益生菌與孤獨(dú)癥譜系障礙的關(guān)系研究進(jìn)展*

孤獨(dú)癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder，ASD)是一種神經(jīng)發(fā)育障礙，童年早期起病，其特征是交流交往障礙、刻板重復(fù)行為以及興趣范圍狹窄，常共病胃腸問(wèn)題、偏食、癲癇、多動(dòng)和睡眠障礙等，是遺傳因素和復(fù)雜環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[1]。近年來(lái)，報(bào)道ASD的患病率逐漸升高，提示環(huán)境因素也對(duì)ASD的病因?qū)W有重要意義。關(guān)于腸道微生態(tài)失調(diào)與ASD的關(guān)系早已引起了學(xué)者們廣泛關(guān)注，并進(jìn)行了大量研究，有人提出伴有胃腸功能障礙的ASD為一特殊亞型，腸道微生態(tài)失調(diào)在其病因?qū)W方面起著重要作用，修復(fù)腸道微生物失調(diào)可能對(duì)治療ASD核心癥狀有效[2，3]。益生菌是有活性的微生物產(chǎn)品，提供合適數(shù)量的益生菌對(duì)人和動(dòng)物有益，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人類研究初步認(rèn)為益生菌對(duì)ASD兒童有效，能改善腸道微生物生態(tài)失調(diào)、修復(fù)胃腸功能，并減輕ASD患者的行為異常[4,5]。為了給ASD患兒提供新的治療思路，廣泛評(píng)價(jià)益生菌對(duì)ASD的療效，現(xiàn)綜述相關(guān)研究。

1 伴有胃腸功能障礙的ASD為一特殊亞型

ASD是一種神經(jīng)發(fā)育性綜合征，病因?qū)W具有較大的異質(zhì)性。Slattery J等[3]提出伴有腸道微生物改變的ASD可能是一特殊亞型，原因是腸道微生態(tài)失調(diào)(Gut Dysbiosis)在其病因?qū)W方面起了重要作用，這一亞型的臨床特征除表現(xiàn)ASD核心癥狀外，還有胃腸功能障礙，如慢性便秘、腹瀉、便秘與腹瀉交替出現(xiàn)、腹脹、腹痛等。Young AM等[4]依據(jù)血清免疫學(xué)方面的研究結(jié)果也提出部分ASD患者由于腸道炎癥原因?qū)е聶C(jī)體出現(xiàn)免疫功能失調(diào)與其發(fā)病有關(guān)，支持上述觀點(diǎn)。一組針對(duì)1513例月齡為20～60個(gè)月之間的兒童的樣本研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASD兒童出現(xiàn)胃腸功能障礙的幾率是正常對(duì)照組的6～8倍之多，且胃腸癥狀與ASD的嚴(yán)重性呈正相關(guān)[6]。Mazurek MO等[7]調(diào)查了2 973例ASD兒童，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24%的患兒經(jīng)歷至少一種類型的胃腸問(wèn)題，并且胃腸問(wèn)題密切聯(lián)系患兒的感覺(jué)反應(yīng)過(guò)度和焦慮癥狀，提示患兒的感覺(jué)反應(yīng)敏感和焦慮多由慢性胃腸問(wèn)題所致。迄今，報(bào)道ASD胃腸問(wèn)題的發(fā)生率差異較大，為9%～91%，平均為47%[8]，原因與研究方法、診斷標(biāo)準(zhǔn)等不同有關(guān)。國(guó)內(nèi)李素水等[9]研究報(bào)道ASD組胃腸功能失調(diào)的發(fā)生率為43.33%，高于精神發(fā)育遲滯組的21.66%和正常對(duì)照組13.33%，結(jié)論支持伴有胃腸功能失調(diào)的孤獨(dú)癥可能為ASD一亞型。進(jìn)一步研究提示該亞型存在食物不耐受現(xiàn)象，多為消化谷蛋白和酪蛋白異常，禁食相關(guān)食物對(duì)ASD核心癥狀有效，尤其是在治療的早期階段[10]。

