關(guān)于熒光定量PCR在預(yù)測(cè)微生物學(xué)中的運(yùn)用分析

韋蘭芳

【摘 ? 要】 預(yù)測(cè)微生物學(xué)是由計(jì)算機(jī)、微生物與統(tǒng)計(jì)學(xué)等學(xué)科綜合而成的一種新型學(xué)科，主要利用數(shù)學(xué)語言對(duì)微生物生長(zhǎng)與死亡規(guī)律進(jìn)行預(yù)測(cè)、描述。熒光定量PCR主要利用熒光信號(hào)對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析位置模板。本文主要對(duì)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行研究，并對(duì)其在預(yù)測(cè)微生物學(xué)中運(yùn)用進(jìn)行分析，以供相關(guān)人士參考。

【關(guān)鍵詞】 預(yù)測(cè)微生物學(xué);運(yùn)用分析;熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Application and Analysis of fluorescent quantitativePCR in predicting Microbiology

Wei Lanfang

（Anhui Kebo Product testing Research Institute company Ltd. ? 230000）

[Abstract] Predictive microbiology is a new kind of discipline， which is composed of computer， microorganism and statistics. It mainly uses mathematical language to predict and describe the law of microbial growth and death. Fluorescence quantitative PCR mainly uses fluorescence signal to monitor the process of polymerase chain reaction and quantitative analysis of position template by standard curve. In this paper， the technology of fluorescent quantitative polymerase chain reaction （FQPCR） is studied， and its application in predictive microbiology is analyzed for the reference of relevant people.

[Keywords] predictive microbiology; applied analysis; fluorescence quantitative polymerase chain reaction

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)源于國(guó)外，能夠?qū)е潞怂惚┰?，促進(jìn)微觀分子可視化。在生物科學(xué)技術(shù)快速發(fā)展過程中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)要求越來越高，從而產(chǎn)生了熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。因?yàn)闊晒舛烤酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)具有高效與特異等優(yōu)點(diǎn)，所以在醫(yī)藥衛(wèi)生、微生物與農(nóng)業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用空間。在微生物應(yīng)用過程中需要通過科學(xué)技術(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，判斷微生物產(chǎn)品是否安全、可靠。

1 ?熒光定量PCR技術(shù)

1.1 ?技術(shù)原理

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)有水解探針法與熒光染料法等。水解探針法主要能夠?qū)⑻结樛暾云茐牡簦瑢?dǎo)致能量傳遞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象而崩潰，從而出現(xiàn)熒光信號(hào)。當(dāng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一輪之后便可以收集到一次熒光信號(hào)，從而對(duì)整個(gè)反應(yīng)過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)。染料法屬于常用檢測(cè)技術(shù)，主要通過綠色激發(fā)波長(zhǎng)染料和DNA雙鏈小溝結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，且信號(hào)收集量和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物增加量相等[1]。較傳統(tǒng)技術(shù)方法而言，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)能夠確定優(yōu)勢(shì)微生物群落，良好功能微生物類群。在熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用過程中可能會(huì)發(fā)生假陽性，在樣本定量分析時(shí)可通過死菌DNA結(jié)合避免其擴(kuò)增。

1.2 ?特征

通常情況下PCR產(chǎn)物都需要通過瓊脂糖凝膠電泳與溴化乙錠染色紫外光的觀察結(jié)果來進(jìn)行檢測(cè)，不僅需要耗費(fèi)大量時(shí)間，還需要使用多種儀器設(shè)備，且染色劑對(duì)于人體存在著一定的危害。熒光定量PCR克服了傳統(tǒng)PCR的一些缺陷，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

1.2.1 ?特異性 ? ?熒光定量PCR具有非常良好的準(zhǔn)確性，原因在于它使用針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)的特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，探針與引物的雙重控制模式下，假陽性低，可以最大化保障試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.2 ?線性關(guān)系 ? ?熒光信號(hào)的出現(xiàn)與擴(kuò)增產(chǎn)物之間呈現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的關(guān)系，熒光信號(hào)檢測(cè)可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量操作。

1.2.3 ?高靈敏度 ? ?熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)綜合了多種技術(shù)手段，包括PCR技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼現(xiàn)象技術(shù)等在內(nèi)，檢測(cè)靈敏度有所保證。

1.2.4 ?操作簡(jiǎn)便 ? ?該技術(shù)的自動(dòng)化水平較高，無論是擴(kuò)增還是檢測(cè)環(huán)節(jié)都可以在全封閉的管內(nèi)進(jìn)行，降低了溴化乙錠可能產(chǎn)生的影響。另外，在不需要開蓋的前提下可以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增與檢測(cè)的同步完成，無需后期處理，在3h內(nèi)完成多個(gè)樣品的定量分析。

