烯醇化酶在模式生物中的功能研究進(jìn)展

黃宇菲

（清華大學(xué)附屬中學(xué)，北京 100084）

糖酵解是指在無氧條件下，葡萄糖進(jìn)行分解并轉(zhuǎn)化為丙酮酸的過程。烯醇化酶（Enolase，ENO，2-phospho-D-glycerate hydrolyase）作為糖酵解過程中的一個(gè)限速酶，催化2-磷酸-D-甘油酸（2-PGA）與高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的相互轉(zhuǎn)化，控制糖分分解進(jìn)行的速率，是糖酵解過程中唯一的脫水步驟。

在脊椎動(dòng)物中，烯醇化酶有三種同工酶，分別是α-ENO、β-ENO和γ-ENO，定位于不同位點(diǎn)的烯醇化酶有不同的功能。α-ENO由基因ENO1進(jìn)行編碼，ENO1是一種具有多功能的糖酵解酶，它不僅可調(diào)控生物體的生長、發(fā)育與繁殖，還可參與細(xì)胞應(yīng)激，對癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移存在影響。ENO1可與c-myc（myc癌基因家族中的重要基因）的啟動(dòng)子結(jié)合，起到抑制腫瘤生長的作用。同時(shí)也有研究表明，ENO1在擬南芥植株根系及角果中表達(dá)量很高，而在莖及葉中表達(dá)量相對較低。

糖酵解過程中酶對植物的生長發(fā)育起到不可或缺的作用。近幾年來，ENO2在模式植物中也有諸多研究。ENO2突變?nèi)笔w的植株內(nèi)部細(xì)胞縮小，并有嚴(yán)重的細(xì)胞分化缺陷，導(dǎo)致植株木質(zhì)化受限，從表型來看，ENO2缺失的植株主要表現(xiàn)為葉發(fā)黃且小、蓮座葉少、根短、主莖短、花粉發(fā)育不正常等。水稻與擬南芥的調(diào)控機(jī)理很相似，ENO2在水稻中通過調(diào)控RFT1基因的表達(dá)，控制水稻的抽穗期，在長日照的條件下，過表達(dá)ENO2的水稻植株抽穗期將推遲。

糖酵解作為生命活動(dòng)能量的主要來源，承擔(dān)著許多重要的角色。ENO2作為調(diào)控基因，參與弓形蟲細(xì)胞內(nèi)繁殖的過程，現(xiàn)已有研究成功克隆出弓形蟲內(nèi)的ENO2，為相關(guān)疫苗及診斷提供了線索。在日本血吸蟲中同樣也發(fā)現(xiàn)了烯醇化酶的表達(dá)，并有相關(guān)研究對其進(jìn)行了克隆、定位及生物學(xué)初步研究。研究探索烯醇化酶在豬帶絳蟲中的生物學(xué)功能，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所克隆的ENO具有特異結(jié)合性及酶活力，由此據(jù)此推測豬帶絳蟲的ENO可能在寄生蟲入侵宿主過程中起到作用。

本綜述將就如上幾個(gè)方面，對近年來ENO在模式生物內(nèi)的研究展開介紹與總結(jié)。其中將著重介紹ENO2在幾種重要模式植物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制、相關(guān)功能及研究進(jìn)展。

1 烯醇化酶在擬南芥中的功能作用

烯醇化酶有三個(gè)同工酶，分別為ENO1、ENO2以及ENO3，它們在氨基酸水平上具有56-68%的相似性。在擬南芥中，只有ENO1、ENO2表達(dá)的烯醇化酶具有活性。ENO1的表達(dá)位置在質(zhì)體，ENO2主要是在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中發(fā)揮作用，ENO2是LOS2位點(diǎn)編碼的一種蛋白。近幾年來，關(guān)于烯醇化酶在植物中表達(dá)及其功能的研究越來越多。烯醇化酶不僅在細(xì)胞糖酵解過程中起到限速作用，在植物生長發(fā)育過程中也起到影響，對于各種激素及環(huán)境脅迫也可做出響應(yīng)，ENO2的表達(dá)量最多，起主要的催化作用。

1.1 烯醇化酶2對擬南芥生長發(fā)育的功能作用

野生型和ENO2突變體植株在幼苗時(shí)期生長發(fā)育無明顯差異，在萌發(fā)后8～10d突變體植株出現(xiàn)明顯發(fā)育缺陷，主要特征為ENO2突變體莖直徑嚴(yán)重減小，下胚軸直徑明顯減小，葉子尺寸減小，植株葉面和表皮呈萎黃、網(wǎng)狀化狀態(tài)?；ê脱枯^小，且花不具有發(fā)育功能，花藥嚴(yán)重受損，角果形態(tài)小，果中沒有種子。通過顯微鏡可觀察到植株表皮下胚軸細(xì)胞直徑明顯縮小、葉表皮路面細(xì)胞尺寸、毛狀體及基底細(xì)胞大小減小，血管組織成分有嚴(yán)重缺陷。通過研究擬南芥中芥子酸蘋果酸酯及苯丙酸木質(zhì)素的含量，發(fā)現(xiàn)芥子酸蘋果酸酯含量顯著降低，得知烯醇化酶的活性影響芥子酸蘋果酸酯及木質(zhì)素的表達(dá)量，從而對植物體的正常生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

