魚肉肌紅蛋白的呈色機(jī)理及其在熱加工中對(duì)肉色的影響

1.浙江國(guó)際海運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江舟山 316021 2.浙江工商大學(xué)水產(chǎn)品加工研究所 浙江杭州 310035 3.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江杭州 310035

水產(chǎn)品是人們?nèi)粘ｏ嬍持胁豢扇鄙俚闹匾糠?，尤其是魚類，由于肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛。魚肉的顏色是評(píng)價(jià)魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。肉及肉制品顏色的變化是一個(gè)較為復(fù)雜的話題，包括了眾多的影響因素，比如肉的來源，屠宰前和屠宰時(shí)的條件，肌肉的理化成分以及肉品的加工、包裝、物流、貯藏和消費(fèi)條件。原因不盡相同，但歸根結(jié)底的基本影響因素始終為肌肉中呈色物質(zhì)—血紅素蛋白質(zhì)的變化[1]。

魚肉中的血紅素蛋白質(zhì)包括肌紅蛋白和血紅蛋白，其中，血紅蛋白主要分布在魚的內(nèi)臟和血管中，在加工貯藏中易流失；肌紅蛋白分布在肌肉細(xì)胞中，是魚肉(尤其是金槍魚屬和一些暗色肉魚類)的主要呈色物質(zhì)，據(jù)報(bào)道[2]，黃鰭金槍魚暗色肉中的Mb含量為5.3～24.4mg/g，而其血液中的Hb含量也只為0.5～3.8mg/g，故肌紅蛋白的變化直接影響肉色的變化。肌紅蛋白的化學(xué)狀態(tài)受諸多因素影響，如溫度、pH值、脂肪氧化、氧分壓、離子強(qiáng)度等[3]。

除了生鮮、冷凍魚的消費(fèi)，部分魚肉加工成半成品、熟制品進(jìn)行銷售流通，如柴魚、蒸煮后進(jìn)行軟包裝的魚片、魚柳，魚肉罐頭等。在一些熱加工中，魚肉顏色會(huì)發(fā)生較大的變化。

本文通過闡述肌紅蛋白的基本理化性質(zhì)、呈色機(jī)理和常用檢測(cè)方法，對(duì)影響肌紅蛋白氧化的因素、肌紅蛋白在熱加工中所引起的肉色變化及其原因進(jìn)行了分析和討論，旨在為魚肉熱加工中的護(hù)色工藝提供參考依據(jù)。

1 肌紅蛋白的理化性質(zhì)及呈色原理

1.1 肌紅蛋白

肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)是一種存在于動(dòng)物肌肉組織細(xì)胞中的球狀蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量為15 000～17 000Da，由一條多肽(球蛋白，Globin)和一個(gè)血紅素(Heme，Hemin)構(gòu)成，為水溶性蛋白質(zhì)。Mb在不同條件下具有多種結(jié)構(gòu)，其中脫氧肌紅蛋白(Deomyoglobin，DeoMb)、氧合肌紅蛋白(Oxymyoglobin，OxyMb)和高鐵肌紅蛋白(Metmyoglobin，MetMb)為常見的三種衍生物。

圖a為脫氧肌紅蛋白結(jié)構(gòu)；圖b為氧合肌紅蛋白結(jié)構(gòu)；圖c為高鐵肌紅蛋白結(jié)構(gòu)圖1 三種肌紅蛋白衍生物的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The structure of myoglobin and the different coordination on porphyrin ring

血紅素是卟啉環(huán)與鐵原子的絡(luò)合物，是肌紅蛋白呈色的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)(圖1)。中心鐵原子具有六個(gè)配位鍵，通常形成一個(gè)正八面體，其中四個(gè)與卟啉環(huán)的四個(gè)吡咯環(huán)氮配位，第五位與多肽鏈中組氨酸的咪唑基配位，第六配位鍵根據(jù)配合物的不同分別形成脫氧肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白(與水分子結(jié)合，圖1a、圖1c)和氧合肌紅蛋白(與氧分子結(jié)合，圖1b)。DeoMb和OxyMb中的鐵原子為還原態(tài)(II)，血紅素稱為亞鐵血紅素(Heme)；MetMb中的鐵原子為氧化態(tài)(III)，相應(yīng)的血紅素稱為高鐵血紅素(Hemin)。

