高通量測序分析玉米秸稈與牛糞聯(lián)合發(fā)酵階段微生物多樣性變化

王旭輝，徐鑫，寶哲，王卉，葉凱，李冠*，鄧宇

1(新疆大學 生命科學與技術(shù)學院，新疆 烏魯木齊，830046)2(新疆農(nóng)業(yè)科學院 生物質(zhì)能源研究所，新疆 烏魯木齊，830091)3(新疆農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所，新疆 烏魯木齊，830091)4(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護總站，北京，100125) 5(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學研究所，四川 成都，610041)

我國具有豐富的生物質(zhì)資源，包括農(nóng)業(yè)、林業(yè)等產(chǎn)業(yè)的殘留物及其副產(chǎn)品，工業(yè)及市政中可生物降解的廢棄物等[1-2]。農(nóng)業(yè)廢棄物占整個生物質(zhì)能源的21%，其中主要有秸稈等纖維素生物質(zhì)，畜禽糞便以及水果蔬菜在貯存、運輸、加工中產(chǎn)生的廢棄物[3-6]。這些生物質(zhì)資源富含有機物，可用于生產(chǎn)沼氣、還田施肥、飼料加工等[7-8]。然而這些資源并沒有得到有效利用，大部分的農(nóng)作物秸稈被直接燃燒、丟棄，造成嚴重的大氣污染和資源浪費現(xiàn)象[9-10]。通過秸稈混合糞便的沼氣工程不但可以解決秸稈廢棄物的再利用問題，避免了燒荒帶來的環(huán)境問題和資源浪費，還能調(diào)節(jié)能源結(jié)構(gòu)、減少化石能源的消耗，找到了解決清潔能源發(fā)展的新突破口，促進了種、養(yǎng)殖業(yè)的協(xié)調(diào)發(fā)展和我國生物質(zhì)資源的循環(huán)利用，對實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[11-14]。

沼氣工程是畜禽養(yǎng)殖場糞便秸稈廢棄物污染治理的最主要解決辦法[15-17]。國內(nèi)外相繼開展了糞便與秸稈聯(lián)合發(fā)酵的研究，MICHAL[18]認為玉米秸稈和糞便的協(xié)同作用可以提高厭氧發(fā)酵能力，增加沼氣產(chǎn)量。李軼冰[19]等研究了溫度對玉米秸稈和糞便混合發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)溫度與發(fā)酵速率和累積產(chǎn)氣量呈正相關(guān)。MARCIN[20]等研究了經(jīng)預處理后的秸稈與牛糞聯(lián)合發(fā)酵，相比于單牛糞原料發(fā)酵沼氣產(chǎn)率每天增加速率為177mL/mgVS。LUO[21]等研究了牛糞與玉米秸稈混合發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)混合原料產(chǎn)氣速率和產(chǎn)沼氣總量明顯的高于單一原料。周莎[22]等研究發(fā)現(xiàn)，當雞糞與小麥秸稈的混合比例為1∶1時，甲烷的產(chǎn)氣量達到90.56mL/gVS。劉永[23]通過牛糞和水稻秸稈混合發(fā)酵的研究，發(fā)現(xiàn)當牛糞和水稻秸稈以1∶1混合時，最大產(chǎn)氣率可達到398mL/gVS。FENG[24]通過采用不同秸稈和雞糞混合進行聯(lián)合發(fā)酵，玉米秸稈與雞糞以3∶1比例混合后，共消化產(chǎn)氣效果最好，通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，共消化過程中的主要微生物為廣古菌、擬桿菌和厚壁菌。這些研究結(jié)果表明，通過多種方法利用糞便與秸稈聯(lián)合發(fā)酵提高沼氣發(fā)酵效率是沼氣工程的重要發(fā)展方向。

