一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定雷公藤提取物中6種成分含量

吳 玨 ，劉志宏 ，林 兵 ，張敏新 ，林莉莉 ，周桂芝 ，宋洪濤

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院，福建 福州 350025）

雷 公 藤 （Tripterygium wilfordii Hook.f.） 為 衛(wèi) 矛科雷公藤屬植物，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、清熱解毒等功效，并具有較強(qiáng)的抗炎和免疫抑制等藥理活性。在臨床上，雷公藤主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征等自身免疫性疾病，療效顯著［1-2］，但其成分復(fù)雜，許多有效成分亦是毒性成分，導(dǎo)致不良反應(yīng)多發(fā)且嚴(yán)重程度讓患者難以忍受［3-4］，極大程度限制其臨床應(yīng)用。目前，雷公藤未載入《中國(guó)藥典》，質(zhì)量控制方法不統(tǒng)一，文獻(xiàn)中多以單一成分作為指標(biāo)報(bào)道，如采用HPLC法測(cè)定雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內(nèi)酯甲的含量［5-10］。然而僅測(cè)定雷公藤中單一成分的含量，并不能全面反應(yīng)質(zhì)量，導(dǎo)致各廠家所生產(chǎn)的雷公藤制劑的藥效和毒性存在差異［11］。本研究以雷公藤甲素為內(nèi)參物，建立自制雷公藤提取物中6種有效成分雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲含量同時(shí)測(cè)定的方法，并對(duì)外標(biāo)法和校正因子法的實(shí)測(cè)值和計(jì)算值進(jìn)行差異分析，探討一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）在雷公藤各指標(biāo)成分含量測(cè)定中的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試藥 雷公藤提取物（自制，批號(hào)171227、180326、180708）；雷公藤甲素（含量 99.8%，批號(hào)：111567-201404）、雷公藤內(nèi)酯酮（含量98.3%，批號(hào)：111972-201501）、雷公藤紅素（含量 97.0%，批號(hào)：111946-201501）、雷公藤內(nèi)酯甲（含量98.1%，批號(hào)：111597-200505）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；雷酚內(nèi)酯（含量98.9%，批號(hào)：CHB170704）購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司；雷公藤次堿（含量98.0%，批號(hào)：16122331）購(gòu)自上海同田生物科技有限公司；乙腈、甲酸（色譜純）購(gòu)自上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；AL204萬分之一天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；十萬分之一電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；KQ800KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲清洗公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量方法的建立

2.1.1 色譜條件 使用Shiseido-CAPCELL PAK CR 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），進(jìn)行梯度洗脫（見表1），檢測(cè)波長(zhǎng)為 218 nm，柱溫為 35℃，流速為 1.0 mL／min，進(jìn)樣量為 20 μL。分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，各成分分離度良好，溶劑無干擾。

表1 梯度洗脫時(shí)間表

2.1.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱定0.33 mg雷公藤甲素對(duì)照品、2.38 mg雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)照品、17.80 mg雷酚內(nèi)酯對(duì)照品、21.48 mg雷公藤次堿對(duì)照品、1.24 mg雷公藤紅素對(duì)照品、5.66 mg雷公藤內(nèi)酯甲，置于25 mL量瓶中，加入少量無水乙醇超聲溶解，再用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。②供試品溶液的制備：精密稱取100 mg自制雷公藤提取物置于10 mL量瓶中，加入少量無水乙醇超聲溶解，再用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取一系列混合對(duì)照品溶液各10 μL進(jìn)樣，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。記錄相應(yīng)的色譜峰峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明各對(duì)照品在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 雷公藤提取物各指標(biāo)成分的線性方程

