基于“逆流挽舟”法探索人參敗毒散對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠胃腸功能的影響及作用機(jī)制*

陳 嵐，賈 波，鄧懷涵，賈志超，李 純

成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都610075)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種病因尚不明確的直腸結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病，屬于炎癥性腸病中的一種。主要局限于大腸黏膜及黏膜下層，以腹痛、腹瀉、黏液樣膿血便、里急后重等為主要癥狀[1]。潰瘍性結(jié)腸炎具有病程長、遷延難愈、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，存在一定癌變風(fēng)險(xiǎn)，治療難度大，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療本病多采用氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑等藥物，必要時(shí)采取手術(shù)，但總體療效不如意[3]。近年文獻(xiàn)報(bào)道，腸黏膜屏障功能損傷被認(rèn)為是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的主要因素，成為關(guān)注焦點(diǎn)[4]。腸黏膜緊密連接蛋白維持腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能，緊密連接蛋白參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、維持血管功能以及調(diào)控細(xì)胞間通透性，在UC發(fā)病機(jī)制中起重要作用。中醫(yī)雖UC病名，就其臨床特點(diǎn)而言，歸屬于中醫(yī)學(xué)“痢疾”、“泄瀉”等范疇[5]，清·喻嘉言首創(chuàng)“逆流挽舟”之名，將此法明確為治痢大法，推崇人參敗毒散為“逆流挽舟”法代表方。人參敗毒散具有升陽舉陷、勝濕止瀉、扶正祛邪之功效。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過對UC大鼠胃腸功能指標(biāo)及腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)，探討人參敗毒散對潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng) 物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體重(200±20)g，購于成都達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司，合格證號(hào)SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)北樓實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。

2 藥物及試劑 人參敗毒散(據(jù)明《奇效良方》按現(xiàn)代劑量換算為柴胡12 g，川芎9 g，前胡、甘草、人參、桔梗、羌活、獨(dú)活、茯苓、枳殼各6 g，薄荷、生姜各3 g，共75 g)，均購于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，為四川新荷花中藥飲片股份有限公司產(chǎn)品。TNBS(美國Thermo Fisher公司，貨號(hào)28997 批號(hào)SC246522)，無水乙醇(成都市科龍化工有限公司，批號(hào)20160607)，水合氯醛(成都市科龍化工有限公司，批號(hào)20170316)，柳氮磺胺吡啶(SASP批號(hào)09170313，上海信誼天平藥業(yè)有限公司)，連接黏附分子(JAM)抗體(美國Abcam公司，貨號(hào)ab180821)，GAPDH(美國Abcam公司，貨號(hào)ab181602)。營養(yǎng)性半固體糊備制：參考文獻(xiàn)[6]，羧甲基纖維素鈉10 g，溶于250 ml 蒸餾水中，全溶解后，加入奶粉16 g，淀粉8 g，蔗糖8 g和活性炭粉末2 g，攪拌均勻，配制成1 ml/g的黑色半固體糊狀物，冰箱冷藏備用，使用時(shí)恒溫水浴鍋溫至常溫。

3 儀 器 PPT-A+100型電子天平(美國康州HZ電子科技有限公司)，BA400 Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，AC8型洗板機(jī)(美國ThermoLabsystems公司)，GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，移液器(吉爾森P型移液器公司)，ABI-7300型Real-time檢測儀(英國ABI公司)，K30型旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠)，PRO200型電動(dòng)勻漿機(jī)(德國FLUKO公司)，Tanon-5200型成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

4 方 法

4.1 造模方法：參照Morris等[7]方法制作TNBS誘導(dǎo)的UC 大鼠模型。大鼠造模前禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛0. 2 ml/100g 腹腔注射麻醉，用內(nèi)徑1.5 mm無菌灌腸硅膠管輕輕從大鼠肛門插入6～8 cm，推入TNBS溶液(100 mg/kgTNBS+50%乙醇0.25 ml)，捏緊肛門，提尾倒立3～5 min后，放回籠中自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)。正常組大鼠用相同體積的0.9% 氯化鈉注射液灌腸，其余均與TNBS組相同。

