家兔β干擾素啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建及其啟動(dòng)子活性鑒定

陳萌萌 范志宇 胡波 宋艷華 魏后軍 仇汝龍 朱偉峰 徐為中 王芳

摘要：通過家兔體內(nèi)感染兔出血癥病毒（RHDV）后發(fā)現(xiàn)體內(nèi)干擾素-β（Interferon-β，IFN-β）基因表達(dá)水平明顯降低。為體外研究RHDV感染宿主后IFN-β啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)制，首先以家兔肝細(xì)胞總cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增IFN-β基因啟動(dòng)子區(qū)的序列，經(jīng)測序確定全長為550 bp;預(yù)測軟件分析，與人源IFN-β基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄上調(diào)區(qū)域（positive regulation domain，PRD）高度同源;隨后將啟動(dòng)子全長和一系列轉(zhuǎn)錄元件克隆至pGL6-Basic熒光素酶表達(dá)載體中，成功構(gòu)建重組體報(bào)告基因質(zhì)粒后，瞬轉(zhuǎn)RK-13細(xì)胞，利用試劑盒檢測熒光素酶的相對(duì)活性。結(jié)果顯示，克隆的IFN-β基因啟動(dòng)子區(qū)和AP-1、IRF3、NF-κB和IRF7等轉(zhuǎn)錄元件具有顯著的活性，為研究兔出血癥病毒對(duì)宿主 IFN-β 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了有效的工具。

關(guān)鍵詞：家兔;兔出血癥病毒;IFN-β基因;啟動(dòng)子;熒光素酶;轉(zhuǎn)錄調(diào)控

中圖分類號(hào)： S858.291 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0078-03

干擾素是一類在機(jī)體內(nèi)廣泛存在的糖蛋白，可分為Ⅰ型（IFN-α、IFN-β和ω）和Ⅱ型（IFN-γ）干擾素[1-2]。干擾素-β （interferon-β，IFN-β）是由干擾素誘生劑（微生物和病毒等）刺激生物成纖維細(xì)胞和白細(xì)胞等產(chǎn)生的高活性多功能蛋白，具有多種生物活性，如抗病毒和免疫調(diào)節(jié)[1-4]等。近來的研究發(fā)現(xiàn)，多種病毒感染機(jī)體后能夠采取不同的措施顯著改變IFN-β的表達(dá)水平，從而逃避早期由IFN-β介導(dǎo)的抗病毒天然免疫反應(yīng)，如在豬偽狂犬病毒[5]、圓環(huán)病毒[6]和豬繁殖與呼吸綜合征病毒[7]的感染導(dǎo)致的疾病中。目前，對(duì)兔天然免疫系統(tǒng)了解很少，而且缺乏有效的檢測天然免疫分子的工具，這嚴(yán)重阻礙了病毒與兔宿主相互作用的深入研究。

筆者發(fā)現(xiàn)RHDV感染家兔能夠顯著下調(diào)兔體內(nèi)IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄水平，推測IFN-β基因水平的降低可能與該病毒的致病性相關(guān)。為了分析兔源IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，筆者所在課題組以家兔IFN-β為研究對(duì)象，通過制備一系列含有IFN-β基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄元件的重組體報(bào)告基因質(zhì)粒，采用雙報(bào)告基因系統(tǒng)鑒定IFN-β和轉(zhuǎn)錄元件的轉(zhuǎn)錄活性，為深入揭示啟動(dòng)子功能研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究RHDV調(diào)控IFN-β基因的表達(dá)提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

兔腎RK-13細(xì)胞株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。胎牛血清（FBS）和青鏈霉素溶液均購自美國GIBCO BRL公司。Lip3000脂質(zhì)體以及無血清培養(yǎng)基均購自美國英杰生命技術(shù)有限公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1-6his購自南京金斯瑞生物科技有限公司。pGL6-Basic螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體以及pTL-TK海參熒光素酶的內(nèi)參載體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RHDV攻毒 選用3月齡健康易感新西蘭兔，分攻毒組和對(duì)照組，每組5只。攻毒用毒種為兔出血癥病毒皖阜株肝毒，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。1 mL病毒（含量 105 LD50/mL，LD50為半數(shù)致死劑量）為攻毒劑量;等量的PBS（磷酸緩沖鹽溶液）作為對(duì)照。

