甘薯葉黃酮的基因型差異及磷酸氫二鉀乙醇雙水相提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

王永徐 邱天越 李臣 葉夏芳 崔鵬 曹如霞 陸國權(quán)

摘要：選用20個各地主栽品種，測其甘薯葉黃酮含量，其中觀賞品種臺灣紅的黃酮含量最高，為25.37 mg/g，徐薯27的黃酮含量最低，為10.63 mg/g，不同品種間甘薯葉黃酮含量差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。不同品種間的甘薯葉黃酮含量為紫葉甘薯品種>綠葉紫薯品種>綠葉常規(guī)品種。超聲輔助雙水相法提取甘薯葉黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取磷酸氫二鉀用量、乙醇用量和樣品量為自變量，甘薯葉黃酮得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Minitab 17軟件通過 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，分析各自變量之間交互作用對黃酮得率的影響，建立了黃酮得率的二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型。各單因素及其交互作用對黃酮得率的影響，優(yōu)化甘薯葉黃酮的提取工藝條件。結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取條件為磷酸氫二鉀用量3 g（30%），乙醇用量3.06 g（30.65%），樣品量是0.45 g，此時最大萃取得率為8.11%。

關(guān)鍵詞：甘薯莖葉;雙水相;黃酮;超聲輔助

中圖分類號： R284.2;TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0227-05

甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]，是旋花科（Convolvulaceae）薯蕷屬一年生或多年生蔓生草本植物，別稱紅薯、地瓜、番薯、甜薯等。甘薯是糧食作物[1]和經(jīng)濟(jì)作物，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)。我國是甘薯重要的產(chǎn)區(qū)之一，是甘薯種植的第一大國，我國甘薯種植面積占世界甘薯種植面積的65%左右，年產(chǎn)1.2億t，占世界甘薯產(chǎn)量的86%。近幾年，我國甘薯種植面積呈現(xiàn)緩慢下降趨勢[2]，而種植專用型甘薯品種的面積在不斷增加。隨著消費(fèi)多元化的發(fā)展，甘薯育種方向和加工方式都趨向于多元化發(fā)展。所以對甘薯莖葉的資源再利用具有十分重要的價值。甘薯莖葉含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、胡蘿卜素、維生素B、維生素C以及鐵、鈣、鎂、鈉等礦質(zhì)元素，而且富含活性多糖、多酚和黃酮類化合物，具有清除自由基、調(diào)劑免疫力、抗疲勞、抗菌、抗腫瘤、抗糖尿病等一系列功能。隨著天然產(chǎn)物的開發(fā)檢測技術(shù)日趨成熟，關(guān)于甘薯抗氧化功能物質(zhì)的研究越來越多。由于甘薯是我國重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物，對于廢棄甘薯莖葉的開發(fā)利用變得尤為重要。本研究應(yīng)用新型提取方法優(yōu)化提取的工藝條件，探究甘薯葉黃酮的最佳提取工藝條件，為甘薯葉黃酮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 2017年5月9日在浙江省杭州市臨安區(qū)浙江農(nóng)林平山試驗(yàn)基地種植徐薯22。每個小區(qū)面積3.6 m2，并扦插60株，3次重復(fù)。8月5日開始采收測定小區(qū)內(nèi)的甘薯葉，間隔10 d再進(jìn)行1次采收，至8月25日共采收3次;采收的甘薯葉片葉柄在45 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎、過90目篩低溫保存待測。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）;磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸銨、碳酸鈉、乙醇試劑（分析純，浙江卡爾生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器 DHG-9123A鼓風(fēng)干燥箱烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、TP-214分析天平（美國丹佛儀器有限公司）、分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、錘式旋風(fēng)磨（杭州大吉光電儀器有限公司）、超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇與不同種類無機(jī)鹽相圖的繪制和分相能力的對比 雙水相體系分相能力的研究參照池汝安等的方法[3]進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果表明，氯化鈉不能與無水乙醇形成雙水相，因?yàn)闇囟葘μ妓徕c的溶解度有很大影響，所以容易產(chǎn)生晶體而不能與乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系，磷酸氫二鉀、硫酸銨都能與乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系。室溫下，通過改變鹽的用量，采用濁點(diǎn)法繪制各雙水相體系見圖1。

由圖1可知，乙醇/磷酸氫二鉀、乙醇/碳酸鈉、乙醇/硫酸銨3種雙水相體系中，磷酸氫二鉀分相能力較強(qiáng)，在較少的乙醇和鹽的用量時，就能形成穩(wěn)定的雙水相體系，碳酸鈉在水中溶解度較另外2種鹽低，在含鹽量較低時該雙水相體系的分配系數(shù)較小，無法考察含鹽量較高時該雙水相體系對目標(biāo)萃取物的萃取效果，故不適合作萃取體系;硫酸銨能夠穩(wěn)定分相且持續(xù)時間長但在水中的溶解度沒有磷酸氫二鉀好，故不適合作萃取體系;磷酸氫二鉀既能夠穩(wěn)定分相，而且持續(xù)時間長，分相的濃度范圍廣，萃取能力強(qiáng)，故選用磷酸氫二鉀與乙醇為萃取甘薯葉多酚的雙水相體系，并對其進(jìn)一步研究。