4.2 分組與給藥：動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)分組法將60只SD大鼠分為6組，分別為正常組、模型組、西藥組(柳氮磺胺吡啶)、人參敗毒散高、中、低劑量組。造模24 h后，除正常組和模型組外，其余各組灌胃給藥，人參敗毒散高、中、低劑量組生藥依據(jù)體表面積換算法進(jìn)行換算(31.2、15.6、7.8 g/kg，西藥組0.5 g/kg?？瞻捉M從實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束正常飲水喂食，模型組按10 ml/kg 灌胃生理鹽水7 d，其余4組每次灌胃量為10 ml /kg，連續(xù)給予相應(yīng)藥物7 d。

4.3 取材、指標(biāo)觀察：各組動(dòng)物最后一次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h后，各組大鼠灌胃給予營養(yǎng)性半固體糊 2 ml，30 min后頸椎脫臼法處死大鼠，迅速剖開腹腔，分別結(jié)扎大鼠胃賁門、幽門部兩端及直腸末端，清洗胃表面血漬、黏液，稱取胃總質(zhì)量(W1)，沿胃大彎剪開胃體，洗凈胃內(nèi)殘留物，濾紙吸干水分，稱取胃凈質(zhì)量(W2)，計(jì)算胃殘留率。然后取出幽門至回盲部的腸段，在無張力情況下用直尺測量其長度，即小腸總長度(L1)；然后再測出半固體營養(yǎng)糊標(biāo)記物長度，即幽門到半固體黑色營養(yǎng)糊在腸道內(nèi)推進(jìn)的長度(L2)，計(jì)算小腸推進(jìn)率。再迅速沿腸系膜緣剖開腹部，取肛門上約4～10 cm至盲腸部分的腸段，并沿縱軸剪開，用預(yù)冷PBS液沖洗結(jié)腸段，去除結(jié)腸黏膜表面的糞便、分泌物及血液。取1～2 g結(jié)腸段，置于1.5 ml EP管中，迅速置于液氮冷卻保存，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，留于結(jié)腸組織JAM蛋白表達(dá)檢測。

4.4 Real-time PCR檢測結(jié)腸組織中JAMmRNA的表達(dá)：稱取大鼠結(jié)腸組織約30 mg，采用Trizol法提取總RNA，按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄RNA，測定RNA的質(zhì)量和濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。JAM和內(nèi)參基因GAPDH檢測引物序列如下： JAM(248bp)上游：5'CCCTCCCTCCTTTCCTTACC 3'，下游：5' CAGCCCATCTTCCTCCAGTC 3'；內(nèi)參GAPDH(181bp)上游：5' GTCGGTGTGAACGGATTTG 3'，下游：5' TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3'。按Real-time PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min；95℃，變性15 s，60℃退火45 s后采集信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件(ABI Prism 7300 SDS Software)分析PCR過程各檢測樣本Ct(threshold cycle)值。根據(jù)內(nèi)參及各指標(biāo)Ct值，使用相對定量法2-△△Ct法計(jì)算個(gè)mRNA的相對表達(dá)量。

4.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法檢測JAM的蛋白表達(dá):在冰上將大鼠結(jié)腸組織剪成細(xì)小的碎片，按每20 mg組織加入150250μl裂解液的比例加入裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12000×g 離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱備用。采用Western Blotif法檢測各腸組織JAM的蛋白表達(dá)。通過Image J軟件分析Western blot結(jié)果，以公式(蛋白表達(dá)量=樣本蛋白灰度值/同一樣本GAPDH蛋白灰度值)計(jì)算JAM蛋白表達(dá)水平。

4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用One-Way ANOVA方差分析，在方差齊性的情況下，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；在方差不齊性的情況下，采用不等方差假設(shè)項(xiàng)下的Tamhane’s T2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 對UC大鼠一般狀態(tài)的影響 造模前，SD大鼠活動(dòng)性較好，動(dòng)作靈活、反應(yīng)靈敏，皮毛光澤、干凈，食欲佳，自由攝食、飲水，糞便呈顆粒狀、灰褐色，無稀溏便、無膿血，肛門無黏液，呼吸平穩(wěn)均勻，腹部柔軟。造模2 h后，SD大鼠自然蘇醒，各組大鼠均無死亡，但精神欠佳，動(dòng)作緩慢、反應(yīng)遲鈍，呼吸緩慢，出現(xiàn)扭動(dòng)軀體或蜷縮腹部情況，有些大鼠醒后自由飲水、取食，肛門部出現(xiàn)橘紅色的黏液分泌物。