1.2.2 IFN-β和病毒基因相對(duì)表達(dá)量的檢測 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)兔IFN-β基因啟動(dòng)子和RHDV基因的引物（表1），送上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。稱取 0.5 g 肝臟組織勻漿提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測。體系：SYBR Mix 10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL，共 20 μL。程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 IFN-β基因啟動(dòng)子的克隆 采用苯酚-氯仿法提取健康兔肝臟組織DNA，用超微量核酸分析儀檢測DNA的完整性、純度和濃度。以IFNb-F：5′-ATGATCAACAGGTGTATCCTTCAA-3′和IFNb-R：5′-TTAGAGGTAATCTATGAGCATGATGAT-3′為引物，以兔肝組織基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增兔IFN-β啟動(dòng)子區(qū)550 bp序列，體系：50 μL反應(yīng)體系含模板2 ng，上、下游引物（10 μmol）各1 μL，其他試劑按使用說明加入。程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段，與pMD18-T載體4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌，液體LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 IFN-β基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué) 利用NCBI中的Blast同源性比對(duì)兔和人IFN-β基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄上調(diào)區(qū)域PRD序列;通過Promoter 2.0 Prediction軟件分析 IFN-β 基因的啟動(dòng)子序列。

1.2.5 IFN-β啟動(dòng)子和順式作用元件報(bào)告基因重組體的構(gòu)建 以重組IFN-β啟動(dòng)子載體為模板，采用PCR方法克隆IFN-β基因啟動(dòng)子，雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切片段后連接到pGL6-Basic載體內(nèi)，構(gòu)建含IFN-β基因啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒pIFN-β-Luc并進(jìn)一步雙酶切和測序鑒定。另外，由公司合成了IRF-3和NF-κB結(jié)合位點(diǎn)序列，并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pIRF-3-Luc和pNF-κB-Luc。

1.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 在試驗(yàn)前24 h，將兔腎細(xì)胞RK-13接種于24孔板，待細(xì)胞達(dá)80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑lip3000按試劑說明書操作，轉(zhuǎn)染 RK-13 細(xì)胞。試驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)染pGL6-Basic載體組（對(duì)照組）和pGL6-IFN-β啟動(dòng)子等陽性載體組（試驗(yàn)組），每組3個(gè)重復(fù)，在24孔板中共轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒（pRL-TK）與報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞。

1.2.7 熒光素酶活性測定 在轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗3次。每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞20 min后，取25 μL裂解液加入96孔白板，然后按照雙熒光素酶檢測試劑盒上的說明書操作，在微孔板發(fā)光分析儀上檢測螢火蟲熒光素酶活性（pGL6）和海參熒光素酶活性（pRL-TK）。以螢火蟲和海參熒光素酶活性的比值即為相對(duì)熒光強(qiáng)度（relative luciferase activity，簡稱RAL）來指示試驗(yàn)各組的轉(zhuǎn)錄活性。計(jì)算各組熒光素酶的相對(duì)熒光強(qiáng)度RAL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法t檢驗(yàn)（α=0.05），數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織病毒和IFN-β mRNA水平測定

Real-time PCR檢測結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，兔出血癥病毒感染兔體肝臟組織中病毒基因相對(duì)表達(dá)量快速上升（圖1-A）;同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在病毒感染48 h以后IFN-β mRNA水平明顯降低（圖1-B）。

2.2 PCR擴(kuò)增IFN-β基因啟動(dòng)子序列

設(shè)計(jì)合成引物以兔肝組織提取的DNA為模板擴(kuò)增兔IFN-β基因5′UTR區(qū)，PCR擴(kuò)增出約550 bp特異性目的片段（圖2），將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，篩選陽性質(zhì)粒后經(jīng)雙酶切鑒定，最后進(jìn)一步進(jìn)行測序。測序表明，PCR擴(kuò)增兔IFN-β基因啟動(dòng)子序列長度為550 bp。