另一方面研究是探討ASD患兒腸道微生物的成分改變。Wang L等[11]對(duì)54例兒童進(jìn)行了研究，其中ASD患兒23例、ASD的健康同胞22例和正常對(duì)照組9例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，ASD兒童糞便標(biāo)本中薩特菌(Sutterella spp.)數(shù)量增多，并且與不伴有功能性胃腸問(wèn)題的ASD相比，伴有胃腸問(wèn)題的ASD扭鏈瘤胃球菌(Ruminococcus Torques)明顯增多。另一項(xiàng)研究選取ASD患兒33例，正常發(fā)育同胞7例和正常對(duì)照組兒童8例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASD患兒的便標(biāo)本中擬桿菌(Bacteroidetes)數(shù)量較多，正常對(duì)照組兒童中厚壁菌門(Firmicutes)數(shù)量較多，而同胞對(duì)照組的微生物種類和數(shù)量處于二者之間，提示遺傳和環(huán)境因素共同作用決定了ASD患兒的腸道微生物成分[12]。Rose DR等[8]通過(guò)便標(biāo)本對(duì)伴有胃腸癥狀的ASD患兒進(jìn)行了微生物方面的研究，結(jié)果伴有胃腸癥狀A(yù)SD組與伴有胃腸癥狀正常發(fā)育兒童組之間微生物成分有差異，ASD組擬桿菌科、裂果螺科(Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科顯著增多；而無(wú)胃腸癥狀的ASD組和無(wú)胃腸癥狀的正常兒童組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，上述研究提示ASD患兒的腸道微生物成分發(fā)生了改變。也有研究報(bào)道了不一致的結(jié)論，分析可能與研究方法、ASD的異質(zhì)性、高級(jí)抗生素使用和飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)[2]。

分析ASD患兒伴有較多胃腸功能失調(diào)癥狀的原因，可能與微生物-腸-腦軸功能失調(diào)有關(guān)[12]。首先，短鏈脂肪酸(Short-chain Fatty Acids, SCFAs)是微生物的代謝產(chǎn)物，也是微生物-腸-腦軸中的重要介質(zhì)，能穿過(guò)血腦屏障，直接調(diào)節(jié)腦活性。MacFabe DF[13]報(bào)道ASD患兒便標(biāo)本中總SCFAs水平下降，包括乙酸(Acetic Acid,AA)、丙二酸和丙酸(Propionic Acid,PPA)。Foley KA等[14]通過(guò)鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，孕期暴露PPA明顯地?fù)p害后代新生兒和少年期的社交行為，表明母親的腸道微生物成分可能影響后代患ASD風(fēng)險(xiǎn)。成年老鼠腦室內(nèi)和外周給予PPA后產(chǎn)生各種行為缺陷，與ASD患者中觀察到的行為特點(diǎn)很相似。大量的PPA迅速進(jìn)入血液后，穿過(guò)血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)，在腦內(nèi)神經(jīng)元集聚，引起細(xì)胞內(nèi)酸化，然后改變神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)元活性[12]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，給予嚙齒類物種PPA和丁酸(Butyric Acid,BA)也導(dǎo)致基因表達(dá)改變，基因表達(dá)改變影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子、炎癥、氧化應(yīng)激、脂類代謝和線粒體功能，這對(duì)ASD均有重要意義[15，16]。其次，大部分ASD患者均有使用廣譜抗生素的病史?？诜股睾笃茐哪c道內(nèi)的保護(hù)性微生物群，并引起厭氧菌增殖，例如梭菌屬(Clostridia)、擬桿菌和脫硫弧菌(Desulfovibrio)三種厭氧細(xì)菌是引起ASD患兒胃腸癥狀和孤獨(dú)癥行為的常見(jiàn)細(xì)菌[13]。另外，這些細(xì)菌也產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)小腸免疫系統(tǒng)與ASD的病理學(xué)機(jī)制有關(guān)，如梭菌屬破傷風(fēng)梭菌(Tetani)是一種隨處可見(jiàn)的厭氧桿菌，產(chǎn)生一種強(qiáng)效的神經(jīng)毒素即破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(Tetanus Neurotoxin, TeNT)，迷走神經(jīng)具有傳輸TeNT的能力，將其從腸道傳輸?shù)酱竽X，然后TeNT通過(guò)分解突觸生長(zhǎng)蛋白破壞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，導(dǎo)致各種孤獨(dú)癥樣行為缺陷。3-羥基苯基-3羥基丙酸是一種特殊的梭菌類代謝產(chǎn)物，它具有耗竭腦內(nèi)兒茶酚胺效應(yīng)，產(chǎn)生ASD癥狀，支持梭菌屬和ASD病因?qū)W之間具有相關(guān)性[12]。脫硫細(xì)菌是另一種革蘭氏陰性厭氧桿菌，與梭菌不同，不產(chǎn)生孢子，脫硫細(xì)菌導(dǎo)致大量硫代謝異常產(chǎn)生毒性物質(zhì)可能關(guān)系A(chǔ)SD的病理生理學(xué)[12]。細(xì)胞雜志發(fā)表的重要研究成果，ASD鼠模型研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物的異常對(duì)行為產(chǎn)生影響，成年雌性鼠免疫活化出生的后代具有ASD特征、腸道微生態(tài)失調(diào)(梭菌屬和擬桿菌發(fā)生改變)和血清代謝物改變。還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用代謝物4-乙基苯基硫酸鹽(能增加免疫活化)治療幼小鼠(Naive Mice)產(chǎn)生ASD相關(guān)行為異常，提示腸道微生物作用于宿主產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物影響生物行為[17]。因此，ASD鼠模型研究結(jié)果支持微生物-腸-腦之間的相互聯(lián)系。