1.2 肌紅蛋白的呈色原理

肌肉顏色的變化與Mb的化學(xué)狀態(tài)是緊密相關(guān)的。圖2顯示了各種肌紅蛋白衍生物之間的相互轉(zhuǎn)變。在活魚或剛翻肚皮魚的肌肉中，Mb主要以還原態(tài)(II)的形式存在，魚肉呈鮮紅色(粉紅色)或深紫色(高濃度DeoMb呈深紫色，常見于大型魚體的深層魚肉中)。其中，OxyMb和DeoMb會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)變，DeoMb轉(zhuǎn)變OxyMb的過程稱為氧合氧化。魚死后，在貯藏過程中，Mb(II)則逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镸etMb(III)，使魚肉呈褐色，這個(gè)過程為血紅素蛋白質(zhì)的自動(dòng)氧化(Autoxidation)。這種顏色的變化，可通過Mb各種衍生物特有的吸收光譜進(jìn)行測(cè)定。另外，Mb的自動(dòng)氧化還會(huì)產(chǎn)生一些超氧陰離子自由基(O2·-和·OOH)，這些物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步歧化生成H2O2[4]。MetMb在H2O2等過氧化物的作用下進(jìn)一步氧化，生成具有極強(qiáng)促氧化能力的超鐵肌紅蛋白自由基(Perferrylmyoglobin，Mb-Fe IV)和超鐵肌紅蛋白(Ferrylmyoglobin，Mb-Fe IV)。但這種肌紅蛋白(Fe IV)由于生成量極少且性質(zhì)活潑不穩(wěn)定，容易發(fā)生自動(dòng)還原生成MetMb[5]。

圖2 各種肌紅蛋白衍生物之間的相互轉(zhuǎn)變Fig. 2 Dynamic Conversion between the different myoglobin

魚在貯藏加工中，大量的OxyMb轉(zhuǎn)變?yōu)镸etMb，肉色逐漸褐變。研究表明[6,7]MetMb的結(jié)構(gòu)比OxyMb不穩(wěn)定，血紅素與肽鏈的結(jié)合力遠(yuǎn)弱于OxyMb[8]，故其卟啉環(huán)更易發(fā)生裂解而造成血紅素和鐵離子的丟失，這是在保藏期長(zhǎng)或者一些加工程度高的魚肉中出現(xiàn)褪色現(xiàn)象的原因之一。

2 魚肉Mb常用檢測(cè)方法

根據(jù)魚種類和肌肉類型的不同，肌紅蛋白易在貯藏和加工期間易發(fā)生變化或流失，故檢測(cè)Mb含量對(duì)評(píng)價(jià)肉色有重要作用。DeoMb、OxyMb、MetMb在紫外可見區(qū)域都具有特征吸收光譜，魚類的Mb在可見光波長(zhǎng)內(nèi)的吸收光譜基本相同，在410nm附近有強(qiáng)吸收峰，在500～750nm范圍具有若干個(gè)弱吸收峰。根據(jù)Mb的特征吸收光譜，可應(yīng)用朗伯-比爾定律(A=εbc)來測(cè)定Mb的含量，但不同來源的Mb吸收光譜有所差異。根據(jù)前人的研究[9～12]，幾乎所有的計(jì)算公式(計(jì)算禽畜和魚類等動(dòng)物肌肉中的MB含量)是基于馬Mb的消光系數(shù)，大多采用其近似公式，故有一定的局限性。

由于不同Mb衍生物的顏色不同，Mb含量及三種衍生物的比例，尤其是MetMb的比例對(duì)魚肉顏色有較大的影響，故三種Mb衍生物發(fā)的百分含量可作為肉色的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一。近些年涉及Mb衍生物含量測(cè)定的研究中，應(yīng)用較多的是以馬心Mb的吸收光譜為基礎(chǔ)所建立的計(jì)算方程[12]。Matsuura(1955)[13]和Brown(1962)[14]等人報(bào)道大目金槍魚和藍(lán)鰭金槍魚的Mb衍生物具有相同的最大吸收波長(zhǎng)和最小吸收波長(zhǎng)，并比較了幾種魚類Mb的吸收光譜。Chotika(2011)等人[15]以大眼金槍魚三種Mb衍生物的吸收光譜為基礎(chǔ)，建立了金槍魚Mb濃度的計(jì)算方程，該方程在一些魚類肉色和魚類Mb的研究中應(yīng)用較多，其它魚類的計(jì)算方法還未被明確報(bào)道過。

近期，張同剛(2018)等人[16]報(bào)道采用于拉曼光譜法來無損檢測(cè)冷鮮牛肉中肌紅蛋白相對(duì)含量，并得到相關(guān)的推導(dǎo)公式，具有一定的可行性。該方法在魚類Mb相對(duì)含量的檢測(cè)應(yīng)用上還未見報(bào)道。

3 影響Mb穩(wěn)定性的因素

魚肉在加工貯藏中，肉色主要由Mb的性質(zhì)決定，Mb穩(wěn)定性的影響因素包括Mb的溶解度，熱穩(wěn)定性、自動(dòng)氧化性質(zhì)及促氧化因素、高鐵肌紅蛋白還原酶系等。

