顱痛顆粒對(duì)偏頭痛模型大鼠行為學(xué)及NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

蒲玉婷， 王小強(qiáng)， 楊思進(jìn)， 白雪

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心腦病科，四川瀘州 646000）

偏頭痛是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，其發(fā)病特征為反復(fù)發(fā)作的一側(cè)或兩側(cè)搏動(dòng)性頭痛，發(fā)作時(shí)常伴有惡心、嘔吐等自主神經(jīng)癥狀特點(diǎn)，約1/3的偏頭痛患者在發(fā)病前可出現(xiàn)先兆癥狀[1]。目前偏頭痛的治療仍以緩解癥狀為主，西藥包括非甾體抗炎藥、麥角胺制劑、鈣通道阻滯劑及5羥色胺（5-HT）受體激動(dòng)劑等，但這些藥物副作用較多，且療效因人而異，而中醫(yī)藥防治偏頭痛具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本課題組繼承全國(guó)名老中醫(yī)王明杰的“玄府理論”學(xué)術(shù)思想及其臨床經(jīng)驗(yàn)，采用風(fēng)藥加蟲類藥的配伍方法研發(fā)出院內(nèi)制劑——顱痛顆粒（川藥制字220080295）。10余年的臨床應(yīng)用表明其對(duì)各種類型的頭痛均具有較好療效。但其治療偏頭痛的作用機(jī)制尚未闡述清楚。為繼承與發(fā)展“玄府—微觀結(jié)構(gòu)”學(xué)術(shù)思想，融合中醫(yī)藥創(chuàng)新理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，逐步建立新的中醫(yī)藥理論體系論治疑難疾病，本研究以偏頭痛大鼠為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討其對(duì)偏頭痛的作用機(jī)制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2013-065。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品顱痛顆粒（由羌活、藁本、荊芥、川芎、全蝎、蔓荊子、葛根等組成），由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室配制，10 g/袋。琥珀酸舒馬普坦片，天津華津制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：6G6924T。硝酸甘油注射液，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20160122。

1.3主要試劑與儀器核因子κB（NF-κB）p65抗體（英國(guó)Abcam公司）；磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）抗體（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）。凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；mini4垂直電泳槽（北京賽百奧科技有限公司）。

1.4分組與給藥將60只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，中藥高、中、低劑量組，西藥組，每組10只。參照動(dòng)物與人體的體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，中藥高、中、低劑量組大鼠分別給予顱痛顆粒（劑量為4.0、2.0、1.0 g·kg-1·d-1）灌胃，西藥組大鼠給予琥珀酸舒馬普坦片（劑量為6.0 mg·kg-1·d-1）灌胃，連續(xù)灌胃7 d。正常組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。

1.5模型制備參考Tassorelli C等[2]的造模方法，模型組，中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠于末次灌胃1 h后給予頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg制備偏頭痛模型，正常組大鼠頸背部皮下一次性注射生理鹽水10 mg/kg。大鼠造模后2～5 min出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠、煩躁不安等現(xiàn)象，30～60 min左右達(dá)到高峰，持續(xù)1～2 h后出現(xiàn)蜷臥、活動(dòng)減少狀態(tài)，表明造模成功。

1.6指標(biāo)觀察與檢測(cè)

1.6.1行為學(xué)指標(biāo)觀察觀察大鼠在180 min內(nèi)的行為學(xué)變化，大鼠耳紅出現(xiàn)及消失時(shí)間，前肢撓頭以及前肢爬籠次數(shù)。

1.6.2 Western blot法檢測(cè)腦干NF-κBp65、P-IκBα蛋白的表達(dá) 給予大鼠腹腔麻醉后迅速斷頭取出新鮮腦組織，參照《大鼠腦立體定位圖譜》[3]在冰上分離出腦干，使用預(yù)冷的9 g/L氯化鈉溶液迅速?zèng)_洗干凈腦干表面的血跡后放入組織勻漿器中，依照RIPA裂解液和細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書（購(gòu)買于瀘州科陽生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行腦干裂解提取蛋白。參照BCA蛋白定量試劑盒（購(gòu)買于瀘州科陽生物技術(shù)有限公司）說明書法進(jìn)行蛋白定量，然后電泳分離蛋白，ECL發(fā)光法顯色，測(cè)定大鼠腦干組織NF-κBp65、p-IκBα蛋白的表達(dá)，用凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，分析NF-κBp65蛋白、p-IκBα蛋白的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較則用LSD，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠行為學(xué)變化

2.1.1 大鼠各時(shí)段撓頭次數(shù) 表1結(jié)果顯示：模

型組大鼠各時(shí)間段撓頭次數(shù)較正常組明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高、中、低劑量組及西藥組大鼠各時(shí)間段撓頭次數(shù)明顯減少（P＜0.05），且中藥高、中、低劑量組的治療作用呈劑量依賴性。