因此，生命早期腸道微生物-腸-腦軸功能失調(diào)可能是部分ASD的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，該亞型除ASD核心癥狀外，還伴有便秘、腹瀉、腹脹等胃腸功能特征，修復(fù)腸道微生物菌群可能對(duì)治療ASD有重要意義。

2 益生菌可能的理論機(jī)制

Critchfield JW等[18]通過(guò)綜述文獻(xiàn)首次提出益生菌對(duì)ASD有益，并指出相關(guān)機(jī)制和證據(jù)：(1)ASD患者出現(xiàn)胃腸癥狀有腹脹、腸蠕動(dòng)困難和腹痛等，與腸激惹綜合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)很相似，益生菌能成功治療IBS患兒，提示益生菌也可能改善ASD的胃腸癥狀；(2)ASD兒童梭菌屬類升高，高水平梭菌屬患者易出現(xiàn)胃腸問(wèn)題，應(yīng)用靶向梭菌屬藥物治療胃腸癥狀的同時(shí)也改善ASD患兒行為和交往異常，提示益生菌對(duì)ASD相關(guān)行為也有效；(3)ASD患者小腸滲透性增加，益生菌有改善小腸滲透性的作用，其機(jī)制是減少細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)穩(wěn)定黏膜屏障，合成抗氧化物，增加黏蛋白表達(dá)，刺激黏膜免疫力，短期暴露益生菌增強(qiáng)人體上皮緊密連接蛋白；(4)許多結(jié)果支持部分ASD患兒存在異常免疫活化，大部分免疫系統(tǒng)集中在小腸黏膜周圍，腸道微生物對(duì)免疫系統(tǒng)成熟和調(diào)節(jié)起了重要作用，益生菌產(chǎn)生的效應(yīng)可能作用于免疫系統(tǒng)，以物種特異性方式調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。目前，離體研究已發(fā)現(xiàn)益生菌株具有抗炎效果，但是與細(xì)胞因子以及其他腸道微生物之間的相互作用還有待進(jìn)一步證實(shí)。

Hsiao EY等[17]通過(guò)母系免疫活化(Maternal Immune Activation,MIA)鼠模型對(duì)益生菌作用機(jī)制進(jìn)行了開創(chuàng)性研究。MIA母親出生的后代鼠病理學(xué)表現(xiàn)為腸道滲透性增加、小腸細(xì)胞因子水平異常以及由梭菌屬和擬桿菌屬導(dǎo)致的菌群失調(diào)，后代鼠表現(xiàn)為ASD樣行為和相關(guān)神經(jīng)病理學(xué)特征，這與伴有胃腸功能障礙的ASD患兒亞型很相似。應(yīng)用脆弱擬桿菌(Bacteroides Fragilis)益生菌治療能矯正MIA后代鼠的小腸滲透性增加，而且使結(jié)腸部位的促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)水平增加復(fù)原，但其他細(xì)胞因子無(wú)變化，提示IL-6對(duì)ASD樣行為具有特異性。再者，與對(duì)照組的后代鼠相比，MIA后代鼠在67個(gè)菌種中6個(gè)豐富菌種有顯著性差異，而且益生菌能恢復(fù)這種差異，提示脆弱擬桿益生菌能減輕MIA模型后代鼠的腸道菌群失調(diào)，并改善后代鼠的異常交往、重復(fù)、感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和焦慮樣行為，但對(duì)社會(huì)交往和社會(huì)性缺陷無(wú)效，該作者認(rèn)為社會(huì)性行為可能受其他路徑調(diào)節(jié)。另外，還發(fā)現(xiàn)多形擬桿菌(Bacteroides Thetaiotaomicron)益生菌也有脆弱擬桿菌相似的效應(yīng)，但糞腸球菌益生菌無(wú)相應(yīng)治療作用。因此，研究表明益生菌可能減輕炎癥、改善腸道滲透性和恢復(fù)微生物平衡，減輕ASD非社會(huì)性缺陷癥狀，值得廣泛應(yīng)用，并進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制。

