殼聚糖-介孔二氧化硅復(fù)合材料的制備與止血性能研究

夏德萌 羅廷澤 汪 洋 張洪躍 吳江紅 許碩貴 周潘宇

出血是創(chuàng)傷患者的主要臨床表現(xiàn)之一，而難以控制的出血是平時和戰(zhàn)時院前創(chuàng)傷死亡的主要原因[1]。美軍根據(jù)歷年戰(zhàn)術(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)戰(zhàn)場上因出血而死亡的傷員約占91.0%，因此將出血列為戰(zhàn)場三大可預(yù)防性死因之一[2,3]。平時各類意外事故、突發(fā)災(zāi)難中，出血過多同樣是導(dǎo)致現(xiàn)代社會中人員死亡的主要原因之一[4]。為降低因出血而造成的致死率，各國醫(yī)學(xué)界對止血材料的止血性能要求日益提高。

殼聚糖(chitosan)作為一種具有很大發(fā)展?jié)摿Φ尼t(yī)用止血愈傷材料，是唯一自然存在的堿性多糖，是幾丁質(zhì)(甲殼素)經(jīng)脫乙酰作用的產(chǎn)物[5]。其具有良好的生物相容性和可降解性，可以促進凝血和血栓的形成，同時還具有抑制多種細菌生長和促進創(chuàng)傷組織修復(fù)等優(yōu)點[6,7]。由于該材料易于加工成型，適合作為敷料使用，Rall等[8]以殼聚糖為原料的止血敷料已通過美國FDA認證，并在伊拉克戰(zhàn)場上配備美軍。但是，由于殼聚糖溶于酸性環(huán)境中而難溶于水，純殼聚糖膜敷料存在吸水和抗水性能差的缺點，在pH值中性環(huán)境下，血液中80%以上都是水分，因此各種對殼聚糖親水性的改變是提高止血效果的關(guān)鍵，也是新一代止血材料的研究熱點[9]。

介孔二氧化硅(mesoporous silica nanoparticle, MSN)，是一種具有介孔和熱穩(wěn)定性的新型材料，其孔徑為5～22nm，同時具有較大孔容、高比表面積、孔徑可調(diào)范圍較廣且球形孔道之間通過窗口聯(lián)結(jié),因此具有優(yōu)良的傳質(zhì)性能[10]。本研究探索以MSN為內(nèi)核，殼聚糖為外殼，通過相轉(zhuǎn)移和分子印跡原理，制備具有吸水性MSN內(nèi)核和大孔殼聚糖外殼的復(fù)合止血劑，并對復(fù)合材料的微觀表征、生物相容性和止血性能進行了進一步的研究。

材料與方法

1.材料:殼聚糖(脫乙酰度90.5%，相對分子質(zhì)量400kDa，上海卡博工貿(mào)有限公司)，鹽酸、1,3,5-三甲苯(TMB)、正硅酸乙酯(TEOS)、氟化銨(NH4F)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，冰乙酸(上海天蓮精細化工有限公司)，3-縮水甘油醚三甲氧基硅烷(GPTMS)、Pluronic P-123 (德國Sigma公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)。

2.儀器:D/max2550VB/PC型轉(zhuǎn)靶X射線多晶衍射儀(日本 Rigaku 公司)，F(xiàn)reezone 6型冷凍干燥機(美國Labconco公司)。

3.制備方法:(1)介孔二氧化硅(MSN)的制備:取質(zhì)量分數(shù)為37%的濃鹽酸10ml與超純水65ml加入反應(yīng)容器40℃ 水浴，混合均勻后緩慢加入4g Pluronic (P123)并劇烈攪拌,持續(xù)時間約1h，至其完全溶解，溶液呈澄清狀態(tài)。加入4g 1,3,5-三甲苯(TMB)，在40℃水中浴攪拌約2h，逐滴加入9.2ml正硅酸乙酯(TEOS)并強烈攪拌，待全部加完后再繼續(xù)攪拌5min，將攪拌后的體系在40℃ 水浴中陳化20h，加入46mg氟化銨(NH4F)，輕微攪拌至其溶解，除去離心瓶中的上層清液，將剩余產(chǎn)物放入高壓反應(yīng)釜，在100℃ 恒溫箱中保持恒溫24h。待水熱反應(yīng)完畢后，對反應(yīng)產(chǎn)物進行離心(8000r/min，10min)，再經(jīng)水洗、醇洗各兩遍，在60℃ 恒溫箱烘干，最后用馬沸爐900℃ 煅燒烘干后的產(chǎn)物6h，得到白色粉末介孔二氧化硅(MSN)。(2)殼聚糖-介孔二氧化硅復(fù)合材料的制備:首先配置質(zhì)量分數(shù)為2% 的冰醋酸水溶液，再配置質(zhì)量分數(shù)為0.5% 的殼聚糖-醋酸溶液，將殼聚糖-醋酸溶液20ml與3-縮水甘油醚三甲氧基硅烷(GPTMS)0.5ml在塑料瓶中進行混合并攪拌2h后置于冰箱中過夜，得到chitosan-GPTMS，將上述制備的MSN取0.1g加入過夜的液體中，室溫攪6～8h，離心(8000r/min，10min)，再使用超純水沖洗2遍，最后置于凍干機中凍干，得到制備后殼聚糖-介孔二氧化硅復(fù)合材料(chitosan-MSN)。