ENO2還參與植物生長素的分泌過程。研究培養(yǎng)擬南芥的生長素突變體，并將植株與ENO2突變體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三種幼苗根部的生長均受到抑制，由此表明ENO2可能會(huì)在植物生長素的分泌過程中發(fā)揮作用，并使植株根部的生長發(fā)育產(chǎn)生缺陷。對擬南芥植株體內(nèi)的烯醇化酶進(jìn)行反義抑制，降低其95%的活性，抑制酶活性后丙酮酸含量未減少，2-磷酸甘油酸酯的含量基本上保持不變，但植株內(nèi)部游離氨基酸的含量升高，磷酸烯醇式丙酮酸鹽的含量顯著降低，因而抑制植株葉面的代謝速率。實(shí)驗(yàn)說明ENO2的表達(dá)會(huì)降低植物進(jìn)行呼吸作用的速率，影響植株進(jìn)行次級代謝。植株的生理功能雖然沒有產(chǎn)生大的改變，但生長發(fā)育過程中受到一定的限制。

1.2 烯醇化酶2對擬南芥響應(yīng)脅迫的功能作用

施加一定量濃度的ABA后，低濃度的鹽溶液對擬南芥的生長發(fā)育并未產(chǎn)生影響，說明可以相應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制。使用300mmol/L的Nacl溶液對擬南芥進(jìn)行鹽脅迫，并通過RT-qPCR分析擬南芥植株中ENO2的轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，擬南芥的ENO2T-DNA插入突變體對鹽脅迫十分敏感，經(jīng)脅迫后的擬南芥體內(nèi)ENO2轉(zhuǎn)錄水平迅速升高。在鹽處理后，突變體擬南芥更易死亡，實(shí)驗(yàn)闡明ENO2對鹽的抗性機(jī)制，反應(yīng)了ENO2基因可響應(yīng)高鹽脅迫的功能特點(diǎn)，擬南芥ENO2基因可響應(yīng)低溫脅迫，AtENO2基因通過負(fù)調(diào)控影響STZ/ZAT10的表達(dá)，增強(qiáng)擬南芥植株的耐寒性。

另一方面，重力的改變可影響植物體內(nèi)部的代謝反應(yīng)。將擬南芥的愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于超重力環(huán)境下模擬失重，發(fā)現(xiàn)愈傷組織細(xì)胞中烯醇化酶的磷酸化程度顯著降低。烯醇化酶一般通過脫磷酸作用進(jìn)行表達(dá)，磷酸化程度的降低代表其活性在超重力處理下顯著提高，說明ENO2可對超重力環(huán)境的改變做出應(yīng)答反應(yīng)。

2 烯醇化酶在協(xié)助病原生物侵染宿主的研究進(jìn)展

2.1 烯醇化酶在弓形蟲中的研究進(jìn)展

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種可廣泛寄生在動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)部的原蟲，人和動(dòng)物被侵染后易患弓形蟲病。弓形蟲病在全世界感染普遍，感染后可致使人體免疫力下降，引起腦部、眼部等諸多部位病癥。烯醇化酶不僅在動(dòng)植物體內(nèi)糖酵解過程中起到限速作用，更參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、分化、凋亡等過程，核酸序列和氨基酸序列具有高度的保守性，它們以階段特異性的方式差異表達(dá)，同時(shí)在酶學(xué)動(dòng)力學(xué)方面還是具有一定的差異。弓形蟲中烯醇化酶enolase1（TgENO1）存在于緩殖子階段，enolase2（TgENO2）存在速殖子階段，TgENO1和TgENO2均已定位于寄生細(xì)胞核，并受到不同熱應(yīng)激啟動(dòng)子元件的調(diào)控。弓形蟲烯醇化酶在寄生蟲發(fā)育階段具有重要的核功能。

近來發(fā)現(xiàn)烯醇化酶也能定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核表面，有的能分泌到細(xì)胞外。David等發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲烯醇化酶能夠特異性的定位在胞核中，弓形蟲胞內(nèi)發(fā)育增殖的早期高效表達(dá)，核質(zhì)染色深且致密，當(dāng)發(fā)育到成熟階段，烯醇化酶的表達(dá)水平開始下降，核質(zhì)染色變淺，表明該酶的表達(dá)量與細(xì)胞核的活躍程度具有緊密聯(lián)系，由此推測烯醇化酶在蟲體發(fā)育增殖過程中具有基因調(diào)控作用。