3 益生菌和神經(jīng)發(fā)育之間的潛在關(guān)系

依據(jù)ASD腸道微生物和炎癥的理論假說(shuō)，做如下推斷：(1)Hsiao EY等[17]發(fā)現(xiàn)益生菌脆弱擬桿菌改善結(jié)腸部位促炎性細(xì)胞因子IL-6水平。全身性炎癥影響大腦的機(jī)制之一是外周腫瘤壞死因子-α調(diào)節(jié)腦部小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)答。因此，如果ASD兒童的母親在胎兒發(fā)育關(guān)鍵階段經(jīng)歷了感染，全身性炎癥就有可能影響到胎兒神經(jīng)元發(fā)育，此時(shí)若給予影響促炎性細(xì)胞因子的脆弱擬桿菌等益生菌，就可能預(yù)防腦部炎癥。如果MIA模型是部分ASD的病理學(xué)機(jī)制就能預(yù)防ASD樣癥狀出現(xiàn)。相似研究中，Young AM等[4]提示母親MIA能導(dǎo)致胎盤和羊水促炎性細(xì)胞因子水平增加，抗炎細(xì)胞因子水平下降，如果在母親感染期間阻斷促炎性細(xì)胞因子，那么也能預(yù)防后代ASD樣行為。因此，建議在孕期或新生兒早期使用矯正異常免疫應(yīng)答的特殊益生菌來(lái)預(yù)防ASD風(fēng)險(xiǎn)。近來(lái)動(dòng)物老鼠[19]研究結(jié)果支持益生菌具有糾正代謝紊亂，減少多器官炎癥的效應(yīng)。(2)腸道微生物對(duì)神經(jīng)發(fā)育有重要作用，包括從神經(jīng)發(fā)生到髓鞘形成，從突觸剪修到神經(jīng)遞質(zhì)，以及受體產(chǎn)生。如果與Hsiao EY等[17]研究結(jié)果相一致，那么益生菌就能恢復(fù)ASD個(gè)體在母孕期間由于遺傳原因和各種未知原因所導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，然后預(yù)防腸道微生物改變所致的神經(jīng)發(fā)育有害效應(yīng)。(3)Hsiao EY等[17]發(fā)現(xiàn)MIA導(dǎo)致腸道某些相關(guān)緊密連接蛋白的表達(dá)改變，應(yīng)用脆弱擬桿菌益生菌治療能改善這種變化。由于Fiorentino M等[20]研究發(fā)現(xiàn)ASD個(gè)體有兩方面基因表達(dá)改變，即與BBB功能和完整性相關(guān)的基因表達(dá)改變，以及腸道緊密連接蛋白表達(dá)改變，導(dǎo)致屏障的毛孔形成增加，屏障功能下降，結(jié)果支持腸道微生物在BBB形成和維護(hù)方面起了重要作用，推測(cè)益生菌有可能對(duì)BBB的緊密連接蛋白也有相似效應(yīng)。因此，如果益生菌能增加BBB緊密蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)BBB的致密性，將使導(dǎo)致ASD易感基因的環(huán)境毒物控制于腦外，抑制相關(guān)易感基因的產(chǎn)生就能成功預(yù)防ASD神經(jīng)元的發(fā)生。

P?rtty A等[21]研究結(jié)論支持上述推論，將出生6個(gè)月的嬰兒隨機(jī)分為益生菌組和安慰劑組，結(jié)果益生菌組無(wú)一例發(fā)生ASD或注意缺陷多動(dòng)障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)，而安慰劑組有17%被診斷，結(jié)論支持新生兒早期應(yīng)用益生菌能減少ASD風(fēng)險(xiǎn)。Shaaban SY等[22]應(yīng)用三聯(lián)益生菌(嗜乳酸桿菌、鼠李糖乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌)對(duì)埃及30例5～9歲伴有胃腸癥狀的ASD患兒進(jìn)行了為期3個(gè)月的開放性前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)益生菌能減少胃腸癥狀，并減輕ASD癥狀的嚴(yán)重性，該作者認(rèn)為益生菌應(yīng)作為ASD兒童重要的輔助治療方法，值得廣泛應(yīng)用。由于益生菌不是單一微生物成分，兒童腸道微生物成分也是有差異的，通過(guò)觀察有無(wú)神經(jīng)精神障礙的兒童發(fā)現(xiàn)，益生菌產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)不是改變腸道微生物組成成分，而是通過(guò)增加益生菌數(shù)量，減少炎癥、強(qiáng)化屏障、矯正腸道微生物活性不平衡、糾正過(guò)多的有害代謝產(chǎn)物所致。