3.1 Mb的溶解度

Mb是水溶性蛋白質(zhì)，研究表明即使反復(fù)多次用水抽提暗色肉的Mb，也不能使魚肉完全脫色，這是由于穩(wěn)定的肌原纖維蛋白質(zhì)在機(jī)械操作下發(fā)生變性，包裹住了Mb，以致其難于溶出[17]。所以大部分魚肉在加工中，無法消除因Mb變化所引起的肉色變化。

3.2 Mb的熱穩(wěn)定性

Mb穩(wěn)定性因魚的種類和衍生物類型而異，一般魚類Mb比哺乳動(dòng)物類Mb的熱穩(wěn)定性差，尤其是MetMb，容易發(fā)生熱變性。此外，Ledward(1971)[18]等人已經(jīng)證實(shí)Mb在肌肉中的熱穩(wěn)定性比在其肌肉相同pH值和離子強(qiáng)度的溶液中的熱穩(wěn)定性要低得多。但沙丁魚的MetMb在某些條件下，對(duì)熱是極其穩(wěn)定的，這在沙丁魚的加工上是值得注意的。

3.3 Mb的自動(dòng)氧化性質(zhì)及促氧化因素

魚類Mb的自動(dòng)氧化速度比其他來源的Mb快得多，比如同一條件下是哺乳類動(dòng)物Mb氧化速度的2.5～4倍。Mb氧化一般發(fā)生在Mb結(jié)構(gòu)中的血紅素鐵部分，珠蛋白部分幾乎不發(fā)生同步氧化。低pH值，高鹽濃度、非血紅素鐵[19]、脂質(zhì)氧化[20～22]等因素都能明顯促進(jìn)Mb的氧化。此外，有較多研究[23～25]證明脂質(zhì)氧化和Mb氧化存在密切聯(lián)系，脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的初、次級(jí)代謝產(chǎn)物具有促進(jìn)Mb氧化的作用[26,27]，進(jìn)而加速肉色褐變或褪色。此外，脂質(zhì)氧化對(duì)不同來源的Mb的促氧化作用有所差異[28]。

3.4 高鐵肌紅蛋白還原酶系

在活體魚的血紅細(xì)胞中存在高鐵肌紅蛋白還原酶系(MetMb還原酶系)，能不斷將MetMb還原，使其維持在2%～3%左右[29]。近年來關(guān)于MetMb還原酶對(duì)肉色穩(wěn)定性作用的研究中，由于Mb的來源不同，實(shí)驗(yàn)方法有差異，兩者的相關(guān)性還存在一些爭(zhēng)議[2]。松浦等人(1962)[30]認(rèn)為藍(lán)鰭金槍魚中的MetMb還原酶與其肉色穩(wěn)定性呈正相關(guān)，且是維持魚肉鮮紅色的主要原因。肌肉中存在豐富的毛細(xì)血管，其中殘留的還原酶就延緩了肉色的褐變。不過，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和加熱溫度的升高，還原酶系的活性將會(huì)逐漸減弱，直至完全消失。

4 熱加工中Mb及肉色的變化

加熱后的魚肉會(huì)呈現(xiàn)出白、粉紅、紅、暗褐色等各種顏色。一些Mb含量較少的魚加熱后一般呈白色、淺粉紅色或淺褐色，Mb含量較高的紅肉魚(鮐魚、金槍魚、鰹魚、秋刀魚、鯖魚、沙丁魚等)則多呈紅或暗褐色。熱處理使Mb的珠蛋白變性，也使原本與血紅素鐵第六配位鍵結(jié)合的水分子被肉中微量的尼克酰胺等堿基所取代，此時(shí)血紅素轉(zhuǎn)變?yōu)檠?Hemochrome,Fe2+)。小泉[31]以金槍魚魚肉的Mb為原料進(jìn)行了研究，認(rèn)為金槍魚中尼克酰胺含量量相對(duì)較少，還不夠使全部的Mb變?yōu)檠?。?dāng)加熱溫度較低或加熱時(shí)間較短時(shí)，Mb幾乎不變性，若魚肉中尼克酰胺等堿基的含量較高，Mb則大部分變?yōu)檠?，使肉的顏色變?yōu)榧t色或粉紅色。當(dāng)魚肉中尼克酰胺等堿基含量較低時(shí)，生成的血色原不穩(wěn)定，立刻被氧化成高鐵血色原(Hemichrome，F(xiàn)e3+)，使肉呈現(xiàn)棕褐色。此外，Ledward(1971)[18]認(rèn)為在低于Mb熱變性的溫度下，Mb也會(huì)發(fā)生構(gòu)象的改變，使結(jié)構(gòu)中的血紅素暴露，并與其它已產(chǎn)生變性的蛋白質(zhì)結(jié)合。比如，側(cè)鏈帶有咪唑基團(tuán)的變性蛋白質(zhì)會(huì)與血紅素中的鐵原子發(fā)生螯合并最終取代珠蛋白，所以他認(rèn)為熟肉中的肌紅蛋白是一些血紅素和幾種蛋白質(zhì)相結(jié)合的混合物。

