣本庫樣本的利用率。今后我們仍會延續(xù)前面的樣本收集標準和流程,持續(xù)不斷的收集麻風病例及匹配的正常對照,不斷豐富麻風生物樣本庫。

    麻風生物樣本庫不僅可供永久性研究需要,還搶救和保護了我國寶貴的遺傳資源,為我國乃至人類保存了基因資源,更使我國占領了該領域的科學制高點。在本標本庫建成之前,麻風病因學研究的重大發(fā)現被一直為歐美科學家所壟斷[22-25],自2009年本團隊發(fā)表第一篇研究論著以來,該領域的研究一直為我國所引領[3-10]。

    科學發(fā)現的及時轉化加速了我國消除麻風危害的進程,提前實現了衛(wèi)生部等11部委聯合下發(fā)的《全國消除麻風病危害規(guī)劃(2011-2020年)》(衛(wèi)疾控發(fā)[2011]76號)[2]的目標,也為我國麻風防控技術走向國際、造福人類提供了契機,更為實現習近平總書記在第19屆國際麻風大會的賀詞中所指出的為“創(chuàng)造一個沒有麻風的世界”(http://news.xinhuanet.com/2016-09/19/c_1119587381.htm)貢獻了中國智慧。

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