模型組與正常組大鼠比較，自主活動(dòng)性明顯降低，攝食量減少，精神萎靡，有弓背蜷腹現(xiàn)象，皮毛枯槁稀松，大便以黏液、膿血便為主，體重減輕。西藥組治療治療第3天開始，大鼠活動(dòng)度增加，精神開始變好，食量有一定增加。黏液膿血便減少，大便偏稀軟。情況優(yōu)于模型組。人參敗毒散各組治療第2天開始，精神慢慢轉(zhuǎn)佳，食欲逐漸增加，大便由稀溏慢慢轉(zhuǎn)干，膿血便減少。治療第7天，大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)度均有所改善，皮毛色澤由暗轉(zhuǎn)亮，無膿血便，肛周分泌黏液減少或無分泌，肛周逐漸變干燥。其中中劑量組狀態(tài)改善明顯。

2 對UC大鼠體重的影響 治療前，大鼠體重模型組與高劑量組比較有顯著性差異(P<0.05)。治療后，模型組、西藥組和人參敗毒散高中低劑量組與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，人參敗毒散中、低劑量組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。治療前后大鼠體重變化結(jié)果見表1。

表1 人參敗毒散對各組UC大鼠治療前后體重變化的影響

注：造模后因各組大鼠死亡數(shù)量不等，統(tǒng)計(jì)數(shù)量按模型組最低數(shù)量(6只)進(jìn)行。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 對UC大鼠胃殘留率、小腸推進(jìn)率的影響 與正常組比較，模型組、西藥組、人參敗毒散高中低組胃殘留率升高，有顯著性差異(P<0.05)，小腸推進(jìn)率降低，其中模型組、西藥組、人參敗毒散高劑量組有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，西藥組、人參敗毒散高中低組胃殘留率降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，小腸推進(jìn)率升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

4 對UC大鼠腸黏膜組織中JAMmRNA表達(dá)及JAM蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組、西藥組和人參敗毒散各組UC大鼠腸黏膜JAMmRNA表達(dá)顯著性降低(P<0.05)；與模型組比較，西藥組和人參敗毒散各組JAMmRNA表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。與空白組比較，模型組、人參敗毒散高 、中劑量組UC大鼠腸黏膜組織中JAM蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，西藥組、人參敗毒散各組JAM蛋白表達(dá)明顯升高，具有顯著性差異(P<0.05)。

表2 人參敗毒散對UC大鼠胃殘留率、小腸推進(jìn)率的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 人參敗毒散對UC大鼠腸黏膜組織中JAMmRNA表達(dá)及JAM蛋白表達(dá)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖1 人參敗毒散對UC大鼠腸黏膜組織中JAM蛋白表達(dá)的影響

UC是一種主要累及直腸、結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎性反應(yīng)，易反復(fù)發(fā)作、治愈難度大，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為主要與腸黏膜局部免疫系統(tǒng)紊亂、基因因素、環(huán)境因素有關(guān)[8]。因UC多發(fā)生在結(jié)腸黏膜層，以潰瘍糜爛為主[9]，研究表明UC的發(fā)病機(jī)制可能與腸道黏膜屏障功能降低有關(guān)。UC發(fā)病時(shí)黏膜屏障功能異常，腸黏膜通透性升高，腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)向腸黏膜固有層移位，導(dǎo)致腸道促炎因子釋放，進(jìn)一步損傷腸道上皮細(xì)胞，破壞腸黏膜屏障[10]。緊密連接(Tight junction，TJ)對于維持腸黏膜屏障功能有重要作用。腸上皮細(xì)胞緊密連接存在于靠近頂側(cè)(腸腔側(cè))的細(xì)胞側(cè)面，是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的、由多種蛋白質(zhì)及分子組成、具有多種功能的復(fù)合體[11]。連接黏附分子(Junctional adhesion molecule，JAM)是一種整合膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。JAM 家族分子廣泛表達(dá)于淋巴組織和腦內(nèi)皮細(xì)胞以及多種上皮細(xì)胞中，參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、維持血管功能以及調(diào)控細(xì)胞間 TJ 的通透性等[12]。JAM蛋白分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變時(shí)，腸上皮凋亡率上調(diào)2～3倍，腸黏膜通透性增加，細(xì)菌、脂質(zhì)多糖和內(nèi)毒素等大分子物質(zhì)能透過損傷的腸黏膜而進(jìn)入組織而引發(fā)或加重炎癥，誘發(fā)腸黏膜糜爛或潰瘍性病變等[13]。同時(shí)，腸黏膜的炎癥也影響胃腸功能。胃腸動(dòng)力異常與多種消化系統(tǒng)疾病以及其并發(fā)癥密切相關(guān)。胃殘留率和小腸推進(jìn)率是檢測胃腸動(dòng)力正常與否的重要指標(biāo)。觀察中藥對胃排空和腸推進(jìn)的影響也一直作為研究中藥對胃腸動(dòng)力作用的常規(guī)方法[14]。當(dāng)胃腸動(dòng)力降低時(shí)，表現(xiàn)為胃殘留率升高和(或)小腸推進(jìn)率降低，提示胃及小腸的蠕動(dòng)功能和消化功能降低，當(dāng)胃腸功能逐漸恢復(fù)時(shí)，表現(xiàn)為胃殘留率逐漸降低和(或)小腸推進(jìn)率升高[15]。