沼氣工程獲得高效產(chǎn)出，除了固定的發(fā)酵原料，高效的沼氣微生物種群也是沼氣池穩(wěn)定高效運行的關(guān)鍵[25-28]。沼氣發(fā)酵過程是一個極其復雜的過程，包括水解階段、產(chǎn)酸階段和產(chǎn)甲烷階段，在不同階段中微生物菌群結(jié)構(gòu)也不同，因此有必要采用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)深入研究發(fā)酵過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)[29-30]。高通量測序技術(shù)是目前應用最普遍的新一代測序技術(shù)。它在分析微生物的群落結(jié)構(gòu)時有著獨特的優(yōu)勢，能夠通過從環(huán)境樣本中直接獲取的總DNA進行文庫構(gòu)建并測序[31]，用16SrRNA基因的測序數(shù)據(jù)估計微生物群落的物種構(gòu)成，能更加真實地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復雜性和多樣性[32-35]。SONG等[36]對沼氣發(fā)酵過程中高通量測序的結(jié)果表明，微生物群體從乙酰梭菌產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)型甲烷菌和甲烷球菌?；魩浀萚37]對牛糞堆肥發(fā)酵過程添加益生菌劑，通過高通量測序表明變形菌門細菌顯著增加，說明菌劑的添加可以顯著改變微生物種群群落。

本研究以玉米秸稈-牛糞沼氣發(fā)酵為對象，以沼氣產(chǎn)量為指標篩選高效微生物菌劑，利用高通量分子技術(shù)對添加高效微生物菌劑的不同發(fā)酵階段牛糞沼液細菌和真菌優(yōu)勢菌群多樣性變化規(guī)律進行分析，研究常溫條件下牛糞秸稈沼氣發(fā)酵細菌和真菌優(yōu)勢菌群多樣性變化規(guī)律，為新疆地區(qū)牛糞秸稈沼氣發(fā)酵菌劑的制備提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原材料與試劑

玉米秸稈來自新疆農(nóng)業(yè)科學院生物質(zhì)能源研究所瑪納斯試驗基地，風干、粉碎至粒徑≤4 mm，通過堿液對秸稈進行預處理。添加菌劑為實驗室自制秸稈專用微生物菌劑[38]，菌劑含有蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌。菌劑1中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比3∶2∶3∶2)，菌劑2中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比4∶3∶3∶2)，菌劑3中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比2∶1∶2∶1)。

1.2 主要實驗儀器和試驗裝置

UVmini-1240紫外可見分光光度計,日本島津公司；安捷倫GC 6890N,美國安捷倫公司。本試驗所用裝置主要由厭氧發(fā)酵裝置、集氣裝置及控溫裝置3 部分組成。發(fā)酵裝置采用500 mL的廣口瓶，用橡膠塞密封，再用玻璃管與乳膠管相連接，集氣裝置由乳膠管與集氣袋連接而成，恒溫水浴鍋控制廣口瓶中發(fā)酵料液溫度。

1.3 分析方法

水分測定采用105 ℃恒重法[39]；纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量采用范氏法測定[40-41]。沼氣中的CH4采用氣相色譜分析，設備配置為熱導檢測器，載氣為氮氣，流量設為30 mL/mm，進樣口、柱箱和檢測器溫度分別為120、100、120 ℃。

1.4 試驗設計

1.4.1 不同秸稈預處理效果比較

(1)空白處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入水浴鍋中，溫度為35 ℃，預處理48 h。

(2)對照處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入超聲波儀中，超聲30 min，放入水浴鍋中，溫度為35 ℃，預處理48 h。

(3)堿液處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入超聲波儀中，超聲30 min，加入5 g NaOH，放入水浴鍋進行堿預處理，溫度為35 ℃，預處理48 h。

1.4.2 不同微生物菌劑的產(chǎn)氣效果比較

(1)空白處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，最后加去離子水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

(2)微生物菌劑1處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑1，最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

(3)微生物菌劑2處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑2，最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

(4)微生物菌劑3處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發(fā)酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑3。最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，調(diào)整pH值至7。在發(fā)酵的每天上午10點記錄沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量。