1.2.2 黃酮的測定 參考陸國權(quán)等的方法[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型品種甘薯葉黃酮含量

從表1、表2可知，甘薯葉的黃酮含量分布在10～30 mg/g之間，觀賞品種臺灣紅的黃酮含量最高，為25.37 mg/g，其次是秦紫薯3號，為21.14 mg/g，徐薯27的黃酮含量最低，為 10.63 mg/g，不同品種間甘薯葉黃酮含量差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。不同品種間的甘薯葉黃酮含量為紫葉甘薯品種>綠葉紫薯品種>綠葉常規(guī)品種。

2.2 單因素影響試驗(yàn)

2.2.1 樣品量對提取率的影響 由圖2可以看出，樣品用量直接影響甘薯葉總黃酮的提取率，樣品用量過大或者過小都不利于總黃酮的提取。樣品量過小，磷酸氫二鉀用量增大，會因溶劑用量過多，影響雙水相的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致總黃酮提取率下降;磷酸氫二鉀用量過大，溶劑體積過少，黃酮類從樣品擴(kuò)散到溶劑中的速率低，而且極易達(dá)到飽和狀態(tài)。因此選用0.4 g的樣品用量。

2.2.2 磷酸氫二鉀用量對提取率的影響 在磷酸氫二鉀-乙醇雙水相中，上相由乙醇和水組成，由于黃酮類化合物易溶于乙醇所以進(jìn)入上相。雙水相的形成是磷酸氫二鉀與乙醇爭奪水分子的過程。隨著磷酸氫二鉀用量的增加，鹽對水的束縛能力逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致上相中乙醇的相對體積分?jǐn)?shù)增加[5]。因此，鹽用量的多少可影響到上相的極性，最終影響到黃酮的提取率[6]。從圖3可以看出，隨著磷酸氫二鉀用量的增加，總黃酮得率先上升后下降，在磷酸氫二鉀2.5 g時黃酮的提取率達(dá)到最大值。探究其中的原因，可能是因?yàn)榱姿釟涠浽?.5 g時形成的雙水相最為穩(wěn)定，有利于黃酮的溶出和擴(kuò)散。

2.2.3 乙醇用量對提取率的影響 由圖4可知，在乙醇質(zhì)量小于3.0 g時，隨著乙醇質(zhì)量的增加，黃酮提取率呈現(xiàn)上升趨勢;在 3.0 g 時黃酮的提取率達(dá)到最大值;在乙醇質(zhì)量大于30 g時，黃酮的提取率呈現(xiàn)下降趨勢。這是因?yàn)橐掖嫉挠昧慷嗌贂苯佑绊戨p水相提取效果。過低的乙醇用量不利于黃酮類化合物從植物細(xì)胞中溶解出來，而過高的乙醇用量不易透過親水性植物細(xì)胞壁，也會導(dǎo)致鹽的析出[7]。當(dāng)水的用量過少時鹽不能完全溶解，過多時則無法形成雙水相體系。因此，初步確定乙醇最佳用量為3.0 g，此時黃酮提取率最高。

2.2.4 超聲時間對提取率的影響 由圖5可知，在超聲時間為10～40 min時甘薯葉黃酮得率隨超聲時間的延長而提高，在 40 min 時達(dá)到最大值，之后繼續(xù)超聲提取得率會有所降低，可能是因?yàn)槌晻r間過長，甘薯莖葉里面的黃酮已經(jīng)全部溶出，過長的超聲時間導(dǎo)致黃酮類化合物部分氧化降解[8]，從而導(dǎo)致提取得率下降。所以，選定40 min為最佳超聲時間。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇磷酸氫二鉀用量（A）、乙醇用量（B）、樣品量（C）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，確定甘薯葉黃酮提取的較優(yōu)條件，試驗(yàn)因素水平組合見表3，Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4。

采用Minitab 17軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到甘薯葉黃酮提取率對A（磷酸氫二鉀用量）、B（乙醇用量）、C（樣品量）的二次多項(xiàng)回歸方程為黃酮提取率=-9.652+6.545A+4.910B+1.823C-0.858 3A2-0.678 3B2-1.913C2-0.350 0A×B-0.700A×C+0.660B×C。

