樺褐孔菌黃酮含量測(cè)定及抗氧化研究

林雪松，李秀格，崔鑫鑫，靳 微，李 敏*

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院·吉林吉林·132101）

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)，主要分布在西伯利亞、俄羅斯和遠(yuǎn)東地區(qū)、波蘭、北歐、中國(guó)大、小興安嶺和長(zhǎng)白山地區(qū)、黑龍江、日本北海道及北美北部等緯度在北緯 45°～50°的寒冷的地區(qū)[2]。又名白樺茸等，是一種生長(zhǎng)在樺樹上的藥用真菌[1]?，F(xiàn)代研究表明，樺褐孔菌中主要化學(xué)成分為三萜類、甾醇類和生物堿類化學(xué)成分[3]，具有抗癌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗真菌等多種生物活性[4～5]。迄今，有關(guān)樺褐孔菌的質(zhì)量研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)八個(gè)產(chǎn)地的樺褐孔菌進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定及抗氧化研究，為樺褐孔菌質(zhì)量研究提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步擴(kuò)大樺褐孔菌資源的開發(fā)，保證其及相應(yīng)制劑的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

樺褐孔菌樣品為實(shí)地采集或由相關(guān)單位提供，樣品信息如下S1-西藏林芝、S2-黑龍江黑河、S3-黑龍江牡丹江、S4-黑龍江伊春、S5-吉林長(zhǎng)白山、S6-吉林吉林、S7-俄羅斯西伯利亞、S8-日本北海道，留樣憑證存放于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室。

抗壞血酸 （維生素C，南京化學(xué)試劑有限公司）；DPPH （1，3-二苯基-2-三硝基苯肼）；KH2PO4；Na2HPO4；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（吉林生物制品檢驗(yàn)所）；無水乙醇；甲醇；5%亞硝酸；10%硝酸鋁；0.1mol/L氫氧化鈉 （以上試劑均為分析級(jí)）。

CP114電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；G-08A型高速中藥粉碎機(jī) （浙江瑞安市百信藥機(jī)器械廠）；TDL-40B離心機(jī) （東旺儀器設(shè)備有限公司）；DHG-9035A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海源長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠）；恒溫水浴鍋 (天津市泰斯特儀器有限公司，DK-98-II）；THC型數(shù)控超聲波提取器 （濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）；UV-2500紫外可見分光光度計(jì) （日本島津公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士布其有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蘆丁對(duì)照品溶液 (200μg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 分別置于 10 mL 比色管中， 各加60%乙醇至5 mL；加5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min后，加10%A1(NO3)3溶液 0.5mL，搖勻，再放置6min;加4%NaOH溶液4mL，搖勻放置10～20 min。在510 nm波長(zhǎng)處，以第1管溶液做空白分別測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

將樺褐孔菌烘干、粉碎，精密稱取50℃干燥至恒重的樺褐孔菌粉末1g，置于三角瓶中，加入50%乙醇100mL，超聲波調(diào)至 60℃條件下，超聲 15～20min，過濾，收集濾液，提取兩次，用50%乙醇定容，即得。

精密吸取黃酮提取液1.0mL置于10mL比色管中，按各加60%乙醇至5mL進(jìn)行操作，加5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置 6min；再加 10%Al(NO3)3溶液 0.5mL，搖勻放置6min；加4%NaOH溶液4mL，搖勻放置10～20 min。在510nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度。X=(A+0.0052）×10×100/(6.03×m×1000）

式中，X為樣品中總黃酮含量(以蘆丁計(jì))%；A為吸光度，m為樣品的質(zhì)量g。

1.2.3 方法學(xué)考察

加樣回收率 精密稱取S1、S2兩份樣品，各3份，分別將對(duì)照溶液 1.0、2.0、3.0mL 置于三角瓶中，按“1.2.2”提取及測(cè)定。

精密度 精密稱取S3樣品5份平行樣，置于三角瓶中，按“1.2.2”提取及測(cè)定。

穩(wěn)定性 選擇S6樣品進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，在0、15、30、45、60 min 測(cè)定其吸光度。

1.2.4 黃酮抗氧化能力測(cè)定

羥基自由基(－OH)的測(cè)定：向試管中加入1.00mL蒸餾水，F(xiàn)eSO4溶液2.00mL，水楊酸-乙醇1.50mL，最后加H2O2(0.03%)0.10mL啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混合，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)0。

向試管中加入樣品提取物溶液1.00mL，F(xiàn)eSO4溶液2.00mL，水楊酸-乙醇 1.50mL，最后加 H2O2（0.03%）0.10mL啟動(dòng)反應(yīng)，振蕩混合，水浴 37℃，保溫 30min，離心（3000r，10min），在波長(zhǎng)510nm下測(cè)量各自的吸光度值A(chǔ)S。