Mb的氧化還原狀態(tài)會(huì)也影響魚肉加熱后的顏色。一般來說，DeoMb比OxyMb和MetMb具有更好的熱穩(wěn)定性[32]。當(dāng)魚肉的MetMb含量較高時(shí)，加熱后高鐵血色原所占比例高，肉呈暗褐色。研究表明[33]，當(dāng)牛肉中OxyMb和MetMb比例較高時(shí)，加熱后更容易提前出現(xiàn)進(jìn)一步的褐變(相比于DeoMb比例較高的牛肉)；提高加熱溫度和延長(zhǎng)加熱時(shí)間會(huì)降低牛肉的紅度值[34]。該研究結(jié)果這對(duì)Mb含量較高的紅肉魚的熱加工有一定的借鑒作用。

有研究[25]指出脂質(zhì)氧化的初級(jí)代謝產(chǎn)物(過氧化物)能加速M(fèi)b結(jié)構(gòu)中卟啉環(huán)的裂解。加熱能加速脂質(zhì)氧化及降低Mb結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使蒸煮鰹魚在貯存過程中發(fā)生嚴(yán)重的褪色現(xiàn)象[35]。

前文提到MetMb還原酶系能有效降低MetMb的含量，該酶在50℃左右就失去活性了[32]，但肌肉中存在著一個(gè)NADH-MetMb減少系統(tǒng)，即使是在60℃左右這樣的高溫下，也能使MetMb產(chǎn)生類似于OxyMb的鮮紅色[36]。當(dāng)肉的pH值較低且加熱溫度相對(duì)較低時(shí)，已變性Mb中的鐵離子很可能還保持2價(jià)狀態(tài)，從而呈現(xiàn)粉色或紅色，而不是常見的灰色或棕褐色[37]。

肉類的包裝方式對(duì)加熱后的顏色變化也有重要影響。Torngren(2003)[38]發(fā)現(xiàn)將采用高濃度氧氣MAP包裝的牛排加熱時(shí)，其表示熟肉的棕褐色會(huì)提前出現(xiàn)。而一氧化碳MAP包裝的肉類在加熱時(shí)更能保持肉原有的粉紅色[39]，這是由于CO-Mb的熱穩(wěn)定性較高(高于DeoMb)。John(2004)和Seyfert(2004)等人[40～42]對(duì)MAP包裝氣體比例含量等因素對(duì)肉類加熱后顏色變化的影響進(jìn)行了研究。

此外，其他一些因素也會(huì)影響加熱后的肉色。比如長(zhǎng)鰭金槍魚罐頭中的肉一般呈粉紅色，但當(dāng)原料肉中含有較多的氧化三甲胺時(shí)，蒸煮后的肉容易呈現(xiàn)青綠色。

綜上所述，熱處理后Mb結(jié)構(gòu)的變化與肉色有密切聯(lián)系，原料種類(尼克酰胺等堿基的含量)、原料的新鮮度(MetMb與變性Mb的比例)、脂質(zhì)氧化引起的Mb結(jié)構(gòu)變化等因素對(duì)加熱后的肉色有重要影響，此外加熱溫度、pH值、包裝方式、氧化產(chǎn)物等其他因素在魚肉熱加工中應(yīng)予以考慮。

5 小結(jié)

魚肉熱加工重要的是魚肉肌紅蛋白含量較一般的畜肉類低，但在魚肉的加工貯藏中，Mb的變化也會(huì)引起肉色較大的改變。加熱是一種較常見傳統(tǒng)的肉品加工方式，熱處理后Mb結(jié)構(gòu)的變化與肉色有密切聯(lián)系，魚肉種類、原料的新鮮度、脂質(zhì)氧化程度、加熱溫度、pH值、包裝方式、氧化產(chǎn)物等其他因素對(duì)加熱后的肉色有重要影響。故要根據(jù)魚肉肌紅蛋白的特性，以及產(chǎn)品加工及貯藏方式的特點(diǎn)，充分考慮熱加工中肌紅蛋白變化引起的感官品質(zhì)變化，合理改進(jìn)加工工藝條件，以盡量降低由肌紅蛋白改變引起的質(zhì)量下降。