1.4.3 微生物總DNA的提取與純化

選擇產(chǎn)氣效果最好的處理組進行不同發(fā)酵時期的高通量微生物測序。提取發(fā)酵0天，15天，30天樣品，使用糞便基因組提取試劑盒(天根DP328，中國)完成沼液樣品中細菌DNA 的提取。所有樣品的細菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域擴增用引物338F (5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行擴增。所有樣品的真菌ITS1區(qū)擴增用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和引物ITS2R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進行擴增。

使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒完成(天根DP209，中國)PCR產(chǎn)物純化，然后分別使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳判斷純化產(chǎn)物的濃度與純度。文庫的制備和上機測序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4.4 序列分析

基于Miseq Illumina平臺的測序得到不同發(fā)酵時期沼液樣品文庫，對原始數(shù)據(jù)進行過濾處理，得到優(yōu)化序列。使用QIIME[42]軟件中的UCLUST[43]對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋，用Mothur曲線可以分析所有樣品中細菌豐度[44]。Alpha多樣性可以用于分析單個樣本中微生物多樣性[45]。利用Shannon指數(shù)等方法完成多樣性分析指數(shù)分析，探索沼液發(fā)酵樣品中微生物

豐度與發(fā)酵時間的相關(guān)性[46-47]。

2 結(jié)果分析

2.1 堿液秸稈預處理效果比較

秸稈質(zhì)量的變化和纖維素含量的變化可以直接反映整個預處理過程中秸稈結(jié)構(gòu)的破壞及降解程度，預處理前后玉米秸稈主要成分變化見表1。預處理后固體的失重率在4.5%～28.2%之間，對照組的失重率最低，堿液處理的失重率最高。堿液處理對木質(zhì)素、半纖維素有降解作用，可以很好去除木質(zhì)素的包裹作用，提高纖維素含量，對提高沼氣產(chǎn)量有很好的促進作用。

表1 預處理前后玉米秸稈主要成分變化Table 1 Main contents variations of corn straw withpretreatment

2.2 不同微生物菌劑的產(chǎn)氣效果比較

沼氣發(fā)酵可以分析添加菌劑后的秸稈牛糞產(chǎn)沼氣潛力，整個厭氧消化周期為30 d，其沼氣日產(chǎn)率、累積產(chǎn)沼氣率、甲烷日產(chǎn)率及累積產(chǎn)甲烷率分別見圖1。

圖1 不同菌劑處理的沼氣和甲烷產(chǎn)量
Fig.1 Biogas and methane production from different microbial agents

沼氣日產(chǎn)率和甲烷日產(chǎn)率規(guī)律基本一致，均在2 d之內(nèi)開始產(chǎn)沼氣和甲烷，并在整個產(chǎn)氣周期內(nèi)出現(xiàn)4個產(chǎn)氣高峰。對照組的產(chǎn)氣率最低，添加菌劑1小組表現(xiàn)出較高的產(chǎn)沼氣及產(chǎn)甲烷率，最高沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達到了72和39 mL/g VS。

由累積產(chǎn)氣及累積產(chǎn)甲烷率圖中可以看出，沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率均在前15 d快速上升，并達到最終產(chǎn)氣及產(chǎn)甲烷率的85%左右。添加菌劑1小組獲得最高的累積產(chǎn)沼氣及產(chǎn)甲烷率，最高累積產(chǎn)沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達到了778和532 mL/g VS，而未添加菌劑的秸稈牛糞對照組的累積沼氣產(chǎn)率和累積甲烷產(chǎn)率分別為476、328 mL/g VS。添加微生物菌劑1，沼氣和甲烷產(chǎn)量提高效果最明顯，所以選擇產(chǎn)氣量最高的菌劑1處理進行發(fā)酵各個階段的高通量分析。

2.3 OTU 聚類分析

為了研究沼液的微生物組成，將3個不同時期采集的樣品分別記為A05、A06和A07，按照 97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU 聚類分析。