2.1.2 大鼠耳紅出現(xiàn)時(shí)間和消失時(shí)間 表2結(jié)果顯示：正常組大鼠無雙耳發(fā)紅癥狀。模型組及各治療組大鼠均于造模后2～5 min出現(xiàn)雙耳發(fā)紅現(xiàn)象。與模型組比較，中藥高、中、低劑量組及西藥組大鼠耳紅出現(xiàn)時(shí)間明顯延后，而持續(xù)時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），且中藥高、中、低劑量組的治療作用呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠各時(shí)段撓頭次數(shù)比較Table 1 Comparison of the frequency of rat scratching head at various periods in various groups （±s，n/次）

表1 各組大鼠各時(shí)段撓頭次數(shù)比較Table 1 Comparison of the frequency of rat scratching head at various periods in various groups （±s，n/次）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組西藥組151～180 min 0.40±0.52 9.10±1.19①1.50±0.85②3.70±0.95②4.70±0.95②2.30±1.64②N 10 10 10 10 10 10 0～30 min 1.10±0.99 24.30±1.34①10.60±1.43②12.00±1.05②16.00±1.16②10.20±1.23②31～60 min 0.80±0.79 43.70±1.34①25.20±1.03②26.90±1.10②34.90±0.99②25.90±0.99②61～90 min 0.60±0.52 37.90±1.37①17.40±0.84②18.50±0.97②25.80±1.14②17.30±0.95②91～120 min 0.70±0.68 30.00±1.16①9.50±0.97②10.40±0.84②11.40±1.08②9.50±1.08②121～150 min 0.70±0.68 18.00±1.16①5.50±1.27②7.60±1.27②9.80±1.32②5.70±1.34②

表2 各組大鼠耳紅出現(xiàn)時(shí)間和消退時(shí)間比較Table 2 Comparison of the time for appearance and disappearance of auricular congestion in various groups （±s，t/min）

表2 各組大鼠耳紅出現(xiàn)時(shí)間和消退時(shí)間比較Table 2 Comparison of the time for appearance and disappearance of auricular congestion in various groups （±s，t/min）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與西藥組比較

組別正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組西藥組耳紅消失時(shí)間0 179.00±1.70 117.00±1.25①120.30±1.34①126.50±1.08①118.00±1.16①N 10 10 10 10 10 10耳紅出現(xiàn)時(shí)間0 1.99±0.46 5.30± 0.95①②3.79± 0.51①②3.01± 0.19①②4.70±1.16①

2.1.3 大鼠各時(shí)段爬籠次數(shù) 造模后，模型組、各治療組大鼠在4～5 min出現(xiàn)爬籠。模型組在30～60 min爬籠次數(shù)達(dá)到高峰，此現(xiàn)象可持續(xù)1～1.5 h。表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠各時(shí)段爬籠次數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高、中、低劑量組與西藥組大鼠爬籠次數(shù)減少（P＜0.05），且中藥高、中、低劑量組的治療作用呈劑量依賴性。

2.2大鼠腦干NF-κBp65、p-IκBα表達(dá)圖1、表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠及各給藥組大鼠腦干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高、中、低劑量組及西藥組大鼠腦干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），且中藥高、中、低劑量組對(duì)NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)的降低作用呈劑量依賴性。

3 討論

偏頭痛，屬于中醫(yī)“首風(fēng)”、“腦風(fēng)”、“頭痛”等范疇，多由外邪阻礙清陽、氣血凝滯、經(jīng)絡(luò)不通等所致。若頭痛病程日久、反復(fù)發(fā)作則會(huì)纏綿難愈、瘀血阻滯加重[4]。偏頭痛“忽犯忽止，作止無?！钡奶攸c(diǎn)與風(fēng)邪“善行而數(shù)變，易夾濕邪，纏綿難愈”等特性密切相關(guān)，如《治驗(yàn)回憶錄》曰：“頭為諸陽之會(huì)，賊風(fēng)久客，瘀塞經(jīng)隧，與氣相搏，遏而為痛?！憋L(fēng)邪侵犯頭目，上擾清竅，致頭部經(jīng)脈拘急，經(jīng)脈失養(yǎng)，氣機(jī)不暢，不通則痛，故可見頭痛發(fā)作。本課題組繼承王明杰教授“從風(fēng)論治腦病”以及“玄府理論”治療疑難疾病的學(xué)術(shù)思想[5]，擬定祛風(fēng)勝濕、清利頭目、通絡(luò)止痛之治則，并根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，采用袪風(fēng)藥如羌活、藁本、荊芥、川芎、蔓荊子、葛根等加蟲類藥全蝎的組方配伍方法，研制的院內(nèi)制劑顱痛顆粒，能針對(duì)偏頭痛風(fēng)濕夾瘀病機(jī)，起到開通腦之玄府、清利頭部竅道、舒經(jīng)通絡(luò)止痛的作用。

