張馨元,管桂坤,萬自然,劉明坤,陳 雙,徐 巖
(1.山東蘭陵美酒股份有限公司,山東臨沂277731; 2.江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室,江蘇無錫214122)
蘭陵美酒是我國(guó)歷史傳統(tǒng)名酒之一,釀制歷史可追溯到殷商時(shí)代,距今有3000多年的歷史。蘭陵美酒取優(yōu)質(zhì)黍米為原料,以純凈甘洌的古老深井水制糊,放麥曲糖化發(fā)酵后,入瓷缸密封,陳釀半年啟缸[1]。其酒體呈琥珀光澤,晶瑩明澈,保有原料和發(fā)酵產(chǎn)生的天然混合香氣,濃郁襲人。獨(dú)特的釀酒原料及釀造工藝不僅賦予怡人的風(fēng)味,還使蘭陵美酒具有較高的保健價(jià)值。明代醫(yī)學(xué)泰斗李時(shí)珍飲蘭陵美酒后,從醫(yī)學(xué)的角度給予高度評(píng)價(jià),在他的名著《本草綱目》中記載:“蘭陵美酒,清香遠(yuǎn)達(dá),色復(fù)金黃,飲之至醉,不頭痛,不口干,不作瀉,皆水土之美也,常飲入藥俱良”[2]。但目前關(guān)于蘭陵美酒的功能性組分還缺乏深入科學(xué)的解析。
隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng),對(duì)酒的保健功能的研究越來越受到重視,葡萄酒中最重要的健康成分是功能性酚類化合物,其中主要包括黃酮類化合物和白藜蘆醇。有研究報(bào)道,飲食中的黃酮類化合物與缺血性心臟病(ischemic heart disease,IHD)死亡率呈負(fù)相關(guān)。紅葡萄酒中的類黃酮能夠抑制低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)的氧化,防止內(nèi)皮功能障礙,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。黃酮類化合物不僅為葡萄酒帶來了獨(dú)特的味道和顏色,同時(shí)也是葡萄酒中重要的健康成分[3]。而白藜蘆醇也是葡萄酒中的一種生物活性物質(zhì),因其卓越的保健功效廣受關(guān)注[4],其在心血管疾病和癌癥等慢性疾病的治療效果早已有研究報(bào)道[5],大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也已證明其對(duì)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗塞和心力衰竭有積極影響[6]。雖然多酚僅占葡萄酒總量的一小部分,但對(duì)心臟病的研究具有潛在的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)價(jià)值[7]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn),黃酒中也存在一定含量的酚類化合物,對(duì)黃酒保健功能具有積極貢獻(xiàn)[8],但目前還缺乏對(duì)蘭陵美酒中功能性酚類化合物的系統(tǒng)解析。
葡萄酒主要生產(chǎn)國(guó)十分重視葡萄酒保健功能的研究,日本也十分重視清酒保健功能的研究。今安聰?shù)葟那寰坪途圃阒邪l(fā)現(xiàn)9種ACE活性抑制肽(酒中3種,酒糟中6種),ACE活性抑制肽有助于降低血壓;他們還發(fā)現(xiàn)了3種抑制脯氨酰內(nèi)肽酶的肽,這種肽有助于治療健忘、抑郁、老年性癡呆等疾病[9]。此外愛媛大學(xué)醫(yī)學(xué)部的奧田教授從清酒的酒糟提取液和生酒里發(fā)現(xiàn)了具有防治糖尿病的胰島素類活性物質(zhì)[9]。黃酒與清酒類似,從理論上講,黃酒尤其是紹興黃酒的保健功能應(yīng)優(yōu)于清酒,但對(duì)黃酒的研究還沒有引起足夠的重視。
然而目前關(guān)于黃酒功能性組分的研究還不夠深入,戴軍等[10]在古越龍山紹興黃酒中發(fā)現(xiàn)了4條活性很強(qiáng)的降血壓活性肽和一條降膽固醇的活性肽,說明黃酒中的生物活性肽及氨基酸還有待挖掘。此外糯米黃酒中已檢測(cè)到種類豐富的麥芽糖、潘糖、異麥芽糖、異麥芽糖三糖等功能性低聚糖[11],但黍米黃酒中功能性低聚糖還很少有研究報(bào)道。因此黃酒中的功能性組分還需進(jìn)行深入的研究。
本研究以蘭陵美酒為研究對(duì)象,通過多角度解析蘭陵美酒中獨(dú)特的功能性組分種類及含量特征,試圖揭示蘭陵美酒保健價(jià)值內(nèi)在的科學(xué)基礎(chǔ)。
