ELISA法測定番茄莖葉中的褪黑素含量

胡永靜，潘光軍，龍 慧，皮 毅，張才鮮，明方艷，谷 佳，陳阿敏，須 文

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

20世紀50年代后期，研究人員在牛的松果體中發(fā)現(xiàn)并鑒定了色氨酸的衍生物——N-乙酰-5-甲氧基色胺，即褪黑素[1-2]。進入21世紀以來，研究者對褪黑素在動物體內(nèi)的作用進行了深入研究。它是一種非常有效的自由基清除劑[3]，能清除包括活性氧、活性氮等在內(nèi)的自由基過氧化物。褪黑素一直被認為是動物特有的激素，直到1993年，人們在高等植物中也發(fā)現(xiàn)褪黑素的存在[4]，隨后研究發(fā)現(xiàn)其在植物中也是普遍存在的[5]。在植物體的不同器官（如根和葉）、不同組織中、不同發(fā)育階段，褪黑素的含量并不相同。

非生物和生物脅迫都已被證實可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)褪黑素的合成。在脅迫條件特別是氧化應(yīng)激下，褪黑素含量的代償性增加，反過來有助于緩解脅迫環(huán)境造成的不良后果。已經(jīng)報道含有褪黑素的植物主要是中草藥和食用植物[6]。相對于中草藥植物，日常食用的蔬菜水果中褪黑素含量較少，蕓薹屬油料作物的種子中褪黑素含量較高，接近200 ng/g。番茄果實中的褪黑素含量很低。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的病害，是造成保護地番茄減產(chǎn)的主要原因之一[7]，目前生產(chǎn)上主要以農(nóng)藥防治為主，但存在著農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染的問題。魚腥草是一種重要的藥食兼用蔬菜，在貴州各地均有種植。魚腥草提取液中的多種活性成分具有較強的抗菌特性[8]。魚腥草提取液預(yù)處理能不能增強番茄對灰霉菌的抗性？如果能夠增強，這種抗性的加強與內(nèi)源褪黑素含量的增加有沒有關(guān)系？為了回答這些問題特進行此次試驗。

褪黑素的測定方法主要有生化免疫方法、紫外分光光度法、色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[9]。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點。目前利用該技術(shù)來測定動物體內(nèi)的褪黑素含量已有很多文獻報道[10-15]，但是還鮮少有文獻報道采用ELISA法來測定植物中的褪黑素含量。試驗采用ELISA法測定正常番茄幼苗莖葉中的褪黑素含量，以及魚腥草提取液預(yù)處理和接種灰霉菌孢子后的莖葉中的褪黑素含量，以探討ELISA法測定番茄中褪黑素含量的有效性，也為進一步研究魚腥草的有效利用和增強生產(chǎn)上番茄對灰霉病的抗性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試番茄材料為浙雜809，種子購于浙江浙農(nóng)種業(yè)有限公司；供試番茄灰霉菌由浙江大學(xué)蔬菜研究所師愷教授惠贈；魚腥草采自貴州大學(xué)蔬菜教學(xué)科研基地；褪黑素標準液購自北京綠源伯德生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄育苗

試驗在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝專業(yè)基礎(chǔ)實驗室進行。2017年9月23日將番茄種子用55 ℃溫湯浸種15 min，然后置于墊有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于28 ℃恒溫箱中避光催芽。9月25日，當種子胚根長為種子直徑1/2時，將種子播在V（泥炭）∶V（蛭石）∶V（珍珠巖）＝3∶1∶1的混合基質(zhì)填充的50孔穴盤中，置于平均溫度為白天25 ℃，夜間22 ℃環(huán)境中，相對濕度70%，光周期為照光14 h，黑暗10 h，光照強度保持在300mol/（m2·s）的室內(nèi)培養(yǎng)架上培養(yǎng)。10月5日，番茄苗真葉顯露。10月15日，將2葉1心的幼苗移栽于15 cm直徑的塑料缽中，培養(yǎng)基質(zhì)與播種用基質(zhì)相同。每3 d用N-P2O5-K2O+TE（20-20-20+TE）的水溶肥稀釋1 000倍后澆灌幼苗。

1.2.2 番茄莖、葉中褪黑素含量測定

待番茄幼苗長到4葉1心期時，取鮮樣測定其莖葉中的褪黑素含量。取樣方法：分別從9株植物上取葉片和莖的樣品，3株為1個重復(fù)，每1個重復(fù)取0.3 g，共3次重復(fù)。

褪黑素的含量測定采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被褪黑素抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的褪黑素呈正相關(guān)。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值）。褪黑素標準品的濃度依次為：0、50、100、200、400、800 pg/mL，在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，計算樣品濃度。

1.2.3 魚腥草提取液處理對灰霉菌發(fā)病情況及莖、葉中褪黑素影響試驗

當番茄長到4葉1心時進行魚腥草和灰霉菌處理的相關(guān)試驗。選取生長健康、長勢一致的番茄幼苗進行魚腥草[13]提取液預(yù)處理，全株莖葉等部位均勻噴施，對照為蒸餾水處理；24 h后，在葉面、主莖部位均勻噴施番茄灰霉病菌溶液，對照為蒸餾水處理。具體操作方法如下：