烯醇化酶在病原體生物表面被發(fā)現(xiàn)，證實(shí)了烯醇化酶在病原生物侵染寄主過程中起到重要作用。在脊椎動(dòng)物中，病原體表面的烯醇化酶可與動(dòng)物細(xì)胞膜上的血纖維溶酶原相結(jié)合，操控細(xì)胞的溶遷系統(tǒng)，進(jìn)行侵染、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。

2.2 烯醇化酶在絳蟲中的研究進(jìn)展

不同生長階段的絳蟲使用熒光定量PCR技術(shù)檢測烯醇化酶基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)烯醇化酶在蟲體的不同發(fā)育階段mRNA含量有顯著差異，基因的表達(dá)量與蟲體生命活動(dòng)的旺盛程度呈正相關(guān)，這說明了烯醇化酶的含量會(huì)影響到絳蟲蟲體能量的供應(yīng)，從而影響其生理活動(dòng)。寄生蟲的烯醇化酶具有較強(qiáng)的免疫原性，對絳蟲經(jīng)行免疫性特異分析，發(fā)現(xiàn)絳蟲體內(nèi)的烯醇化酶可以在侵入人體后對宿主的免疫應(yīng)答產(chǎn)生刺激。烯醇化酶還可以在寄生侵入過程中與寄主的胞質(zhì)素及細(xì)胞壁相結(jié)合，說明烯醇化酶在絳蟲入侵宿主的生命活動(dòng)中起到重要作用。

2.3 烯醇化酶在小鼠中的研究進(jìn)展

腦部及肌肉是小鼠體內(nèi)最活躍的部位，當(dāng)這兩個(gè)部位處于病理狀態(tài)時(shí)，α-烯醇化酶會(huì)適應(yīng)性地調(diào)節(jié)細(xì)胞的產(chǎn)能過程，以滿足細(xì)胞在不同狀態(tài)下的需求。當(dāng)心肌肌肉供能不足時(shí)，小鼠機(jī)體調(diào)動(dòng)肌糖原，提高糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的效率，增加糖酵解以維持機(jī)體的正常生理活動(dòng)，這時(shí)α-烯醇化酶的表達(dá)量會(huì)有所升高。Bryer等研究證實(shí)，在肌肉組織重塑過程中，ENOl是作為主要的纖溶酶原受體，在心肌創(chuàng)傷后愈合以及心肌梗塞時(shí)，包括ENOl在內(nèi)的纖溶過程在心肌組織修復(fù)和再生過程中發(fā)揮了要調(diào)控作用。另外，ENO1可以通過影響小鼠體內(nèi)糖酵解及三羧酸循環(huán)等步驟，影響ATP的合成，這對腫瘤的形成和發(fā)育是非常重要的。在腫瘤形成的早期，ENO1發(fā)揮抑制腫瘤形成的功能，在癌癥發(fā)展期間，腫瘤細(xì)胞表面ENO1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的侵襲。

寒冷的環(huán)境可以改變生物體內(nèi)的穩(wěn)定狀態(tài)。在低溫環(huán)境下，小鼠肝臟活動(dòng)增強(qiáng)，通過增加產(chǎn)熱來抵御寒冷，心臟功能則暫時(shí)減退。對小鼠進(jìn)行冷應(yīng)激后，發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激組小鼠肝臟內(nèi)ENO1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比顯著提高，心臟內(nèi)則顯著降低。說明在冷應(yīng)激時(shí)，小鼠機(jī)體調(diào)節(jié)ENO1的表達(dá)量，提高肝臟代謝，降低心臟活動(dòng)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體平衡。

3 結(jié)語

大量的研究表明，烯醇化酶在不同模式生物中都有表達(dá)，如：擬南芥、果蠅、小鼠、線蟲等。烯醇化酶在不同的模式生物中都起著重要的作用，其中ENO2在擬南芥中主要通過糖酵解途徑影響其生理狀態(tài)，缺乏ENO2的植株通常呈現(xiàn)發(fā)育不良的表型，繁殖也會(huì)受到一定的影響。ENO1對于腫瘤的發(fā)展過程具有抑制和促進(jìn)的雙重作用。在腫瘤生長早期，ENO1可抑制腫瘤侵襲，而在腫瘤發(fā)展過程中，ENO1可加快腫瘤的生長擴(kuò)散。在病原生物表面的烯醇化酶可以調(diào)控溶纖系統(tǒng)，幫助寄生生物入侵和感染。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)絳蟲體內(nèi)的烯醇化酶可以對宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激。說明烯醇化酶具有很好的疫苗應(yīng)用前景，但對于烯醇化酶調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。