2.1.4 精密度考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰峰面積，計(jì)算RSD分別為 0.23%、0.31%、0.79%、0.66%、0.09%、0.14%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性考察 取同一批次自制雷公藤提取物按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、12、24 h注入液相色譜儀，記錄各組分色譜峰峰面積。結(jié)果顯示雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲峰面積RSD值分別為1.51%、1.33%、2.21%、1.24%、1.33%、1.31%，說明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性考察 取同一批次自制雷公藤提取物按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定分析，記錄雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的峰面積，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RSD。結(jié)果測(cè)得上述各成分峰面積RSD值分別為1.59%、1.80%、1.41%、2.99%、2.91%、1.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取自制雷公藤提取物6份，每份精密稱取100.0 mg，置圓底燒瓶中，分別精密加入含有與樣品等量的雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收率試驗(yàn)供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算溶液中對(duì)照品量和各成分加樣回收率。結(jié)果表明各待測(cè)成分的平均加樣回收率分別為（101.21±1.33）%、（102.49±1.21）%、（98.74 ±3.28）%、（99.10±2.31）%、（100.40±3.40）%、（101.40±1.80）%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確性較好。

2.2 相對(duì)校正因子的計(jì)算 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液分別使用不同進(jìn)樣體積進(jìn)樣并記錄峰面積， 按公式 fk／s＝fk／fs＝（Wk／Ak） ／（Ws／As）（式中Wk為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，Ak為內(nèi)參物峰面積，Ws為其他對(duì)照成分質(zhì)量濃度，As為其他對(duì)照成分峰面積），以雷公藤甲素為內(nèi)參物（k）計(jì)算各進(jìn)樣體積下其他5種成分的相對(duì)校正因子fk／s，取其平均值計(jì)為該成分對(duì)雷公藤甲素的相對(duì)校正因子fk／s，結(jié)果見表3。

表3 各成分的相對(duì)校正因子fk／s值

2.3 雷公藤提取物的含量測(cè)定 取 3批自制雷公藤提取物，分別采用外標(biāo)法和QAMS法測(cè)定雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的含量，結(jié)果見表4，對(duì)兩法所測(cè)得的各成分含量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 相對(duì)校正因子耐用性考察

2.4.1 不同儀器和色譜柱的影響及各成分峰定位采用Angilent 1200型高效液相色譜儀、島津LC-20AD型高效液相色譜儀和Shiseido-CAPCELL PAK CR 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱對(duì)同一批次自制雷公藤提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)校正因子fk／s和相對(duì)保留時(shí)間tR，結(jié)果表明不同品牌儀器和色譜柱對(duì)雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的fk／s無顯著影響，結(jié)果見表5；不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果見表6。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

表5 不同儀器和色譜柱測(cè)得的fk／s

表6 不同儀器和色譜柱測(cè)得的tR

2.4.2 不同柱溫的影響 分別選取30、35、40℃對(duì)同一批次自制雷公藤提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)校正因子fk／s和相對(duì)保留時(shí)間tR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同柱溫對(duì)雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的fk／s無顯著影響，結(jié)果見表7；不同色譜柱溫度測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果見表8。

表7 不同柱溫對(duì)fk／s的影響

表8 不同柱溫對(duì)tR的影響

3 討 論

本研究建立了QAMS法同時(shí)測(cè)定自制雷公藤提取物中6種有效成分雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚內(nèi)酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯甲的含量，與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異，fk／s及tR均具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

選擇出峰時(shí)間較早的雷公藤甲素為內(nèi)參物，其藥效明確，穩(wěn)定性好，且文獻(xiàn)中所報(bào)道雷公藤藥材及制劑的質(zhì)量控制多選擇雷公藤甲素為單一指標(biāo)成分，可據(jù)此對(duì)其他成分進(jìn)行校正。

本研究考察不同色譜柱和柱溫對(duì)6種成分之間fk／s及tR的影響，結(jié)果無顯著性差異，并且分離度良好，6種成分對(duì)溫度具有一定的耐受性，色譜峰出峰先后順序無變化，參照相對(duì)保留值并結(jié)合光譜圖即可準(zhǔn)確、快速定位色譜峰。

單一成分的內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)難以控制復(fù)雜多樣的中藥及其制劑，而多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法對(duì)對(duì)照品的需求量較大，指紋圖譜雖然可以比較全面地反映中藥的整體性，但其模糊性的特點(diǎn)使真實(shí)準(zhǔn)確的質(zhì)量評(píng)價(jià)存在一定困難，故本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法可為雷公藤藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供參考。