魚腥草提取液處理：準確稱取研碎后的魚腥草地下莖10.0 g，置于250 mL的燒瓶中，按料液比1∶20（g/mL） 加入濃度70%的乙醇溶液，于80 ℃水浴鍋中回流浸提以提取地下莖中的抑菌活性成分；將稀釋500倍的魚腥草提取液進行番茄葉面及主莖噴施預(yù)處理，均勻噴施于植株表面。番茄灰霉病菌接種處理：24 h后，用濃度為2×105CFU/mL的灰霉菌孢子懸浮液在魚腥草提取液處理后的番茄葉面、主莖部位均勻噴施，以空白懸浮液試驗作為對照（表1）。

接種后保持空氣濕度90%以上，待植株發(fā)?。?～3 d）后觀察植株發(fā)病情況，并取樣測定葉片的褪黑素含量，取樣方法同1.2.2。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010、DPS和Origin軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、整理、分析和作圖。

表1 試驗設(shè)置

2 結(jié)果與分析

2.1 正常生長的番茄莖、葉褪黑素檢測結(jié)果分析

如圖1所示，正常生長的番茄葉片和莖的褪黑素含量之間差異極顯著，葉片的褪黑素含量達14.53 ng/g，莖的褪黑素含量為2.80 ng/g，葉片的褪黑素含量是莖的5.19倍。

以褪黑素標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制得到標準品線性回歸曲線方程為：y＝0.930 6x＋0.014 1（R2＝0.997 9）。試驗結(jié)果表明，ELISA法可以檢出的番茄莖葉中的褪黑素含量高于2.60 ng/g，就靈敏度而言，ELISA法完全可以用來檢測植物番茄莖葉中的褪黑素含量。

2.2 魚腥草提取液和灰霉病侵染對番茄莖、葉的褪黑素含量的影響

為研究魚腥草提取液對番茄灰霉菌是否有抑制作用，特進行預(yù)處理后接種灰霉菌的試驗。表型結(jié)果如圖2所示，番茄植株接種灰霉菌后（T3、T4）葉片尖端有部分萎蔫的表現(xiàn)，葉背面可見分散的病斑點。魚腥草提取液預(yù)處理的葉片（T4）發(fā)病比水處理（T3）的葉片發(fā)病病狀輕一些。另外，灰霉菌侵染番茄莖部，表型無差異。

圖1 正常生長的番茄莖葉的褪黑素含量

圖2 魚腥草提取液預(yù)處理后的番茄葉片對番茄灰霉菌侵染的表型響應(yīng)

由圖3可知，經(jīng)灰霉菌侵染后（T3、T4），番茄葉片的褪黑素含量顯著增加，其中蒸餾水預(yù)處理的（T3）葉片褪黑素含量為17.71 ng/g，而魚腥草提取液預(yù)處理的（T4）為17.82 ng/g，兩者差異不顯著；而未經(jīng)灰霉菌侵染的處理（T1、T2）分別為13.53、16.03 ng/g，其中，魚腥草提取液預(yù)處理的葉片（T2）褪黑素含量顯著高于未侵染水處理對照（T1）的褪黑素含量。由于灰霉菌侵染和魚腥草提取液處理對莖部表型無影響，故未測其褪黑素含量。

圖3 魚腥草提取液和灰霉菌侵染對番茄葉片的褪黑素含量的影響

3 結(jié)論與討論

試驗探討了利用ELISA法測定番茄莖葉中的褪黑素含量。結(jié)果表明：利用ELISA法可以檢出的番茄莖、葉中的褪黑素含量高于2.60 ng/g，就靈敏度而言，ELISA法完全可以用來檢測番茄莖、葉中的褪黑素含量。對更為準確的褪黑素含量測定則有賴于HPLC法等方法，但作為定性和準確度要求不高的試驗，ELISA法則是更加方便快捷的方法之一。

魚腥草提取液葉面噴施處理，以及灰霉菌侵染都引起番茄葉片褪黑素含量顯著增加，而且魚腥草提取液預(yù)處理有助于減輕番茄莖葉上的灰霉病發(fā)病癥狀；但是這種發(fā)病癥狀的減輕與葉片內(nèi)源褪黑素含量的增加似乎沒有太大的聯(lián)系，因為不管是魚腥草提取液預(yù)處理還是蒸餾水預(yù)處理的發(fā)病植株，其葉片的褪黑素含量之間沒有顯著差異，有可能依賴其他抗性誘導(dǎo)途徑。可以肯定的是魚腥草提取液預(yù)處理后番茄葉片褪黑素含量明顯增加，植物內(nèi)源褪黑素含量的增加有助于增強植物應(yīng)對各種非生物和生物脅迫的抗性[16-19]，這一結(jié)論已經(jīng)被許多研究報道所證實。