生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下小鼠免疫功能的影響

白玉潔 ，鄭斯文 ，鄭厚勝 ，逄世峰 ，王英平 *

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112）

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科人參屬植物，微溫、甘、微苦，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、復(fù)神益智等功效[1]。主要分布在中國(guó)、韓國(guó)等地。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，人參具有調(diào)節(jié)血糖[2]、促進(jìn)造血功能[3]、抗疲勞抗氧化[4]、增強(qiáng)免疫力[5，6]的作用。生曬參為人參的主要炮制品，其主要活性成分主要是人參皂苷與人參多糖，但現(xiàn)在對(duì)于生曬參提取物免疫活性研究較少。環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物，具有廣譜的抗癌作用，同時(shí)還具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，可以嚴(yán)重抑制小鼠免疫功能[7～9]。本實(shí)驗(yàn)以環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑，研究生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 SPF級(jí) BALB/c小鼠，體重 20±2 g，購(gòu)于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（吉）2017-0005。小鼠自由飲食飲水，室溫23.0～25.0℃，濕度55%～65%，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

生曬參購(gòu)于集安康美新開河（吉林）藥業(yè)有限公司，經(jīng)吉林省參茸辦公室馮家研究員鑒定為5年生五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey）的根；環(huán)磷酰胺（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）；刀豆蛋白、紅細(xì)胞裂解液、紅細(xì)胞保存液 （索萊寶生物科技有限公司）；Enhanced Cell Counting Kit-8 （CCK-8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；無支原體胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基 （美國(guó) Hyclone公司）；白細(xì)胞稀釋液（江蘇建成科技有限公司）；IFN-γ、TNF-α試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備

KDC-40低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；ZHJH-C1115C智能安全型超凈工作臺(tái) （上海智城分析儀器制造有限公司）；BB150二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；水浴鍋（常州潤(rùn)華電器有限公司）；電子微量天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

生曬參醇提物：生曬參切片，75%酒精醇提，過濾后合并濾液，旋蒸得浸膏，得率為30%，含水量為30.36%，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

生曬參水提物：生曬參切片，50℃恒溫水提，料液比為1∶5，提取時(shí)間5h，提取 3次，過濾后合并濾液，旋蒸得浸膏，得率為37.5%，含水量為60.22%，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

實(shí)驗(yàn)分3批進(jìn)行，每批雄性BALB/c小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。設(shè)立正常對(duì)照組，灌胃（Introgastric，ig）生理鹽水，模型組（ig 生理鹽水），陽性對(duì)照組（ig鹽酸左旋咪唑40 mg/kg），醇提物組（ig醇提物 340mg/kg），水提物組（ig 水提物 800mg/kg），除正常對(duì)照組外，其余各組于灌胃后25 d開始腹腔注射CTX（80 mg/kg），連續(xù)注射5d，建立小鼠免疫功能低下模型。造模期間正常灌胃給藥，累計(jì)灌胃30 d。

2.3 小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)定

小鼠于末次注射CTX后24h，稱量小鼠體重，頸椎脫臼處死，解剖，取胸腺及脾臟，剝除周圍結(jié)締組織，生理鹽水沖洗殘血后濾紙吸去多余液體，稱量其重量并記錄。

2.4 小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的測(cè)定

小鼠于末次注射CTX后24h，小鼠眼球靜脈叢采血于抗凝劑中，混勻，取20 μL于0.38 mL的白細(xì)胞稀釋液中，混勻，顯微鏡下計(jì)算白細(xì)胞數(shù)。

2.5 細(xì)胞免疫

2.5.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

2.5.1.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備

各組小鼠于末次注射CTX24h后，頸椎脫臼處死后，超凈臺(tái)內(nèi)無菌取脾，去除結(jié)締組織及脂肪，用大號(hào)注射器芯研磨，過200目篩網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)（95%以上），10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。

2.5.1.2 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測(cè)定小鼠淋巴細(xì)胞增殖程度。調(diào)細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。設(shè)對(duì)照孔：脾細(xì)胞懸液 100μL；刺激孔：脾細(xì)胞懸液 100μL加 conA（終濃度為 5μg/mL）； 空白孔：1640 完全培養(yǎng)液 100μL。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育68h后，每孔加CCK-8顯色劑10μL，繼續(xù)孵育1h，在450nm下測(cè)吸光度值。淋巴細(xì)胞增值率用刺激指數(shù)SI來表示。

SI=對(duì)照孔/刺激孔

2.5.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) （DTH）

2.5.2.1 綿羊紅細(xì)胞（SRBC）

綿羊頸靜脈取血，將羊血放入盛有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動(dòng)10min，以脫纖維，靜置后用生理鹽水洗滌3次 （3500r/min，10min），制備壓積SRBC。