中醫(yī)雖無UC病名，就其癥狀而言，歸為“痢疾”、“滯下”、“腸澼”等范疇。痢疾之成，多因濕熱疫毒，壅滯腸道，其病勢向內(nèi)向下，郁而成毒，敗腐血絡(luò)而下膿血。脾虛濕滯、正虛邪戀為UC的主要病機(jī)之一。治宜因勢利導(dǎo)，化濕導(dǎo)滯，調(diào)氣和血，此乃治痢之常法[16]。清·俞嘉言首創(chuàng)“逆流挽舟”法為治痢大法，人參敗毒散為其代表方。本法所治之痢，由表邪內(nèi)陷于里，腸道壅滯，氣血失調(diào)而成。而導(dǎo)致腸道壅滯的根本原因在于表邪內(nèi)陷，病勢向內(nèi)向下。故“逆流挽舟”法治痢乃逆其病勢、逆其常法也，猶如水中挽舟楫逆流而上，使內(nèi)陷之邪從表而解[17]。

人參敗毒散出自宋代朱肱的《傷寒類證活人書》，方中羌活、獨(dú)活，辛苦性溫，共為君藥，二藥兼能祛濕除痛；柴胡，引清氣上行，升下陷之少陽，前胡，性陰而降，功專下氣，二者一升一降、推陳致新，調(diào)達(dá)氣機(jī)，則少陽之氣不致下陷；枳殼行氣、寬腸胃，桔梗升浮，宣通氣血，為諸藥舟楫，載藥入胸，二藥宣降肺氣、調(diào)暢氣機(jī)；川芎活血止痛，助清陽而開諸郁，與柴枳桔合用，即“行血?jiǎng)t便膿自愈，調(diào)氣則后重自除”；茯苓健脾滲濕，利氣中之濕，甘草補(bǔ)土和中，調(diào)和諸藥，參、苓、草三者并用，補(bǔ)益脾土，脾土得健，則可升其清陽，脾陽一升，木得土而達(dá)，少陽之氣隨之亦升；生姜、薄荷辛溫發(fā)散，開泄皮毛，外解表寒?？v觀本方，解表與扶正同施，寓養(yǎng)于透，使正氣恢復(fù)，力能舉內(nèi)陷之邪外透?？梢娺\(yùn)用“逆流挽舟”法治療潰瘍性結(jié)腸炎具有獨(dú)特之處，人參敗毒散具有祛風(fēng)勝濕、升陽舉陷、調(diào)氣活血、扶正祛邪之功效，對于改善潰瘍性結(jié)腸炎胃腸功能及腸黏膜屏障的通透性等方面有一定療效。

本研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參敗毒散能改善UC大鼠胃腸功能，具有促進(jìn)胃排空和腸推進(jìn)的作用。結(jié)腸組織中JAMmRNA的表達(dá)和蛋白水平，模型組明顯低于正常組，而人參敗毒散組與模型組比較有不同程度的升高，表明人參敗毒散對UC腸黏膜屏障有一定的改善作用且與腸上皮細(xì)胞緊密連接密切相關(guān)。