2.3 IFN-β基因啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

在線預(yù)測軟件分析表明，IFN-β基因啟動(dòng)子的ISRE包含4個(gè)轉(zhuǎn)錄上調(diào)區(qū)域（positive regulation domain，PRD）分別是Ⅰ～Ⅳ區(qū)（圖3-A）;此序列包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（+1）上游500 bp，具有典型的真核生物啟動(dòng)IFN-β基因啟動(dòng)子具有AP-1、IRF3、IRF7、NF-κB和TATA-box等典型的真核生物啟動(dòng)子元件[10]（圖3-A）。Blast序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增得到的IFN-β基因PRD與人源IFN-β基因啟動(dòng)子PRD序列相似性達(dá)98%以上（圖3-B）。

2.4 重組報(bào)告質(zhì)粒的的構(gòu)建和活性鑒定

以攜帶有IFN-β啟動(dòng)子序列的pMD18-T載體為模板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，經(jīng)雙酶切后與酶切的pGL6-Basic載體4 ℃連接，成功構(gòu)建啟動(dòng)子報(bào)告基因載體（pIFN-β-Luc），另外構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的熒光素酶報(bào)告基因載體（pIRF3-Luc和pNF-κB-Luc），經(jīng)測序正確。

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pIFN-β-Luc、pIRF3-Luc和 pNF-κB-Luc分別轉(zhuǎn)染至RK-13細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒（pRL-TK），通過檢測熒光素酶的相對(duì)活性來反映啟動(dòng)子和順式作用元件的活性，分別設(shè)陰性和陽性polyI：C處理組。熒光素酶活性分析表明，與轉(zhuǎn)染pGL6-Basic對(duì)照組相比，polyI：C能明顯誘導(dǎo)兔IFN-β基因啟動(dòng)子和順式作用元件IRF3和NF-κB相對(duì)熒光素酶活性（圖4）， 由此說明成功構(gòu)建了報(bào)告基因重組體。

3 討論

Ⅰ型干擾素是由病毒直接刺激被感染細(xì)胞所轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的抵御病毒感染的第一防線，為了逃避宿主的免疫反應(yīng)，人類乳頭狀病毒[5]、EB病毒[8]、埃博拉病毒[9]、丙肝病毒[10]等病毒均可通過其編碼的病毒蛋白抑制干擾素順式作用元件的活性從而抑制IFN-β的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，在兔體感染兔出血癥病毒后，會(huì)顯著下調(diào)IFN-β基因的表達(dá)量，這也許與兔出血癥病毒的致病性密切相關(guān)。然而目前對(duì)兔天然免疫系統(tǒng)的研究很少，缺乏有效的研究工具。

本研究成功獲得了IFN-β的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游550 bp啟動(dòng)子序列，將兔IFN-β啟動(dòng)子及IRF3等順式作用元件亞克隆進(jìn)pGL6-Basic中，通過熒光素酶的表達(dá)活性來間接表明兔IFN-β基因啟動(dòng)子和順式作用元件在RK13細(xì)胞中的活性，為研究IFN-β轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游啟動(dòng)子的生物學(xué)活性提供了依據(jù)。預(yù)測軟件分析出IFN-β的啟動(dòng)子含AP-1、IRF3、IRF7和NF-κB等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，暗示IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。同時(shí)，同源性分析發(fā)現(xiàn)兔IFN-β基因啟動(dòng)子與人源IFN-β基因啟動(dòng)子[11]序列高度相似，尤其是IRF3和NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，這進(jìn)一步說明本試驗(yàn)克隆序列的正確性。然而，具體哪些轉(zhuǎn)錄因子影響IFN-β的轉(zhuǎn)錄活性，還需要對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行序列的缺失等試驗(yàn)來證實(shí)[12]?？傊?，本研究構(gòu)建了IFN-β啟動(dòng)子和順式作用元件的重組報(bào)告質(zhì)粒，并分析了IFN-β啟動(dòng)子區(qū)域含有的AP-1、IRF3、IRF7和NF-κB等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，為研究IFN-β轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及其啟動(dòng)子功能提供了有效工具，也為進(jìn)一步探究兔出血癥病毒的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2019-09-19

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31702274）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào)：CARS-43-C-1）。

作者簡介：陳萌萌（1987—），女，江蘇連云港人，博士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。E-mail：moonchen2010@yeah.net。

通信作者：王 芳，博士，研究員，主要從事畜禽疫病防控及免疫機(jī)理研究。E-mail：rwangfang@126.com。