2.5.2.2 致敏

小鼠于檢測(cè)前4d，以2%（v/v）SRBC腹腔注射致敏，每只 0.2mL（約 1×108 個(gè) SRBC）。

2.5.2.3 DTH的產(chǎn)生與測(cè)定

采用足趾增厚法測(cè)定。4d后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠左側(cè)足趾厚度，測(cè)量3次，取平均值，并在測(cè)量處注射 20%（v/v）SRBC 20μL，24h 后再次測(cè)量小鼠足趾厚度 ，測(cè)量3次，取平均值。以攻擊前后足趾厚度的差值來表示DTH的程度。

2.6 單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定

2.6.1 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

小鼠末次注射CTX24h后，小鼠尾靜脈注射4倍稀釋后的印度墨汁（0.1mL/10g），注射完成后立即計(jì)時(shí)。在注射后2min、10min時(shí)分別采血，立即取20μL加至2mL0.1%Na2CO3中，混勻，在600nm處測(cè)波長(zhǎng)；并解剖小鼠，取肝、脾并稱重。以吞噬指數(shù)a表示小鼠碳廓清能力。

2.7 細(xì)胞因子的測(cè)定

各組小鼠于末次給藥24h后，小鼠摘眼球取血，離心，得到小鼠血清樣本，采用ELISA的方法按試劑盒說明書中操作方法檢測(cè)IFN-γ、TNF-α的含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值（x ）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩兩比較采用 LSD 法，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下小鼠器官指數(shù)及白細(xì)胞數(shù)的影響

如表1所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠器官指數(shù)及白細(xì)胞數(shù)顯著降低 （P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物、水提物可以明顯提高小鼠脾指數(shù)與白細(xì)胞數(shù)（P<0.05，P<0.01）。

表1 生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下小鼠器官指數(shù)及白細(xì)胞數(shù)的影響 （x±s，n=10）

3.2 生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下小鼠細(xì)胞免疫的影響的影響

如表2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增值能力與小鼠足趾厚度顯著降低 （P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物與水提物可以明顯提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增值能力與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。（P<0.05，P<0.01）。

表2 生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下細(xì)胞免疫的影響 （x±s，n=10）

3.3 生曬參不同提取物對(duì)單核-巨噬細(xì)胞能力的影響

如表3所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠碳廓清顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物、水提物可以明顯提高小鼠碳廓清能力（P<0.05，P<0.01）。

表3 生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下單核-巨噬細(xì)胞免疫的影響 （x±s，n=10）

3.3 生曬參不同提取物對(duì)IFN-γ與TNF-α含量的影響

如表4所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠IFN-γ與TNF-α含量顯著降低 （P<0.01）。與模型組比較，生曬參醇提物、水提物可以明顯提高小鼠IFN-γ 與 TNF-α 含量（P<0.05，P<0.01）。

表3 生曬參不同提取物對(duì)免疫功能低下IFN-γ與TNF-α 含量的影響（x±s，n=10）

4 討論與結(jié)論

CTX作為免疫抑制劑，大量實(shí)驗(yàn)研究表明CTX可以造成動(dòng)物的免疫抑制[7～9]。胸腺與脾是機(jī)體重要的免疫器官，對(duì)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用[10]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CTX可致小鼠免疫器官萎縮，生曬參醇提物與水提物可以明顯增強(qiáng)小鼠脾指數(shù)。脾淋巴細(xì)胞增殖能力與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)可以反應(yīng)小鼠細(xì)胞免疫功能，脾淋巴細(xì)胞增殖能力是評(píng)價(jià)T淋巴細(xì)胞功能的重要指標(biāo)[11]，結(jié)果表明生曬參醇提物與水提物可以不同程度提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。巨噬細(xì)胞作為體內(nèi)固有免疫的主要組成部分，可以吞噬與清除異物，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用[12]，碳廓清能力可以反應(yīng)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能，醇提物與水提物可以明顯提高小鼠碳廓清能力。IFN-γ是體內(nèi)參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，還可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，TNF-α主要由巨噬細(xì)胞分泌，能夠刺激NK細(xì)胞發(fā)揮作用，在宿主防御過程中發(fā)揮著重要作用[13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生曬參醇提物與水提物可以明顯提高小鼠TNF-α與IFN-γ含量。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生曬參醇提物與水提物對(duì)免疫功能低下小鼠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，且生曬參水提物的免疫活性優(yōu)于醇提物。