細菌OUT數(shù)量如圖2-a所示，其中A05組共得到941個OTU，A06組共得到1 093個OUT，A07組共得到1 137個OUT。分別將這3組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，A05與A06共有的OTU為715個，A05與A07共有的OTU為707個，A06與A07共有的OTU 為865個。A05中特有的OTU為77個，A06中特有的OTU 為47個，A07中特有的OTU為80個。這3組的OTU 數(shù)一共為1 502個，它們共有的OTU 數(shù)為583個。

圖2 沼液樣品中細菌(a)和真菌(b) OTU數(shù)量的韋恩圖
Fig.2 Venn diagram of Bacteria (a) and fungal (b) OTU
number based on 16S rRNA gene sequence in biogas slurry

真菌OUT數(shù)量如圖2-b所示，其中A05組共得到819個OTU，A06組共得到830個OUT，A07組共得到866個OUT。分別將這3組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，A05與A06共有的OTU為376個，A05與A07共有的OTU 為388個，A06與A07共有的OTU 為426個。A05中特有的OTU為286個，A06中特有的OTU 為241個，A07中特有的OTU為257個。這3組的OTU 數(shù)一共為1 620個，它們共有的OTU 數(shù)為257個。

結(jié)果顯示，在發(fā)酵初期真菌和細菌類群最少，隨著菌劑的加入和發(fā)酵的進行，微生物類群逐漸增多。不同發(fā)酵時期真菌特有的OUT數(shù)量要明顯大于細菌特有OUT數(shù)量，說明在不同發(fā)酵時期真菌微生物變化要大于細菌微生物變化。

2.4 微生物多樣性稀釋性曲線

使用Mothur軟件做稀疏性曲線分析，用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。如圖3所示，發(fā)酵過程中細菌的豐度要大于真菌，微生物豐富程度為A07>A06>A05。真菌的OUT圖的平緩性更好，能很好反映樣本中絕大多數(shù)微生物多樣性信息，更好的展現(xiàn)了微生物的多樣性。

圖3 3個樣品細菌(a)和真菌(b)的稀釋曲線
Fig.3 Bacterium (a) and fungal (b) changes rarefaction
curve of three samples

2.5 微生物多樣性變化

表2 不同發(fā)酵階段微生物多樣性指數(shù)分析Table 2 Analysis of the bacterium and fungus diversityindex of the different stages

從表2結(jié)果來看，A07樣品細菌和真菌的Chao1豐富度指數(shù)最高，說明物種數(shù)量最多。A05樣品細菌Shannon指數(shù)值最大，Simpson指數(shù)值最小，說明該樣品細菌多樣性最豐富。A07樣品真菌Shannon 指數(shù)值最大，Simpson指數(shù)值最小，說明該樣品真菌多樣性最豐富。Coverage數(shù)值均大于0.98，表明該指數(shù)本次測序結(jié)果較好的反映了樣本中細菌和真菌的真實情況。

2.6 沼氣發(fā)酵過程微生物變化

2.6.1 沼氣發(fā)酵過程細菌門與屬的變化

在不同發(fā)酵時期采集發(fā)酵沼液進行高通量測序，不同的細菌類群變化差異見圖4-a。擬桿菌門的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發(fā)酵初期33.8%增加到發(fā)酵末期的43.6%；厚壁菌門是第二大優(yōu)勢類群，與擬桿菌門的變化趨勢相反，厚壁菌門(Firmicutes)隨著沼氣發(fā)酵的進行，比例逐步減少，從發(fā)酵初期到發(fā)酵末期相對豐度由29.5%變?yōu)?2.3%；第三大類群為變形菌門(Proteobacteria)，豐度變化為16.8～22.5%，發(fā)酵過程中相對豐度的變化趨勢是不斷增加。同時，在發(fā)酵過程中涉及其他原核生物類群，如互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、螺旋體門(Spirochaetae)、放線菌門(Actinobacteria)等。