4.材料表征測定:(1)氮氣吸附-脫附曲線表征測定:采用全自動物理吸附儀測定MSN的比表面積，設(shè)定液氮溫度 77.4K(-273.15℃=0K)。使用Brunauer-Emmett-Teller(BET)法計算材料的比表面積，Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法計算材料的孔容和孔徑。為去除物理吸附的水分，樣品在 573K、(0.2～1.0)kPa條件下活化處理4h，并通過靜態(tài)法測量吸附-脫附等溫曲線。(2)粒徑表征:使用動態(tài)光散射(DLS，Malven Autosizer 4700)測定納米粒子在去離子水中的流體力學(xué)直徑以及評價其在水中的穩(wěn)定性。散射角度為900，激光光源功率為150W，激光波長為532nm。配制濃度大約為0.1mg/ml的納米粒子分散液，放置于PS樣品池中，溫度控制在25℃，穩(wěn)定5min后進行測量。設(shè)定分散劑水的折射率為1.332，黏度為0.89Pa·S。采用ZETA Size 3000HS型Zeta電位測試儀(Malvern Instruments Ltd., UK)對材料的表面電荷進行測定。

5.細胞毒性評價：采用MTT方法評價材料的細胞毒性。細胞株采用小鼠成肌細胞(C2C12，ATCC)，細胞培養(yǎng)在含有10% FBS(fetal bovine serum，GIBCO)，1%雙抗(100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素， GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中。首先消化細胞收集對數(shù)期的細胞，用培養(yǎng)基重懸并進行計數(shù)，使細胞懸液的濃度約5×104個/毫升，將細胞接種于96孔板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天。將3種材料(MSN、chitosan、chitosan-MSN)加入培養(yǎng)基，配成1mg/ml濃度，浸泡1天。分別取100μl培養(yǎng)基浸提液，加入接種細胞的96孔板中，每孔100μl，替換原來的上清培養(yǎng)基，每個樣品3個復(fù)孔，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 1、4和7天。每孔加入 10μl的MTT 溶液 (5mg/ml)，置入培養(yǎng)箱中 37℃ 下繼續(xù)培養(yǎng)4h；吸棄培養(yǎng)基浸提液并加入 DSMO (150微升/孔)，在室溫下震蕩10min；采用酶標儀以 570nm 波長測定吸光度(A值)。細胞毒性評價根據(jù)下式計算相對增殖率(relative growth rate, RGR)。RGR(%)=A(實驗組)-A(空白組)/A(陰性對照組)-A(空白組) ×100%。

6.吸水性能評價:采用比重法測試材料吸水性能。使用模擬體液(SBF)液體進行測試，首先通過電子分析天平準確稱取試劑配制成 1L溶液并調(diào)節(jié) pH值至7.25，置于37℃ 下備用。實驗前，樣品均經(jīng)過120℃ 真空干燥過夜，以充分去除材料的吸收水分。計算吸水率，采用標準醫(yī)用紗布作為對照。方法如下：稱量樣品重量標記為Wwet，將其置于放有濾紙的漏斗中，逐滴緩慢加入SBF溶液，置于第1滴液體從漏斗中滴出。再次稱量樣品標記為Wdry。采用公式：[(Wwet-Wdry)/Wdry]×100%計算出樣品的吸水率，其中Wdry表示干燥樣品質(zhì)量,Wwet表示吸附SBF 溶液之后的樣品質(zhì)量，每組樣品測3次。

