蘭陵美酒功能性組分研究

張馨元，管桂坤，萬自然，劉明坤，陳 雙，徐 巖

（1.山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂277731； 2.江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇無錫214122)

蘭陵美酒是我國歷史傳統(tǒng)名酒之一，釀制歷史可追溯到殷商時代，距今有3000多年的歷史。蘭陵美酒取優(yōu)質(zhì)黍米為原料，以純凈甘洌的古老深井水制糊，放麥曲糖化發(fā)酵后，入瓷缸密封，陳釀半年啟缸[1]。其酒體呈琥珀光澤，晶瑩明澈，保有原料和發(fā)酵產(chǎn)生的天然混合香氣，濃郁襲人。獨(dú)特的釀酒原料及釀造工藝不僅賦予怡人的風(fēng)味，還使蘭陵美酒具有較高的保健價值。明代醫(yī)學(xué)泰斗李時珍飲蘭陵美酒后，從醫(yī)學(xué)的角度給予高度評價，在他的名著《本草綱目》中記載：“蘭陵美酒，清香遠(yuǎn)達(dá)，色復(fù)金黃，飲之至醉，不頭痛，不口干，不作瀉,皆水土之美也，常飲入藥俱良”[2]。但目前關(guān)于蘭陵美酒的功能性組分還缺乏深入科學(xué)的解析。

隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強(qiáng)，對酒的保健功能的研究越來越受到重視，葡萄酒中最重要的健康成分是功能性酚類化合物，其中主要包括黃酮類化合物和白藜蘆醇。有研究報道，飲食中的黃酮類化合物與缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)死亡率呈負(fù)相關(guān)。紅葡萄酒中的類黃酮能夠抑制低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的氧化，防止內(nèi)皮功能障礙，從而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。黃酮類化合物不僅為葡萄酒帶來了獨(dú)特的味道和顏色，同時也是葡萄酒中重要的健康成分[3]。而白藜蘆醇也是葡萄酒中的一種生物活性物質(zhì)，因其卓越的保健功效廣受關(guān)注[4]，其在心血管疾病和癌癥等慢性疾病的治療效果早已有研究報道[5]，大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也已證明其對高血壓、動脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗塞和心力衰竭有積極影響[6]。雖然多酚僅占葡萄酒總量的一小部分，但對心臟病的研究具有潛在的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)價值[7]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，黃酒中也存在一定含量的酚類化合物，對黃酒保健功能具有積極貢獻(xiàn)[8]，但目前還缺乏對蘭陵美酒中功能性酚類化合物的系統(tǒng)解析。

葡萄酒主要生產(chǎn)國十分重視葡萄酒保健功能的研究，日本也十分重視清酒保健功能的研究。今安聰?shù)葟那寰坪途圃阒邪l(fā)現(xiàn)9種ACE活性抑制肽（酒中3種，酒糟中6種）,ACE活性抑制肽有助于降低血壓；他們還發(fā)現(xiàn)了3種抑制脯氨酰內(nèi)肽酶的肽，這種肽有助于治療健忘、抑郁、老年性癡呆等疾病[9]。此外愛媛大學(xué)醫(yī)學(xué)部的奧田教授從清酒的酒糟提取液和生酒里發(fā)現(xiàn)了具有防治糖尿病的胰島素類活性物質(zhì)[9]。黃酒與清酒類似，從理論上講，黃酒尤其是紹興黃酒的保健功能應(yīng)優(yōu)于清酒，但對黃酒的研究還沒有引起足夠的重視。

然而目前關(guān)于黃酒功能性組分的研究還不夠深入，戴軍等[10]在古越龍山紹興黃酒中發(fā)現(xiàn)了4條活性很強(qiáng)的降血壓活性肽和一條降膽固醇的活性肽，說明黃酒中的生物活性肽及氨基酸還有待挖掘。此外糯米黃酒中已檢測到種類豐富的麥芽糖、潘糖、異麥芽糖、異麥芽糖三糖等功能性低聚糖[11]，但黍米黃酒中功能性低聚糖還很少有研究報道。因此黃酒中的功能性組分還需進(jìn)行深入的研究。

本研究以蘭陵美酒為研究對象，通過多角度解析蘭陵美酒中獨(dú)特的功能性組分種類及含量特征，試圖揭示蘭陵美酒保健價值內(nèi)在的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：由山東蘭陵美酒股份有限公司提供典型蘭陵美酒樣品，分別編號為1號、2號、3號和4號。

試劑：三氯乙酸、沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、p-香豆酸、阿魏酸和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；乙酸乙酯、冰乙酸，分析純；甲醇（色譜純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水；苯酚（分析純），西隴化工有限公司；硫酸（優(yōu)級純試劑），永華化學(xué)科技有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、檸檬酸、小蘇打、乳酸、氧化鈣均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純），J&K SCIENTIFIC LTD；食用酒精購買于臨安卡爾生物科技有限公司；異麥芽糖、異麥芽三糖，SUPELCO公司；潘糖，F(xiàn)luca公司；乙腈（色譜級），F(xiàn)ISHER公司。