不同的細菌類群屬變化差異見圖4-b。擬桿菌門中vadinBC27_wastewater-sludge_group含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發(fā)酵初期29.6%增加到發(fā)酵末期的35.9%，它是一種優(yōu)勢產(chǎn)酸菌，該屬細菌不斷代謝發(fā)酵原料中殘留以及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸，此菌屬還能夠代謝難降解有機物?；ヰB(yǎng)菌門中的不能培養(yǎng)的Synergistaceae是第二大屬，該菌屬主要具有發(fā)酵氨基酸的功能，在去除沼氣發(fā)酵系統(tǒng)的中間代謝產(chǎn)物方面發(fā)揮重要作用，能發(fā)酵精氨酸、組氨酸和甘氨酸等氨基酸并產(chǎn)生甲酸、乙酸、丙酸、H2和NH3，也能降解吡啶二醇等難降解有機物，相對豐度由發(fā)酵初期12.3%降到到發(fā)酵末期的8.1%。變形菌門中的Pseudomonas是第三大屬，Pseudomonas是水解菌屬，可以降解原料中的纖維素成分，前期原料充足，Pseudomonas含量比較高，隨著發(fā)酵的進行，原料逐漸被利用，相對豐度由發(fā)酵初期9.8%降到到發(fā)酵末期的3.7%。

圖4 門(a)和屬(b)水平上前10名細菌的相對豐度
Fig.4 Relative abundance of the top bacteria at the
level of Phylum and Genus

2.6.2 沼氣發(fā)酵過程真菌門與屬變化

不同的真菌類群變化差異見圖5-a。子囊菌門(Ascomycota)的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發(fā)酵初期65.7%增加到發(fā)酵中期的84.7%，又降到發(fā)酵末期的66.8%；擔子菌門(Basidiomycota)是第二大優(yōu)勢類群，與子囊菌門的變化趨勢相反，擔子菌門隨著沼氣發(fā)酵的進行，比例先減少后增多，從發(fā)酵初期到發(fā)酵末期相對豐度由5.3%變?yōu)?.1%。同時，在發(fā)酵過程中涉及其他真核生物類群，如鞭毛菌門(Mortierellomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、單孢菌門(Monoblepharomycota)等。

不同的真菌類群屬變化差異見圖5-b。子囊菌門中塊菌屬(Tuber)含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，它是一種優(yōu)勢產(chǎn)糖菌，該屬細菌產(chǎn)生的糖類物質(zhì)可以為后續(xù)沼氣發(fā)酵提供原料，此菌屬豐度變化與沼氣產(chǎn)量相一致。在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發(fā)酵初期0.2%增加到發(fā)酵中期的51.7%，又降低到發(fā)酵末期的36.5%。子囊菌門中的枝氯霉屬(Ramichloridium)是第二大屬，該菌屬主要具有水解纖維素的功能，隨著發(fā)酵的進行，原料逐漸被利用，相對豐度不斷下降，由發(fā)酵初期11.6%降到到發(fā)酵末期的4.7%。

圖5 門(a)和屬(b)水平上前10名真菌的相對豐度
Fig.5 Relative abundance of the top fungus at the
level of Phylum and Genus

2.7 微生物多樣性聚類分析heatmap圖

從圖6可以看出，多樣性聚類分析A06和A07比較接近，而A05則與其他2個樣品差距較大，說明沼液發(fā)酵初期微生物的菌屬有很大變化，沼液發(fā)酵中后期微生物的菌屬變化不大。細菌前期主要是以假單胞菌、孢子菌主，發(fā)酵中期以擬桿菌為主，發(fā)酵后期為嗜角菌屬。真菌前期主要是以馬拉色菌、鏈格孢、短梗霉屬為主，發(fā)酵中后期以塊菌屬為主。

圖6 基于屬水平上的細菌(a)和真菌(b)聚類分析熱圖
Fig.6 Based on the genus level of Bacterial and
Fungus clustering analysis Heatmap