回歸模型分析：R2為99.35%;R2（調(diào)整）為98.17%;R2（預(yù)測）為95.11%。

由表5可知，整體模型顯著性水平P<0.01，表明該模型達(dá)到了極顯著水平。校正決定系數(shù)R2（調(diào)整）為值為 98.17%，說明多酚得率的變化有98.17%來自此3個因素。由表中的F值和P值可以看出模型中B、C、A2、B2、C2，和 A×B、A×C、B×C對甘薯葉黃酮提取率有極顯著影響。由F值大小可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為乙醇>樣品量>磷酸氫二鉀用量。

2.4 響應(yīng)面分析

使磷酸氫二鉀用量、乙醇用量、樣品量三因素交互作用，做響應(yīng)曲面，由圖6可知，磷酸氫二鉀用量與樣品量相互作用對甘薯葉黃酮提取率的影響十分明顯，提取率的響應(yīng)面開口向下，提取率和雙水相萃取體系中的3個制約因素呈現(xiàn)明顯的二次拋物線關(guān)系。隨著每個因素水平的增加，響應(yīng)值提取率也在增大[9]。三因素的增加，響應(yīng)值提取率出現(xiàn)最大值，隨著三因素水平繼續(xù)增加，提取率呈現(xiàn)不同斜率的下降，該回歸模型具有穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是最大值[10]。借助Minitab17中多元二次回歸模型對甘薯葉黃酮提取率進(jìn)行估算，對二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行極值分析，解方程可得甘薯葉中黃酮的較優(yōu)提取條件為磷酸氫二鉀用量3 g（30%），乙醇用量是3.06 g（30.65%），樣品量是0.45 g，此時理論最大萃取得率為811%?？紤]實(shí)際操作，取磷酸氫二鉀30%，乙醇濃度30%，樣品量是0.45 g，3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果平均值為8.07%，基本與預(yù)測值相近。由此可見，該模型能夠較為準(zhǔn)確地反映出三種因素對甘薯葉中的黃酮提取率的影響。

3 討論與結(jié)論

不同品種間甘薯葉黃酮含量差異極顯著，紫色甘薯葉品種的黃酮含量高于一般品種。紫色甘薯葉品種花青素含量高于一般品種，花青素和黃酮有相同的合成代謝通路[11]，所以甘薯葉黃酮的含量與葉色有很大的相關(guān)性。優(yōu)化提取試驗(yàn)結(jié)果表明，加入相對多的磷酸氫二鉀形成了水相體系，所得提取率略小但差異不顯著，主要是目標(biāo)提取物黃酮進(jìn)入雙水相體系，表面性質(zhì)、電荷作用和離子鍵、氫鍵、憎水鍵以及環(huán)境等都會對黃酮在上下相中的分配造成影響[12]，造成其在上、下兩相中的濃度不同，甘薯葉粉樣剛好懸浮于兩相之間，易溶于乙醇相的黃酮提取出后進(jìn)入上相，易溶于水相的多糖等物質(zhì)溶于下相。這樣，提取和分離過程同時進(jìn)行，對甘薯葉提取液中的黃酮成分起到了一定的純化、富集作用。本試驗(yàn)優(yōu)化的甘薯葉黃酮提取率為8.11%，與李文芳等的研究結(jié)果[13-14]存在差異;應(yīng)該是本研究材料包括葉柄部分，葉柄中含有木質(zhì)化纖維等機(jī)械組織影響了提取得率;另外也可能是由試驗(yàn)材料選用的甘薯品種、種植地點(diǎn)、取樣時間、測定方法等差異不同造成的[15-16]。

不同品種間甘薯葉黃酮含量差異達(dá)到極顯著水平。不同品種間的甘薯葉黃酮含量為紫葉甘薯品種>綠葉紫薯品 種> 綠葉常規(guī)品種。磷酸氫二鉀-乙醇雙水相超聲波輔助提取甘薯葉中黃酮的較優(yōu)提取條件為磷酸氫二鉀用量3 g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%），乙醇用量3.06 g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30.65%），樣品量是0.45 g，此時理論最大萃取得率為8.11%。利用乙磷酸氫二 鉀- 乙醇雙水相超聲輔助提取甘薯葉中黃酮的得率約為 8.11%，得率較高，用時較短，操作不復(fù)雜，具有較強(qiáng)的可操作性。由此可得，磷酸氫二鉀-乙醇雙水相超聲輔助提取適合于甘薯葉中黃酮類化合物的提取，為甘薯葉的進(jìn)一步資源化開發(fā)利用提供了一定的技術(shù)支撐。

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收稿日期：2018-09-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31671750）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-11-B-18）;浙江省重大科技專項(xiàng)（編號：2012C12902-3）。

作者簡介：王永徐（1992—），男，山東臨沂人，碩士，研究方向?yàn)楦适砬o葉功能成分。E-mail：w824981332@163.com。

通信作者：陸國權(quán)，博士，教授，研究方向?yàn)槭眍惼焚|(zhì)評價及其產(chǎn)后商品化技術(shù)。E-mail：lugq10@zju.edu.cn。