儀器：Waters 600高效液相色譜儀、Breeze色譜工作站，蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI公司；1100型高效液相色譜儀、G1362A示差折光檢測器，Agilent公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；ENVI-18固相萃取柱，上海楚定分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨基酸及總多肽組分的測定

用10 g/100 mL三氯乙酸等體積稀釋，記錄稀釋倍數(shù)，放置1 h（難溶品，可超聲），保證溶液體系中TCA終濃度為5%。用雙層濾紙過濾后取1 mL澄清濾液于1.5 mL離心管內(nèi)，15000 r/min離心30 min。取400 μL上清液用0.22 μm水膜再次過濾后置于液相樣品瓶用于檢測分析。

準(zhǔn)確吸取0.200 mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH2.2的緩沖液稀釋到5 mL，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液濃度為5.00 nmol/50 μL，作為上機(jī)測定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自耦分析儀，以外標(biāo)法測定樣品的氨基酸含量。

按如下算式計算游離氨基酸含量：

式中：C為游離氨基酸的含量(g/kg)；n為游離氨基酸的檢測含量(nmol)；M為游離氨基酸的相對分子質(zhì)量(g/mol)；d為稀釋倍數(shù)；V為添加蒸餾水的體積(mL)；m為樣品的質(zhì)量(g)[12]。

1.2.2 功能性多糖的測定

本研究參照謝廣發(fā)等研究黃酒中功能性低聚糖的方法，取3 mL蘭陵美酒樣品于10 mL容量瓶中，加入2 mL無水乙醇，加純凈水定容搖勻，用ENVI-18固相萃取柱處理后進(jìn)樣，采用HPLC法（高效液相色譜法）對蘭陵美酒中的異麥芽糖進(jìn)行測定[13]。

1.2.3 功能性酚類化合物的測定

1.2.3.1 樣品處理

取100 mL蘭陵美酒，用體積分?jǐn)?shù)為37%的H3PO4調(diào)節(jié)pH值至2，加NaCl 20 g，100 mL乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，4 mL V(甲醇)∶V(水)=50∶50溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾。低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 色譜條件

Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm i.d.250 mm，5 μm)色譜柱（安捷倫科技有限公司），流動相為A相：甲醇+冰乙酸(0.1%)，B相：水+冰乙酸(0.1%)，進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測波長為280 nm和254 nm（原兒茶酸和香草酸在254 nm處檢測，其余在280 nm處檢測）；柱溫20 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3.3 外標(biāo)工作曲線和線性范圍的確定

準(zhǔn)確稱取0.0001 g沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、p-香豆酸和槲皮素溶于V(甲醇)∶V(水)=50∶50溶液中，分別定容于10 mL容量瓶中。稀釋成不同濃度梯度，進(jìn)樣量10 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性范圍、回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差[14]。

1.2.4 抗氧化性的測定

本研究參照李媛媛等[15]在運(yùn)用微型DPPH、ABTS和FRAP法動態(tài)監(jiān)測從紅酒中分離得到的不同種類多酚化合物的抗氧化活性的FRAP法測定蘭陵美酒的抗氧化活性，在96孔板中依次加入FRAP工作液和不同濃度的樣品溶液和FeSO4、Trolox溶液，搖勻，37℃孵育，測定波長593 nm處的吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度(mmol/L)，定義為FRAP值。FRAP值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭陵美酒中氨基酸及總多肽組分研究

氨基酸是一切蛋白質(zhì)的組成單位，是人體正常生長、發(fā)育和生命活動中不可缺少的營養(yǎng)成分。氨基酸的攝入對于增強(qiáng)體質(zhì)、提高機(jī)體抗病能力有顯著作用[16]。本研究分析了蘭陵美酒中氨基酸和總多肽的含量（表1），結(jié)果表明，在蘭陵美酒中檢測到17種游離形式存在的氨基酸，包含了人體必需的7種氨基酸，即甲硫氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸。蘭陵美酒中游離氨基酸的總含量在1.45～2.78 g/L之間，與啤酒中的氨基酸含量1～3 g/L持平[17]，其中蘭陵美酒中脯氨酸含量明顯高于啤酒中的含量（1.60～3.13 mg/L）[18]。蘭陵美酒樣品2號中的γ-氨基丁酸的含量為0.13 g/L，γ-氨基丁酸（GABA）是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種代謝活動，具有降低血壓、改善腦功能、增強(qiáng)記憶、抗焦慮、高效減肥及提高肝、腎機(jī)能等生理活性[19]，充分體現(xiàn)了蘭陵美酒作為“液體蛋糕”的價值。

除了富含氨基酸外，蘭陵美酒中還檢測到含量豐富的多肽類化合物，肽是人體重要的生理調(diào)節(jié)物，它可全面調(diào)節(jié)人體生理功能，增強(qiáng)和發(fā)揮人體生理活性，它具有重要的生物學(xué)功能。蘭陵美酒中總多肽含量在2.37～7.18 g/L之間，甚至高于總游離氨基酸的含量。以數(shù)個氨基酸結(jié)合而形成的多肽具有比氨基酸更好的吸收性能和保健價值。很多多肽還具有原蛋白或氨基酸所沒有的生理功能，如促進(jìn)鈣的吸收、降血壓、降膽固醇、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、清除自由基、抗癌等生理功能[16]。