3 討論

在正常產(chǎn)氣的沼液中，存在著種群繁多的微生物，目前針對沼液中微生物分析主要采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)研究，但是微生物界約有99%的微生物是不能進行純培養(yǎng)的，會遺漏許多重要的沼液微生物學信息，因此無法來揭示沼液中微生物群落的全部生態(tài)信息。高通量測序技術(shù)作為一種無需微生物分離培養(yǎng)的快速檢測技術(shù)，能夠?qū)悠分械娜课⑸镞M行種類和豐度鑒定，分析添加菌劑對發(fā)酵過程的影響，對于提高沼氣工程發(fā)酵效果，乃至開發(fā)新型沼氣工程菌劑都具有重要的意義。

如圖4和圖5可知，在細菌門中擬桿菌門與變形菌門之間呈顯著的正相關(guān)性，與厚壁菌門之間呈極顯著的負相關(guān)性。發(fā)酵過程中厚壁菌門豐度不斷減少，這與滑留帥等[37]研究結(jié)果一致，本試驗與其不同的是中擬桿菌門豐度一直處于增加狀態(tài)。在沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中，可利用的有機質(zhì)原料不斷減少，導致厚壁菌門的代謝活動減弱，相對豐度也相應減少。厚壁菌門的相對豐度變化趨勢與沼氣發(fā)酵系統(tǒng)的原料變化基本一致，表明這類群的代謝活動對沼氣發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣效率影響大。

微生物自制菌劑添加后，激活了細菌假單胞菌屬(Pseudomonas)和真菌中塊菌屬和枝氯霉屬的水解能力，大量纖維素被降解，為產(chǎn)乙酸菌提供了糖類物質(zhì)，vadinBC27_wastewater-sludge_group和Synergistaceae大量生長，為產(chǎn)甲烷菌提供乙酸和甲酸等物質(zhì)，增加了沼氣發(fā)酵系統(tǒng)沼氣的產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本試驗研究了不同微生物菌劑添加對牛糞-玉米秸稈聯(lián)合沼氣發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示微生物菌劑配比為蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質(zhì)量比3∶2∶3∶2)時產(chǎn)氣效果最好，在此條件下最高沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達到了72、39 mL/g VS，最高累積產(chǎn)沼氣產(chǎn)率和甲烷產(chǎn)率分別達到了778、532 mL/g VS。

對添加最優(yōu)微生物菌劑配比的沼氣發(fā)酵過程中的微生物多樣性進行高通量測序，測序結(jié)果表明，細菌中的擬桿菌門的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發(fā)酵初期33.8%增加到發(fā)酵末期的43.6%；真菌中子囊菌門的數(shù)量最為豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發(fā)酵初期65.7%增加到發(fā)酵中期的84.7%，又降到發(fā)酵末期的66.8%。

高通測序結(jié)果顯示細菌擬桿菌門中vadinBC27_wastewater-sludge_group含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發(fā)酵初期29.6%增加到發(fā)酵末期的35.9%?；ヰB(yǎng)菌門中的不能培養(yǎng)的Synergistaceae是第2大屬，該菌屬主要具有發(fā)酵氨基酸的功能，相對豐度由發(fā)酵初期12.3%降到到發(fā)酵末期的8.1%。變形菌門中的Pseudomonas是第3大屬，Pseudomonas是水解菌屬，相對豐度由發(fā)酵初期9.8%降到到發(fā)酵末期的3.7%。真菌子囊菌門中塊菌屬含量最豐富，是最主要的優(yōu)勢類群，它是一種優(yōu)勢產(chǎn)糖菌，在沼氣發(fā)酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發(fā)酵初期0.2%增加到發(fā)酵中期的51.7%，又降低到發(fā)酵末期的36.5%。子囊菌門中的枝氯霉屬是第2大屬，該菌屬主要具有水解纖維素的功能，隨著發(fā)酵的進行，原料逐漸被利用，相對豐度不斷下降，由發(fā)酵初期11.6%降到到發(fā)酵末期的4.7%。

本試驗通過研究牛糞-玉米秸稈聯(lián)合沼氣發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，揭示高產(chǎn)沼氣發(fā)酵池的微生物群落結(jié)構(gòu)特征，為牛糞-玉米秸稈聯(lián)合沼氣發(fā)酵菌劑制備提供理論依據(jù)。