基于EST-SSR標(biāo)記的珠子參野生種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

楊維澤，左應(yīng)梅，張金渝*，楊天梅，楊紹兵，楊美權(quán)，鄧先能，許宗亮，陳秀花，李新華

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650223;2.貢山縣農(nóng)業(yè)局，云南 貢山 673500)

【研究意義】 珠子參又名珠兒參、鈕子七、扣子七，為五加科人參屬植物珠子參[PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng]或羽葉三七[PanaxjaponicusC.A.Mey.var.bipinnatifidus(Seem.)C.Y.Wu et K.M.Feng]的干燥根莖。生長(zhǎng)于海拔1800～3300 m的山谷闊葉林中；主要分布于中國(guó)的云南、四川、貴州以及陜西等省。具有補(bǔ)肺，養(yǎng)陰，活絡(luò)，止血的功效，是“痛舒膠囊”等中成藥的主要成份，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示, 珠子參有較廣泛的藥理作用，對(duì)心血管系統(tǒng)、血液及造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、血糖等均有療效。【前人研究進(jìn)展】 SSR標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、等位基因數(shù)量豐富、多態(tài)性高、對(duì)基因組覆蓋性好等優(yōu)點(diǎn)。已被廣泛運(yùn)用于農(nóng)作物玉米[1-2]、水稻[3-4]、大豆[5-6]等的遺傳多樣性研究。袁力行等[7]利用RAPD 、AFLP、SSR和RFLP4種分子標(biāo)記方法對(duì)玉米自交系遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了SSR標(biāo)記更適用于玉米遺傳多樣性的研究。但是傳統(tǒng)基因組SSR標(biāo)記引物開發(fā)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高。目前，利用大量迅速增長(zhǎng)的EST數(shù)據(jù)能高效、快捷地合成EST-SSR引物，已在高丹草[8]，臘梅[9]，三七[10]，丹參[11]等植物的遺傳多樣性分析上廣泛應(yīng)用，并取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以往對(duì)珠子參的研究主要集中于珠子參竹節(jié)參皂苷[12-14]、微量元素[15]、藥理藥效[16]、資源生態(tài)[17]及繁殖技術(shù)[18]等方面，利用分子標(biāo)記手段對(duì)珠子參進(jìn)行遺傳多樣性分析鮮見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 以云南主產(chǎn)區(qū)的19個(gè)珠子參野生居群的190個(gè)單株為實(shí)驗(yàn)材料，以人參、西洋參和三七3種同屬植物的EST序列設(shè)計(jì)引物，利用EST-SSR標(biāo)記，對(duì)珠子參不同地理居群進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳分化的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 為珠子參種質(zhì)資源的開發(fā)利用和合理保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所采自云南珠子參主產(chǎn)區(qū)滇西北地區(qū)麗江、寧蒗、香格里拉、怒江蘭坪等地，共采集到19個(gè)野生資源居群的190份材料(每個(gè)居群10株)。材料來源及地理信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 樣品總DNA提取參考鄒喻蘋等[19]CTAB法，略有改動(dòng)，在加CTAB前加入提取緩沖液(50 mmoL/L EDTA, 100 mL/L Tris-HCl, 750 mmoL/L NaCl)洗去次生代謝物和多糖。標(biāo)定DNA濃度為20 ng/μl，備用。

表1 實(shí)驗(yàn)材料來源Table 1 The localities of experiment materials

表2 利用人參屬EST序列設(shè)計(jì)的17對(duì)EST-SSR引物Table 2 The 17 EST-SSR primer pairs based on EST sequence of P. japonicus

P編號(hào)為楊成君等[20]設(shè)計(jì)引物，其余為作者自行設(shè)計(jì)。
Note: The primers number with P was designed by Yang Chengjun, et al[20]. The rest were designed by authors themselves.