酒樣:由山東蘭陵美酒股份有限公司提供典型蘭陵美酒樣品,分別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)。
試劑:三氯乙酸、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;乙酸乙酯、冰乙酸,分析純;甲醇(色譜純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為超純水;苯酚(分析純),西隴化工有限公司;硫酸(優(yōu)級(jí)純?cè)噭?,永華化學(xué)科技有限公司;硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、檸檬酸、小蘇打、乳酸、氧化鈣均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇(分析純),J&K SCIENTIFIC LTD;食用酒精購買于臨安卡爾生物科技有限公司;異麥芽糖、異麥芽三糖,SUPELCO公司;潘糖,F(xiàn)luca公司;乙腈(色譜級(jí)),F(xiàn)ISHER公司。
儀器:Waters 600高效液相色譜儀、Breeze色譜工作站,蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司;R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,BUCHI公司;1100型高效液相色譜儀、G1362A示差折光檢測(cè)器,Agilent公司;AR224CN電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司;ENVI-18固相萃取柱,上海楚定分析儀器有限公司。
1.2.1 氨基酸及總多肽組分的測(cè)定
用10 g/100 mL三氯乙酸等體積稀釋,記錄稀釋倍數(shù),放置1 h(難溶品,可超聲),保證溶液體系中TCA終濃度為5%。用雙層濾紙過濾后取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管內(nèi),15000 r/min離心30 min。取400 μL上清液用0.22 μm水膜再次過濾后置于液相樣品瓶用于檢測(cè)分析。
準(zhǔn)確吸取0.200 mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,用pH2.2的緩沖液稀釋到5 mL,此標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液濃度為5.00 nmol/50 μL,作為上機(jī)測(cè)定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn),用氨基酸自耦分析儀,以外標(biāo)法測(cè)定樣品的氨基酸含量。
按如下算式計(jì)算游離氨基酸含量:
式中:C為游離氨基酸的含量(g/kg);n為游離氨基酸的檢測(cè)含量(nmol);M為游離氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量(g/mol);d為稀釋倍數(shù);V為添加蒸餾水的體積(mL);m為樣品的質(zhì)量(g)[12]。
1.2.2 功能性多糖的測(cè)定
本研究參照謝廣發(fā)等研究黃酒中功能性低聚糖的方法,取3 mL蘭陵美酒樣品于10 mL容量瓶中,加入2 mL無水乙醇,加純凈水定容搖勻,用ENVI-18固相萃取柱處理后進(jìn)樣,采用HPLC法(高效液相色譜法)對(duì)蘭陵美酒中的異麥芽糖進(jìn)行測(cè)定[13]。
1.2.3 功能性酚類化合物的測(cè)定
1.2.3.1 樣品處理
取100 mL蘭陵美酒,用體積分?jǐn)?shù)為37%的H3PO4調(diào)節(jié)pH值至2,加NaCl 20 g,100 mL乙酸乙酯萃取3次,有機(jī)相40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干,4 mL V(甲醇)∶V(水)=50∶50溶解,0.45 μm微孔濾膜過濾。低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3.2 色譜條件
Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm i.d.250 mm,5 μm)色譜柱(安捷倫科技有限公司),流動(dòng)相為A相:甲醇+冰乙酸(0.1%),B相:水+冰乙酸(0.1%),進(jìn)行梯度洗脫,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm和254 nm(原兒茶酸和香草酸在254 nm處檢測(cè),其余在280 nm處檢測(cè));柱溫20 ℃;流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。
1.2.3.3 外標(biāo)工作曲線和線性范圍的確定
準(zhǔn)確稱取0.0001 g沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、p-香豆酸和槲皮素溶于V(甲醇)∶V(水)=50∶50溶液中,分別定容于10 mL容量瓶中。稀釋成不同濃度梯度,進(jìn)樣量10 μL,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性范圍、回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差[14]。
1.2.4 抗氧化性的測(cè)定
本研究參照李媛媛等[15]在運(yùn)用微型DPPH、ABTS和FRAP法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)從紅酒中分離得到的不同種類多酚化合物的抗氧化活性的FRAP法測(cè)定蘭陵美酒的抗氧化活性,在96孔板中依次加入FRAP工作液和不同濃度的樣品溶液和FeSO4、Trolox溶液,搖勻,37℃孵育,測(cè)定波長(zhǎng)593 nm處的吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度(mmol/L),定義為FRAP值。FRAP值越大,抗氧化活性越強(qiáng)。
氨基酸是一切蛋白質(zhì)的組成單位,是人體正常生長(zhǎng)、發(fā)育和生命活動(dòng)中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分。氨基酸的攝入對(duì)于增強(qiáng)體質(zhì)、提高機(jī)體抗病能力有顯著作用[16]。本研究分析了蘭陵美酒中氨基酸和總多肽的含量(表1),結(jié)果表明,在蘭陵美酒中檢測(cè)到17種游離形式存在的氨基酸,包含了人體必需的7種氨基酸,即甲硫氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸。蘭陵美酒中游離氨基酸的總含量在1.45~2.78 g/L之間,與啤酒中的氨基酸含量1~3 g/L持平[17],其中蘭陵美酒中脯氨酸含量明顯高于啤酒中的含量(1.60~3.13 mg/L)[18]。蘭陵美酒樣品2號(hào)中的γ-氨基丁酸的含量為0.13 g/L,γ-氨基丁酸(GABA)是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),參與多種代謝活動(dòng),具有降低血壓、改善腦功能、增強(qiáng)記憶、抗焦慮、高效減肥及提高肝、腎機(jī)能等生理活性[19],充分體現(xiàn)了蘭陵美酒作為“液體蛋糕”的價(jià)值。
除了富含氨基酸外,蘭陵美酒中還檢測(cè)到含量豐富的多肽類化合物,肽是人體重要的生理調(diào)節(jié)物,它可全面調(diào)節(jié)人體生理功能,增強(qiáng)和發(fā)揮人體生理活性,它具有重要的生物學(xué)功能。蘭陵美酒中總多肽含量在2.37~7.18 g/L之間,甚至高于總游離氨基酸的含量。以數(shù)個(gè)氨基酸結(jié)合而形成的多肽具有比氨基酸更好的吸收性能和保健價(jià)值。很多多肽還具有原蛋白或氨基酸所沒有的生理功能,如促進(jìn)鈣的吸收、降血壓、降膽固醇、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、清除自由基、抗癌等生理功能[16]。
表1 蘭陵美酒中游離氨基酸的種類及含量 (g/L)