7.體外凝血實驗:通過凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)的測定評價材料的體外凝血性能。取健康成年新西蘭大白兔血液，首先用3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑進行抗凝處理，然后高速離心(2500×g, 37℃)，離心15min，得到貧血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)。PT測試步驟如下：50μl PPP和100μl PT試劑分別在37℃下恒溫5min，然后一同加入PT 測試管中，加入待測樣品。APTT測試步驟如下：先將50μl APTT 試劑加入到50μl PPP中，并在37℃下恒溫 5min，然后加入50μl濃度為0.025mol/L的CaCl2溶液以及待測樣品，并放入APTT 測試管中，分別通過法國生物梅里埃公司血凝分析儀(HF6000，Biomerieux，F(xiàn)rance)測試PT和APTT，進行測試每個樣品重復(fù)3次。

7.動物實驗驗證:通過建立肝創(chuàng)傷出血模型來評價樣品的體外止血性能。取健康成年新西蘭大白兔18只，隨機分成3組，即對照組(不使用任何止血劑)、chitosan組(使用chitosan止血劑)、chitosan-MSN組(使用chitosan-MSN止血劑)，每組6只。采用靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，制造肝創(chuàng)傷模型，大致方法如下：術(shù)區(qū)備皮后，消毒鋪單，逐層開腹，直至暴露肝臟組織，在肝臟左葉用手術(shù)刀做2cm×2cm“十”字型切口，深約0.5cm，形成臟器滲血創(chuàng)面。任其自由出血10s后，用醫(yī)用紗布吸干血液，迅速平鋪止血材料，通過秒表記錄止血時間。

結(jié) 果

1.氮氣吸附-脫附表征測定:介孔二氧化硅具有較大的比表面積、孔容量以及均勻的孔道分布等特性，為進一步驗證，將制備的樣品進行N2吸附-脫附實驗。使用Brunauer-Emmett-Teller(BET)法計算材料的比表面積，Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法計算材料的孔容和孔徑，測定MSN的比表面積為524m2/g，孔容為1.2m3/g，孔徑為3.5nm。

2.粒徑和電荷測定:表1為MSN、Chi-MSN的Zeta電位值。從表中可以看出，MSN材料粒子粒徑為153nm，Zeta電位為負值-18.5mV。而MSN粒子與殼聚糖復(fù)合改性后，粒徑為221nm，Zeta電位值變?yōu)檎?.43mV。

表1 MSN和chitosan-MSN的粒徑和電荷

3.細胞毒性評價結(jié)果:MTT法通過檢測材料的浸提液對細胞的毒性，可以敏感地從體外評價材料的毒性。本實驗中，對比了MSN、chitosan、chitosan-MSN 3種材料的毒性，通過觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠成肌細胞1天內(nèi)就開始貼壁，生長狀態(tài)良好，4天后細胞密度增大并持續(xù)到7天，材料在培養(yǎng)液中沉于孔板底面，其附近或邊緣均長滿小鼠成肌細胞。chitosan組、MSN組、chitosan-MSN組的細胞存活率均>90%(圖1)。

圖1 chitosan、MSN、chitosan-MSN 3種材料的細胞存活率

4.吸水性能評價結(jié)果：對3種材料吸水率的測定，chitosan的吸水率只有118%，而MSN孔徑大，吸水性強，到達295%。而MSN改進后的chitosan吸水率達到281%(圖2)。

圖2 chitosan、MSN、chitosan-MSN 3種材料吸水率

5.APTT和PT測定結(jié)果：3種材料的PT均沒有顯著影響(圖3)，但3種材料的APTT都有所下降。同時通過對3種材料間的對比，MSN和chitosan都有止血作用，與空白對照組比較，分別下降了18%和27%，而通過MSN修飾后的復(fù)合材料，止血效果有了顯著的提高，APTT下降了56%，進一步證明了復(fù)合的chitosan-MSN有著更好的止血效果。

圖3 chitosan、MSN、chitosan-MSN 3種材料活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)相對于空白對照組的比率

6.肝創(chuàng)傷出血模型止血性能評價：本實驗采用兔

的肝臟創(chuàng)傷出血模型，制造相對恒定的出血創(chuàng)面。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用chitosan、chitosan-MSN兩種止血劑，和不加任何止血劑，只用紗布止血進行對比，測量動物的出血量和出血時間。由圖4可見，chitosan-MSN材料覆蓋于出血的“十”字型創(chuàng)口上，并成功止血，同時也能很好地黏附于組織，不易脫落，有助于止血。在對止血時間的記錄上，相較于紗布止血的對照組，chitosan和chitosan-MSN都顯示出較好的止血效果，止血時間明顯縮短(圖5)。但chitosan-MSN組的止血時間比chitosan組更短。