1.2.2 引物篩選 利用NCBI等公共數(shù)據(jù)庫中公布的人參、三七及西洋參的EST序列，建立EST信息數(shù)據(jù)庫。利用SSR搜索軟件(SSRhunter 1.3)和引物設(shè)計(jì)軟件(Primer 5.0)設(shè)計(jì)珠子參EST-SSR引物，共設(shè)計(jì)了64對(duì)引物，所設(shè)計(jì)引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，通過引物篩選，從中篩選出17對(duì)條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物用于珠子參遺傳多樣性分析。引物序列見表2。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR在iCycler170-8720 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：2.5 μl PCR緩沖液10×PCR Buffer，2 μl MgCl2(25 mmol/L)，2 μldNTP(2.5 mmol/L) (Promegar公司)，0.4 UTaq酶(Promegar公司)，上下游引物各2 μl(33 ng/μl)(上海生工合成)，模板1 μl DNA(20 ng/μl)，11.5 μl ddH2O，加一滴石蠟油防止蒸發(fā)。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性溫度94 ℃，時(shí)間5 min；變性溫度94 ℃，時(shí)間45 s；退火溫度根據(jù)不同的引物而定，時(shí)間l min，72 ℃延伸1 min，36次循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃冰箱保存。

1.2.4 電泳檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物在200 V 恒壓下用5 %聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，電泳后參照Charters和 Wilkinson[21]的方法硝酸銀銀染顯色。用HP掃描儀掃描記錄。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用人工法讀帶，將凝膠電泳圖上清晰、可重復(fù)的條帶記為“1”，在同一位置無帶或不易分辨的記為“0”，建立“0”、“1”原始數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)需要在數(shù)據(jù)處理時(shí)把“0”、“1”矩陣變換為“A”、“B”矩陣。利用軟件POPGENE 1.32計(jì)算等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、居群內(nèi)基因多樣性、總基因多樣性、基因分化系數(shù)、遺傳距離和居群每代遷移數(shù)以及遺傳相似度。同時(shí)結(jié)合Treeview軟件進(jìn)行非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)聚類分析，構(gòu)建遺傳聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

17對(duì)引物在19個(gè)居群野生種質(zhì)間共檢測(cè)到等為基因數(shù)為346個(gè)基因位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為294個(gè)，平均每個(gè)引物檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為17.6個(gè)。物種層次，珠子參遺傳多樣性總體較為豐富，其等位基因數(shù)(A)為1.8555，有效等位基因數(shù)(Ae)為1.3208，Nei’s基因多樣性(H)為0.2023、Shannon指數(shù)(I)為0.3230、PPB為88.04 %。在居群水平，珠子參的遺傳多樣性普遍較低，等位基因數(shù)(A)為1.0954～1.2977，Nei’s基因多樣性(H)為0.1043～0.1387，Shannon指數(shù)(I)為0.0309～0.1077，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(PPB)為8.67 %～29.77 %。

表3 珠子參的遺傳變異Table 3 Genetic variation of P. japonicus

2.2 遺傳分化及遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)表4可知，總體上，珠子參居群間的遺傳多樣性要遠(yuǎn)高于居群內(nèi)的遺傳多樣性，表明遺傳變異主要來自于居群間。物種間的基因分化系數(shù)(Gst)達(dá)0.6357，表明有珠子參居群間的遺傳分化較高，珠子參的遺傳變異主要存在于不同居群間。根據(jù)群體間的基因流值(0.2866)小于1(Nm*<1)，說明有限的基因流是促使居群發(fā)生遺傳分化的主要原因。

在5個(gè)蘭坪居群中有46.83 %的分子變異存在于居群間,有53.17 %的變異存在于居群內(nèi)。在3個(gè)麗江居群有34.5 %的變異存在于居群內(nèi)，有65.5 %的分子變異存在于居群間，表明蘭坪與麗江居群間的遺傳分化較大，尤其是麗江居群間有較大分化，彼此間缺乏基因交流，同時(shí)也表明不同區(qū)域不同居群的遺傳差異較大。

2.3 遺傳關(guān)系

根據(jù)遺傳聚類圖分析(圖1)，19份珠子參野生居群被劃分為2個(gè)大類群，其中寧蒗永寧(CA)、香格里拉小中甸(CC)、香格里拉碧塔海(CF)居群聚為1組，其余居群聚為第2組，在第2大組中又分為2個(gè)組，其中文山老君山居群(CI)和蘭坪富和山2(CH)聚為一組，其余居群為另一組，該組材料來源于昆明、大理、怒江、麗江等地，聚類結(jié)果表明，珠子參的遺傳親緣關(guān)系與分布區(qū)域無太大關(guān)系，可能是居群間基因交流少的原因。