自由基清除率計(jì)算公式為：D=（A0-AS）/A0×100%。

式中，A0為空白管的吸光度，AS為加入自由基清除劑后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮測(cè)定結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，蘆丁含量與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，得到回歸方程為Y=6.3x-0.0052，相關(guān)系數(shù)為r=0.9992。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curves of rutin

2.1.2 加樣回收率考察

由表1結(jié)果可知，樣品回收率為98.58%～101.30%，均值為99.98%，RSD為1.34%，表明回收率良好，方法準(zhǔn)確度較高。

表1 加樣回收率考察Table 1 Sample recovery rate

2.1.3 精密度考察

由表2結(jié)果可知，RSD為1.94%，表明該方法精密度良好。

表2 精密度考察Table 2 Precsion experiment

2.1.4 穩(wěn)定性考察

由表3可知，吸光度值的RSD為1.64%，結(jié)果表明供試品在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性考察Table 3 Stability experiment

從回收率、精密度和穩(wěn)定性可看出，本實(shí)驗(yàn)加樣回收率、精密度及穩(wěn)定性均良好，方法可行。

2.1.5 黃酮的含量測(cè)定

不同產(chǎn)地樺褐孔菌總黃酮含量見表4。

表4 樺褐孔菌總黃酮含量Table 4 The total flavones of Inonotus obliquus

樺褐孔菌總黃酮含量方差分析結(jié)果見表5。

表5 樺褐孔菌總黃酮含量的方差分析Table 5 Yariance analysis of the total flavones in Inonotus obliquus

由表5可知P＜0.01，故在顯著性水平0.01下，不同產(chǎn)地樺褐孔菌中總黃酮含量存在差異顯著性。

表6 樺褐孔菌總黃酮含量的多重比較Table6 Multiplecomparisonsof thetotal flavonesinInonotusobliquus

由表6可以看出，產(chǎn)地S5樺褐孔菌總黃酮平均含量最高，與產(chǎn)地S2無顯著差異，顯著高于產(chǎn)地S4，且極顯著高于產(chǎn)地 S6、S8、S7、S1、S3；產(chǎn)地 S2 平均含量次高，與產(chǎn)地S4無顯著差異，且極顯著高于產(chǎn)地產(chǎn)地S6、S8、S7、S1、S3、S5；產(chǎn)地 S1 平均含量次低，與產(chǎn)地 S3 無顯著差異；產(chǎn)地S3樺褐孔菌總黃酮平均含量最低。

2.2 抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

表7 樺褐孔菌總黃酮對(duì)羥基自由基清除率Table 7 Radical free rate of the total flavones in Inonotus obliquus

表8 樺褐孔菌總黃酮對(duì)羥基自由基清除率的方差分析Table8 Yarianceanalysis of radical freerate of the total flavones in Inonotusobliquus

由上表可知P＜0.01，故在顯著性水平0.01下，不同產(chǎn)地樺褐孔菌中黃酮對(duì)羥基自由基清除能力存在差異顯著性。

表9 樺褐孔菌總黃酮對(duì)羥基自由基清除率多重比較Table9 Multiplecomparisons of radicalfreerate of the total flavonesin Inonotusobliquus

由表9可看出，產(chǎn)地S5樺褐孔菌中黃酮清除羥基自由基平均能力最好，與產(chǎn)地S7、S6、S4無顯著差異，顯著高于產(chǎn)地S2，且極顯著高于產(chǎn)地S8、S1、S3；產(chǎn)地S7平均能力次好，與產(chǎn)地S6、S4、S2無顯著差異，極顯著高于產(chǎn)地S8、S1、S3；產(chǎn)地S1平均能力次差，與產(chǎn)地S3無顯著差異；產(chǎn)地S3樺褐孔菌中黃酮清除羥基自由基平均能力最差。

3 結(jié)論

不同產(chǎn)地樺褐孔菌總黃酮含量測(cè)定結(jié)果表明，其含量關(guān)系為S5-吉林長(zhǎng)白山＞S2-黑龍江黑河＞S4-黑龍江伊春＞S6-吉林吉林＞S8-日本北海道＞S7-俄羅斯西伯利亞＞S1西藏林芝＞S3-黑龍江牡丹江，各產(chǎn)地黃酮含量均較低，其中S5-吉林長(zhǎng)白山樺褐孔菌中的總黃酮含量最高 (0.072μg/g)，S3-黑龍江牡丹江總黃酮含量最低(0.031μg/g)?？寡趸芰y(cè)定結(jié)果表明，S5-吉林長(zhǎng)白山、S7-俄羅斯西伯利亞、S6-吉林吉林、S4-黑龍江伊春的總黃酮清除羥基自由基的效果均較好，無顯著差異。綜上所述，不同產(chǎn)地樺褐孔菌在總黃酮含量方面存在著差異，且總黃酮有一定的抗氧化能力，這為樺褐孔菌的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。