功能性低聚糖具有多種重要的生理功能。由于人體內(nèi)不具備分解、消化功能性低聚糖的酶系統(tǒng),在攝入后它很少產(chǎn)生熱量,但能被腸道中的有益微生物雙歧桿菌利用,促進(jìn)雙歧桿菌的增殖,從而改善腸道中的微生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)對(duì)B族維生素的合成及微量礦物質(zhì)的吸收,提高機(jī)體免疫力和抗病力。本研究分析測(cè)定了蘭陵美酒樣品中低聚糖的種類和含量(表2)。蘭陵美酒中主要的低聚糖有異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等,總低聚糖含量在7.00~9.52 g/L之間,高于一般黃酒中總低聚糖含量6.50~7.00 g/L的范圍[13]。其中潘糖含量為4.35 g/L,一般黃酒中潘糖含量約為3.00 g/L[13],可見蘭陵美酒在這方面明顯優(yōu)于一般黃酒,潘糖作為低聚異麥芽糖中的一種能夠維持選擇性增殖益生菌,有助于其維持人體腸道功能,増強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能,且不增加體內(nèi)的熱量與糖分,具有特殊的生理意義[20]。
表2 蘭陵美酒中低聚糖種類及含量 (g/L)
酚類化合物是一類生理活性化合物,多酚類物質(zhì)具有抗氧化功效,它們通過清除體內(nèi)過多的自由基,減少過氧化損傷從而有效地延緩心血管疾病、白內(nèi)障等多種慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展[21]。本研究分析了蘭陵美酒典型樣品中酚類化合物的含量(表3)。結(jié)果表明,在蘭陵美酒中共檢測(cè)到9種功能性酚酸類化合物,主要包含沒食子酸、p-羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸等。蘭陵美酒中酚酸物質(zhì)的總含量在101~304 mg/L之間,而干白葡萄酒的酚酸總量一般為120~200 mg/L[22]。蘭陵美酒中總酚類物質(zhì)的含量與干白葡萄酒中總酚類物質(zhì)的含量處于相同的水平。沒食子酸是蘭陵美酒中主要的酚酸,其含量超過70 mg/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過一般葡萄酒中沒食子酸的含量0.60~2.20 mg/L[23],沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性[24],同時(shí)也具有一定的抗腫瘤作用[25]。
表3 蘭陵美酒中酚酸類化合物種類及含量 (mg/L)
越來越多的研究顯示,抗氧化是預(yù)防衰老的重要步驟,因?yàn)樽杂苫蜓趸瘎?huì)將細(xì)胞和組織分解,影響代謝功能,并會(huì)引起不同的健康問題,所以抗氧化性食物的攝入對(duì)提高機(jī)體抗氧化能力具有重要意義。本研究采用FRAP法分析了蘭陵美酒樣品的抗氧化能力(表4),結(jié)果表明,蘭陵美酒樣品均具有較高的抗氧化能力,其中以1號(hào)樣品的抗氧化性最高,為4.76 mmol/L,3號(hào)、4號(hào)和2號(hào)樣品僅次之,但也均達(dá)到3 mmol/L以上,遠(yuǎn)高于對(duì)照黃酒樣品的抗氧化性。有文獻(xiàn)報(bào)道,葡萄酒FRAP抗氧化性能力一般在3~7 mmol/L之間[26],本研究結(jié)果表明,蘭陵美酒抗氧化能力接近典型抗氧化飲品葡萄酒的水平。
表4 蘭陵美酒抗氧化性能力分析結(jié)果 (mmol/L)
本研究從基本營(yíng)養(yǎng)成分和功能性成分角度系統(tǒng)研究了蘭陵美酒的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。研究結(jié)果表明,蘭陵美酒中含有豐富的功能性成分。在蘭陵美酒中除了較高含量(在1.45~2.78 g/L之間)的17種氨基酸外(包括人體必需的7種氨基酸),生理功能突出的多肽更值得關(guān)注。蘭陵美酒中檢測(cè)到的總多肽含量超過2 g/L,遠(yuǎn)高于啤酒、葡萄酒、日本清酒等酒精飲料。同時(shí)在蘭陵美酒中還檢測(cè)到γ-氨基丁酸、酚酸類化合物、功能性低聚糖等多種生理活性成分。γ-氨基丁酸含量在0.01~0.13 g/L之間;低聚糖總含量在7.00~9.52 g/L之間;功能性酚酸類總含量在101.64~304.48 mg/L之間。采用FRAP法測(cè)定蘭陵美酒的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)蘭陵美酒具有較高的抗氧化活性。由此可見,蘭陵美酒是一種富含功能性組分的酒精飲料,適量飲用有益身體健康。