表4 珠子參的遺傳分化分析Table 4 Analysis of genetic differentiation among P. japonicus populations

表5 不同珠子參居群間的Nei′s遺傳距離/(對(duì)角線下方)和遺傳一致度/(對(duì)角線上方)Table 5 Nei’s genetic distance (below diagonal)and genetic identity (above diagonal) among P. Japonicus populations

珠子參各居群的遺傳一致度在0.8105～0.9779(表5)，蘭坪珠子參居群的遺傳一致度在0.8781～0.9175，并且并沒有完全聚在一起，麗江珠子參居群的遺傳一致度在0.8489～0.9154。同時(shí)也表明珠子參居群間遺傳分化較低。

圖1 17對(duì) EST-SSRs 引物對(duì)19個(gè)居群的珠子參材料的聚類圖Fig.1 Dendrogram of UPGMA for the 19 populations in P. japonicus based on 17 EST-SSRs markers

3 討 論

3.1 珠子參居群的遺傳多樣性

崔光芬[22]認(rèn)為種內(nèi)變異或遺傳多樣性越豐富，物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，進(jìn)化潛力就越大。通過對(duì)19個(gè)珠子參野生居群遺傳多樣性的EST-SSR研究發(fā)現(xiàn)，珠子參居群內(nèi)具有較為豐富的遺傳多樣性，這可能是與物種為了適應(yīng)復(fù)雜的自然條件和生態(tài)環(huán)境有關(guān)，即不同的自然條件和生態(tài)環(huán)境形成了珠子參多樣化的形態(tài)類型。同時(shí)，過度采挖以及生境破壞，造成不同居群間基因交流受阻從而減少了居群內(nèi)基因的雜合度。相對(duì)其他人參屬植物而言，珠子參具有較強(qiáng)的克隆繁殖能力，可以通過其根莖形成克隆居群，大大降低了其基因的雜合度，因此居群內(nèi)的遺傳多樣性較低。

3.2 珠子參居群的遺傳分化和親緣關(guān)系

根據(jù)珠子參與珠子參(羽葉)、珠子參(大葉)的遺傳距離和遺傳分化分析顯示，珠子參不同表型的遺傳距離總體較近，珠子參居群間的遺傳分化均較大，因此外形差異較大，但居群間的分子差異并不明顯。在木里、德欽以及其他地方野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)珠子參(羽葉)、珠子參(大葉)和珠子參同在一個(gè)居群內(nèi)，并且根莖相似均為念珠狀，甚至在貢山居群中會(huì)發(fā)現(xiàn)起表型為根部疙瘩形狀珠子參、珠子參、竹節(jié)形狀的珠子參均會(huì)同在一個(gè)居群內(nèi)生長(zhǎng)，甚至根莖的前半部分為竹節(jié)狀后部為念珠狀，因此我們認(rèn)為這幾個(gè)所謂的種或變種在遺傳上并不成立，而是同一物種在不同環(huán)境下的生態(tài)適應(yīng)或表型適應(yīng)。

根據(jù)珠子參的遺傳分化和遺傳距離分析顯示，珠子參居群間有限的基因流，是導(dǎo)致珠子參居群間的遺傳分化相對(duì)較大的主要原因。實(shí)際上，珠子參居群間由于地理隔絕或克隆繁殖的原因，相互間的基因交流較少，因此其居群間的分化較大。

4 結(jié) 論

通過對(duì)珠子參遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究，結(jié)果表明：首先，珠子參居群間和居群內(nèi)具有較為豐富的遺傳多樣性，其遺傳變異主要存在于居群間；其次，較強(qiáng)的克隆繁殖能力，生境破壞后的生境破碎化以及資源破壞致使珠子參的基因交流少，居群間遺傳分化大。再次，聚類分析顯示，不同表型間的珠子參遺傳變異不大，無法單獨(dú)從珠子參中劃分出來，因此幾個(gè)種可能是同一物種在不同環(huán)境下的不同表型適應(yīng)。