2 ?預(yù)測(cè)微生物學(xué)運(yùn)用

2.1 ?臨床微生物檢驗(yàn)應(yīng)用

在臨床診斷與治療過程中，常會(huì)通過實(shí)驗(yàn)方式對(duì)各種微生物標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)，從而為醫(yī)師臨床疾病判斷和治療方案制定提供重要依據(jù)。臨床醫(yī)務(wù)人員事先做好標(biāo)本采集工作，通過規(guī)范采集提高標(biāo)本準(zhǔn)確性，不會(huì)對(duì)臨床微生物預(yù)測(cè)分析造成直接影響。臨床醫(yī)生與檢驗(yàn)人員必須遵循醫(yī)院標(biāo)本采集規(guī)范，在微生物檢驗(yàn)和預(yù)測(cè)分析過程中重視臨床溝通。醫(yī)生在臨床工作過程中通常都以微生物檢驗(yàn)報(bào)告為主，護(hù)理人員需要將檢驗(yàn)單交給患者家屬，并對(duì)樣本采集注意事項(xiàng)進(jìn)行補(bǔ)充說明。真菌、病毒與細(xì)菌等是臨床微生物檢驗(yàn)常見物，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在這些微生物檢驗(yàn)中具有廣泛應(yīng)用空間。在臨床真菌檢驗(yàn)工作開展方面，檢驗(yàn)人員可以通過熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)樣本，臨床結(jié)果顯示出來的特異度能夠達(dá)到100%，技術(shù)檢驗(yàn)結(jié)果精確性很高。在病毒檢驗(yàn)方面，臨床微生物檢驗(yàn)人員可以選擇各種類型樣本為研究對(duì)象，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)出各種混合基因型[2]。比如在手足口病疾病臨床診斷過程中，醫(yī)師可以通過熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)快速檢測(cè)出來，這對(duì)臨床醫(yī)師預(yù)測(cè)、評(píng)估患者病情具有重要意義。檢驗(yàn)人員可以使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)將細(xì)菌中包含的各種類型基因檢測(cè)出來，且臨床檢驗(yàn)特異性與靈敏度都很高，能夠有效提升臨床檢驗(yàn)效果與工作效率。

2.2 ?乳品微生物檢測(cè)應(yīng)用

益生菌是乳品微生物中的一部分，攝入足量益生菌微生物能夠促進(jìn)宿主健康成長(zhǎng)。以生物數(shù)量關(guān)乎宿主生命健康，可以通過貨架期內(nèi)產(chǎn)品保持宿主腸內(nèi)以生物存活量。在益生菌產(chǎn)品使用方面，首先需要對(duì)產(chǎn)品安全質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。在乳品微生物檢測(cè)方面，可以通過熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)降低檢驗(yàn)成本，縮短益生菌鑒定時(shí)間。在定量市售產(chǎn)品益生菌含量測(cè)定方面，是呀人員需要合理設(shè)置引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)，這種檢測(cè)方式能夠獲得較好靈敏度，其在酸奶制品檢測(cè)方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。國(guó)外有學(xué)者將熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和核酸染料融合形成一種新的檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)⒒钚噪p歧桿菌與乳酸菌區(qū)分開來，對(duì)兩種生物菌數(shù)量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。相對(duì)于平板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)而言，這種熒光定量PCR技術(shù)用時(shí)更短，能夠?qū)z測(cè)時(shí)間縮短到3小時(shí)。在發(fā)酵乳制品檢驗(yàn)方面，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)能夠?qū)θ橹破吩腥樗峋N類進(jìn)行檢測(cè)，并確定各種菌群規(guī)模量。在成品干酪制作方面，有益微生物能夠?qū)@種產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生直接影響。干酪產(chǎn)品可能會(huì)因?yàn)檫x擇媒介缺乏而無法量化表面細(xì)菌。在涂抹型干酪檢測(cè)過程中，檢驗(yàn)人員可以通過熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)出產(chǎn)品棒狀桿菌功能與生態(tài)系統(tǒng)。

2.3 ?食源性致病菌檢測(cè)

傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測(cè)方案包括菌分離培養(yǎng)、生化鑒定等多個(gè)步驟，不僅時(shí)間耗費(fèi)較長(zhǎng)，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性存在一定的缺陷。目前生物學(xué)診斷方法被廣泛用戶食源性疾病的快速檢測(cè)當(dāng)中，其快速、高效的特征也明顯改進(jìn)了傳統(tǒng)方案的缺陷。具體來看，微生物快速檢測(cè)分析以快速精準(zhǔn)的致病菌監(jiān)測(cè)方案為基礎(chǔ)，可以對(duì)食品中毒的不同特異性基因作為檢測(cè)食源性致病菌的標(biāo)靶基因。有研究針對(duì)南美白對(duì)蝦的食源性致病菌進(jìn)行了檢測(cè)，通過DNA提取、多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，成功地進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，無論是人工接種還是自然污染的生蝦樣品當(dāng)中都檢測(cè)出了食源性致病菌。在目前的食源性致病菌檢測(cè)工作當(dāng)中，考慮到某些食品的背景菌群可能會(huì)在一定程度上影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此在檢測(cè)環(huán)節(jié)可以視情況增加一個(gè)滅菌步驟，除去實(shí)驗(yàn)樣品中的背景菌群。而多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法并不會(huì)受到背景微生物群的嚴(yán)重干擾，在特異性與擴(kuò)增效率上都能保持較高的水平，其特異性的優(yōu)勢(shì)也能確保該方案可以適用于不同食品基質(zhì)中的致病菌檢測(cè)。需要注意的是某些研究中需要利用PCR之前的增菌過程來更好地促進(jìn)反應(yīng)靈敏度的提升，但考慮到這一過程需要耗費(fèi)數(shù)個(gè)小時(shí)以上的時(shí)間，對(duì)于試驗(yàn)效率會(huì)產(chǎn)生一定的不利影響。

3 ?結(jié)語

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在乳制品微生物與臨床微生物檢驗(yàn)、判斷等方面具有較高應(yīng)用價(jià)值。在預(yù)測(cè)微生物學(xué)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)運(yùn)用過程中，需要對(duì)以往缺陷進(jìn)行改進(jìn)，選擇符合實(shí)際需求的樣品，通過現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)將檢驗(yàn)結(jié)果顯示出來。在微生物檢驗(yàn)方法應(yīng)用方面，要不斷探索熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用模型，通過預(yù)測(cè)模型優(yōu)化、創(chuàng)新提高微生物檢驗(yàn)效果，避免微生物生產(chǎn)應(yīng)用出現(xiàn)安全問題。

參考文獻(xiàn)：

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