表3 各組大鼠各時(shí)段爬籠次數(shù)比較Table 3 Comparison of the frequency of rat climbing the cage in various groups （±s，n/次）

表3 各組大鼠各時(shí)段爬籠次數(shù)比較Table 3 Comparison of the frequency of rat climbing the cage in various groups （±s，n/次）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與西藥組比較

組別正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組西藥組151～180 min 0.70±0.68 6.60±0.97①3.10±0.99②4.50±0.85②5.50± 0.85②③3.60±0.97②N 10 10 10 10 10 10 0～30 min 0.80±0.63 15.10±1.19①10.30±1.16②11.40±0.96②12.90± 1.19②③10.20±1.54②31～60 min 0.70±0.68 22.60±0.84①13.90±0.99②15.70±0.95②18.00± 1.05②③14.40±1.08②61～90 min 0.60±0.69 19.00±1.05①13.60±0.97②14.70±0.95②15.90± 0.99②③13.80±1.03②91～120 min 0.60±0.52 15.60±1.08①10.30±0.95②12.50±0.85②13.80± 0.92②③10.70±1.16②121～150 min 0.70±0.82 12.20±0.92①8.20±0.92②9.50±1.18②10.05± 0.85②③8.50±1.08②

圖1 各組大鼠腦干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)比較Figure 1 Comparison of the expression of NF-κBp65 and p-IκBα in the brainstem of various groups（n=5）

表4 各組大鼠腦干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of NF-κBp65 and p-IκBα in the brainstem of various groups （±s，p）

表4 各組大鼠腦干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the protein expression levels of NF-κBp65 and p-IκBα in the brainstem of various groups （±s，p）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與西藥組比較

p-IκBα/β-actin 0.517±0.066 1.440±0.015①0.790±0.063②1.121± 0.045②③1.284± 0.055②③0.851±0.074②組別正常組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組西藥組N 10 10 10 10 10 10 NF-κBp65/β-actin 0.520±0.103 1.479±0.140①0.766±0.064②1.077± 0.125②③1.326± 0.055②③0.816±0.081②

偏頭痛的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，其中三叉神經(jīng)血管學(xué)說占主導(dǎo)地位[6]。該學(xué)說認(rèn)為偏頭痛發(fā)作時(shí)大鼠神經(jīng)血管接頭處硬腦膜血管擴(kuò)張，可刺激神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)肽，進(jìn)而使血管進(jìn)一步擴(kuò)張，從而發(fā)生快速的神經(jīng)炎性反應(yīng)，主要包括血管通透性增加，血漿蛋白外滲、血管周圍區(qū)的肥大細(xì)胞脫顆粒。NF-κB作為參與炎性反應(yīng)過程中的關(guān)鍵因子，能夠激活早期炎性反應(yīng)信號(hào)通路，誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥及三叉神經(jīng)致敏，與偏頭痛的發(fā)作密切相關(guān)[7]。Greco R等[7]研究顯示NF-κB可在炎癥部位高度表達(dá)。靜止?fàn)顟B(tài)下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與IκBα結(jié)合形成無活性的復(fù)合物。當(dāng)外界炎癥因子刺激細(xì)胞并作用于相應(yīng)受體后，IκBα被IκK磷酸化，p-IκBα從NF-κB處脫落，NF-κB被活化，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游信號(hào)基因cjun、c-fos的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步激活降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、一氧化氮合酶（INOS）[8，9]。這些神經(jīng)肽可進(jìn)一步使腦血管擴(kuò)張、血漿外滲、組織腫脹，發(fā)生血管神經(jīng)性無菌性炎癥，出現(xiàn)偏頭痛癥狀。

本研究選用硝酸甘油復(fù)制的偏頭痛模型，其造模成功的標(biāo)志主要根據(jù)其行為學(xué)變化，即造模成功后大鼠出現(xiàn)的雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠、煩躁不安等行為學(xué)改變[10，11]。本研究結(jié)果顯示，顱痛顆粒能減少偏頭痛大鼠撓頭及爬籠次數(shù)，縮短耳紅時(shí)間，改善其行為學(xué)癥狀，且存在量效關(guān)系，以高劑量效果最好。偏頭痛大鼠腦干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表達(dá)水平升高，而顱痛顆粒能夠降低其表達(dá)，且存在一定量效關(guān)系。表明顱痛顆?？筛纳破^痛大鼠的行為學(xué)變化，其作用機(jī)制可能與抑制腦干NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。