圖4 chitosan-MSN復(fù)合材料在肝創(chuàng)傷模型中的止血過程圖

圖5 3組止血時間

討 論

殼聚糖(chitosan)作為一種具有多種功能的生物材料，具有較好的凝血特性，同時有著無毒、無抗原性等優(yōu)點，以止血迅速而運用于軍事行動和外科手術(shù)止血中。但其親水和吸水性能較差，對人體有一定的微刺激性，同時單純的殼聚糖止血效果有限，難以適用于實質(zhì)臟器的大面積創(chuàng)傷的廣泛出血[12]。近年來，介于微孔和大孔材料之間的介孔材料的發(fā)展，給解決這些問題提供新的思路。其有著孔容較大、比表面積較高、孔道結(jié)構(gòu)有序且可調(diào)的特點，同時可在其孔道或表面進行物理吸附或化學(xué)修飾，固定功能分子等優(yōu)勢[13]。本身同樣有著止血作用的介孔二氧化硅可以對殼聚糖的止血性能進行進一步的改進和完善，本實驗預(yù)先制備出介孔二氧化硅(MSN)，再通過相轉(zhuǎn)移和分子印跡原理，用MSN對殼聚糖進行改性和修飾，以期提高止血性能。

止血是指停止受損血管出血的過程，并且是在幾個連續(xù)階段中進行的，包括血管的收縮，凝血級聯(lián)反應(yīng)的激活和血凝塊的形成。因此，加速上述任何階段的止血劑都可以有助于實現(xiàn)理想的止血[14]。殼聚糖通過自身所具有的聚陽離子特性，誘導(dǎo)紅細胞的黏附和聚集，同時促進血小板的活化和凝集，以及激活補體系統(tǒng)，最終形成血凝塊，起到止血的作用[15]。在此基礎(chǔ)上，筆者將介孔二氧化硅引入，作為一種納米級的二氧化硅，已有研究表明，納米級的二氧化硅能與血液中的凝血因子FⅫ直接作用，激活FⅫ，且二氧化硅的粒徑越小，激活作用越強[16]。FⅫ作為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的啟動因子，其活化的加速有助于凝血級聯(lián)反應(yīng)的加速，促進止血，本研究中APTT時間在MSN組的減少也進一步證明這一機制。同時MSN可以利用其較大孔容、高比表面積、三維孔隙系統(tǒng)等優(yōu)勢，吸收血液和組織中的水分，從而起到凝血因子和血小板濃縮的作用[17]。有助于殼聚糖更好地促進血小板的活化與聚集，克服其不適用于實質(zhì)臟器創(chuàng)傷廣泛出血的缺陷。本研究中，chitosan-MSN復(fù)合材料，在肝臟創(chuàng)傷出血模型中的作用也證明了改材料的止血性能。同時有研究認為，止血材料快速凝血作用導(dǎo)致血液在材料表面迅速凝結(jié)并堵塞材料的多孔結(jié)構(gòu)，從而阻礙材料的進一步吸收液體的作用，這也是導(dǎo)致止血材料不能充分發(fā)揮作用的關(guān)鍵，本研究探索MSN為內(nèi)核，殼聚糖為外殼，制備具有吸水性MSN內(nèi)核和大孔殼聚糖外殼的材料，克服了這一弊端，有助于提高止血性能[18]。

理想的止血材料不僅要有很好的止血性能，而且要兼具好的生物相容性和安全性。本研究中，通過MTT法對材料的細胞毒性進行了評價，根據(jù)結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn)chitosan-MSN組處理細胞1、4和7天后的細胞存活率均要高于90%，沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，進一步驗證了該復(fù)合材料良好的生物相容性。因為復(fù)合材料有通過吸附血液中的水份來起到止血作用這一機制，因此安全性同樣不可忽略。沸石止血劑(quickclot)，這樣一種通過FDA認證并被投入使用的止血劑，已經(jīng)被證明在控制創(chuàng)傷性大出血有著出色的效果[19]。其具有較大的比表面積，可以從血液中選擇性快速吸附大量水以促進凝血因子和血小板的濃縮與凝結(jié)，但在吸附水的同時，釋放大量的熱，易造成使傷員感到疼痛和創(chuàng)面的灼傷，現(xiàn)已不推薦在戰(zhàn)場使用[20]。本研究中采用的MSN材料，已被證明有著良好的水熱穩(wěn)定性，不會造成創(chuàng)面的灼傷，是一種安全的止血材料。

綜上所述，殼聚糖-介孔二氧化硅復(fù)合材料有著良好的止血性能、生物相容性和安全性，有著一定的應(yīng)用前景，但其涉及的凝血機制可能是多個材料參與的多條凝血途徑，有待于進一步探索研究。