關(guān)于益生菌是否影響相關(guān)基因表達(dá)還無(wú)肯定結(jié)論。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出初步結(jié)論，牛實(shí)驗(yàn)研究系統(tǒng)性地給予益生菌后發(fā)現(xiàn)，影響整體基因表達(dá)包括機(jī)體免疫力和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)基因[23]。小雞研究發(fā)現(xiàn)益生菌導(dǎo)致小腸黏蛋白基因高表達(dá)[2]。把人體細(xì)菌移植給鼠，益生菌能改變腸道微生物編碼酶的表達(dá)，該酶與碳水化合物代謝路徑有關(guān)，提示未來(lái)研究方向應(yīng)集中于益生菌在基因表達(dá)方面的影響[2]。目前，人類證據(jù)僅提示益生菌提高小腸基因表達(dá)效應(yīng)，加強(qiáng)腸道屏障的完整性，應(yīng)進(jìn)一步研究益生菌能否影響腦基因表達(dá)，繼而影響ASD的神經(jīng)病理學(xué)。

4 糞便微生物移植益生菌在ASD患者中的應(yīng)用

鑒于ASD腸道微生物異常和胃腸癥狀之間的關(guān)系，以及糞便微生物群移植(Fecal Microbiota Transplantation,FMT)治療艱難梭菌屬感染的有效性，因此將健康個(gè)體的糞便微生物移植到腸道菌群失調(diào)的機(jī)體中，已建議用于ASD患兒[24]。通過(guò)改良FMT程序-微生物群移植療法，包括起初的抗生素治療、腸清潔和延長(zhǎng)糞便微生物移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18例ASD患兒中有80%的患兒胃腸癥狀減少，并明顯改善ASD癥狀[25]。不過(guò)，也有報(bào)道ASD兒童若腸道內(nèi)脫硫弧菌大量增加者，給予該方法將惡化ASD癥狀，也可能加重胃腸癥狀，提示實(shí)施FMT是有條件的，否則將對(duì)患兒有害。進(jìn)一步說(shuō)，F(xiàn)MT也存在不良反應(yīng)，有一項(xiàng)研究報(bào)道供體糞便侵入后，94%患兒有腹瀉，31%出現(xiàn)痙攣，19%打嗝，19%便秘，降低了FMT對(duì)ASD個(gè)體的使用[26]。Navarro F等[5]提出FMT對(duì)ASD患兒胃腸癥狀無(wú)效。因此，目前對(duì)FMT的最新評(píng)價(jià)是僅限于研究，不支持臨床應(yīng)用。

5 小結(jié)

在未來(lái)的研究中，首先應(yīng)依據(jù)動(dòng)物模型進(jìn)一步探討益生菌的生物學(xué)機(jī)制；其次，盡管已知益生菌有特異性菌株效應(yīng)，但是應(yīng)依據(jù)分子微生物學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)技術(shù)探討不同種類益生菌作用于宿主能改變行為的確切機(jī)制，即不同菌株益生菌改善行為的相關(guān)神經(jīng)路徑。另外，應(yīng)進(jìn)一步多中心開展益生菌的研究，探討對(duì)伴有胃腸癥狀A(yù)SD亞型的臨床療效。

目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人類研究初步認(rèn)為益生菌治療ASD患兒有效，尤其是伴有胃腸功能障礙的患者，既能改善胃腸癥狀，又能減少ASD相關(guān)行為異常。孕期應(yīng)用益生菌還可能降低后代患ASD的風(fēng)險(xiǎn)。益生菌的作用機(jī)制是通過(guò)增加腸道益生菌的數(shù)量，減少炎癥、強(qiáng)化屏障、矯正腸道微生物活性不平衡、糾正過(guò)多的有害代謝產(chǎn)物。未來(lái)研究方向應(yīng)進(jìn)一步完善ASD的臨床分型、確定胃腸功能障礙的統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)以及益生菌改善行為的相關(guān)神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，即微生物群-腸-腦軸之間相互聯(lián)系的病理生理學(xué)機(jī)制。