表1 蘭陵美酒中游離氨基酸的種類及含量 (g/L)

2.2 蘭陵美酒功能性多糖研究

功能性低聚糖具有多種重要的生理功能。由于人體內(nèi)不具備分解、消化功能性低聚糖的酶系統(tǒng)，在攝入后它很少產(chǎn)生熱量，但能被腸道中的有益微生物雙歧桿菌利用，促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，從而改善腸道中的微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)對B族維生素的合成及微量礦物質(zhì)的吸收，提高機(jī)體免疫力和抗病力。本研究分析測定了蘭陵美酒樣品中低聚糖的種類和含量（表2）。蘭陵美酒中主要的低聚糖有異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等，總低聚糖含量在7.00～9.52 g/L之間，高于一般黃酒中總低聚糖含量6.50～7.00 g/L的范圍[13]。其中潘糖含量為4.35 g/L，一般黃酒中潘糖含量約為3.00 g/L[13]，可見蘭陵美酒在這方面明顯優(yōu)于一般黃酒，潘糖作為低聚異麥芽糖中的一種能夠維持選擇性增殖益生菌，有助于其維持人體腸道功能，増強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，且不增加體內(nèi)的熱量與糖分，具有特殊的生理意義[20]。

表2 蘭陵美酒中低聚糖種類及含量 (g/L)

2.3 蘭陵美酒功能性酚類化合物的研究

酚類化合物是一類生理活性化合物，多酚類物質(zhì)具有抗氧化功效，它們通過清除體內(nèi)過多的自由基，減少過氧化損傷從而有效地延緩心血管疾病、白內(nèi)障等多種慢性疾病的發(fā)生、發(fā)展[21]。本研究分析了蘭陵美酒典型樣品中酚類化合物的含量（表3）。結(jié)果表明，在蘭陵美酒中共檢測到9種功能性酚酸類化合物，主要包含沒食子酸、p-羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸等。蘭陵美酒中酚酸物質(zhì)的總含量在101～304 mg/L之間，而干白葡萄酒的酚酸總量一般為120～200 mg/L[22]。蘭陵美酒中總酚類物質(zhì)的含量與干白葡萄酒中總酚類物質(zhì)的含量處于相同的水平。沒食子酸是蘭陵美酒中主要的酚酸，其含量超過70 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過一般葡萄酒中沒食子酸的含量0.60～2.20 mg/L[23]，沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性[24]，同時也具有一定的抗腫瘤作用[25]。

表3 蘭陵美酒中酚酸類化合物種類及含量 (mg/L)

2.4 蘭陵美酒抗氧化性功能研究

越來越多的研究顯示，抗氧化是預(yù)防衰老的重要步驟，因?yàn)樽杂苫蜓趸瘎⒓?xì)胞和組織分解，影響代謝功能，并會引起不同的健康問題，所以抗氧化性食物的攝入對提高機(jī)體抗氧化能力具有重要意義。本研究采用FRAP法分析了蘭陵美酒樣品的抗氧化能力（表4），結(jié)果表明，蘭陵美酒樣品均具有較高的抗氧化能力，其中以1號樣品的抗氧化性最高，為4.76 mmol/L，3號、4號和2號樣品僅次之，但也均達(dá)到3 mmol/L以上，遠(yuǎn)高于對照黃酒樣品的抗氧化性。有文獻(xiàn)報道，葡萄酒FRAP抗氧化性能力一般在3～7 mmol/L之間[26]，本研究結(jié)果表明，蘭陵美酒抗氧化能力接近典型抗氧化飲品葡萄酒的水平。

表4 蘭陵美酒抗氧化性能力分析結(jié)果 (mmol/L)

3 結(jié)論

本研究從基本營養(yǎng)成分和功能性成分角度系統(tǒng)研究了蘭陵美酒的營養(yǎng)保健價值。研究結(jié)果表明，蘭陵美酒中含有豐富的功能性成分。在蘭陵美酒中除了較高含量（在1.45～2.78 g/L之間）的17種氨基酸外（包括人體必需的7種氨基酸），生理功能突出的多肽更值得關(guān)注。蘭陵美酒中檢測到的總多肽含量超過2 g/L，遠(yuǎn)高于啤酒、葡萄酒、日本清酒等酒精飲料。同時在蘭陵美酒中還檢測到γ-氨基丁酸、酚酸類化合物、功能性低聚糖等多種生理活性成分。γ-氨基丁酸含量在0.01～0.13 g/L之間；低聚糖總含量在7.00～9.52 g/L之間；功能性酚酸類總含量在101.64～304.48 mg/L之間。采用FRAP法測定蘭陵美酒的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)蘭陵美酒具有較高的抗氧化活性。由此可見，蘭陵美酒是一種富含功能性組分的酒精飲料，適量飲用有益身體健康。