白脈軟膏含藥血漿對大鼠退變滑膜細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)體系的作用及機制研究

蔣鼎， 丁道芳， 韓大鵬， 翟偉韜， 歐陽桂林， 薛艷， 薛喬， 曹月龍

（1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院骨傷研究所，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學康復學院，上海 201203；4.上海中醫(yī)藥研究院光華關節(jié)炎研究所，上海 200052；5.西藏奇正藏藥股份有限公司，西藏 860000）

骨關節(jié)炎是一種以關節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質增生為特征的慢性關節(jié)疾病，累及關節(jié)軟骨乃至整個關節(jié)，包括軟骨下骨、關節(jié)囊、滑膜和關節(jié)周圍肌肉。骨關節(jié)炎病程所涉及的結構中，究竟是何處最早出現(xiàn)病變并導致骨關節(jié)炎的問題一直存在爭議。近年有不少研究[1-4]表明，滑膜炎癥在骨關節(jié)炎中起到了重要的作用，滑膜炎在不同程度的骨關節(jié)炎患者中皆存在，包括一些僅有前期癥狀的患者，且滑膜炎與骨關節(jié)炎患者疼痛程度以及病情進展有著密切關系。根據(jù)不斷出現(xiàn)的新的證據(jù)，有學者提出滑膜的病變在骨關節(jié)炎中也許是病起源頭而非以往所認知的病發(fā)結果[5]。

奇正白脈軟膏根據(jù)傳統(tǒng)藏醫(yī)理論研制而成，具有舒筋活絡功效，含姜黃、肉豆蔻、甘松、陽起石、甘草、人工麝香、干姜、藏茴香、藏菖蒲、花椒、堿花等成分，常用于白脈病、癱瘓、偏癱、筋腱強直、外傷引起的經(jīng)絡及筋腱斷傷、手足攣急、跛行等病癥。既往有研究顯示，白脈軟膏對骨折愈合、關節(jié)扭傷、筋膜炎等疾病有肯定的療效[6-9]，但其對關節(jié)炎的治療作用則需進一步研究。探究退變滑膜細胞對軟骨細胞形態(tài)、基因表達變化的影響，有助于了解關節(jié)炎病程，因此，本研究應用滑膜—軟骨共培養(yǎng)體系探討骨關節(jié)炎病理過程以及白脈軟膏對其干預作用，以期為其臨床防治骨關節(jié)炎提供可靠的實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物新生SD大鼠8只，體質量（200±20）g，雄性，SPF級，購自上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，動物質量合格證號：SCXK（滬2013-0016）。

1.2主要藥物、試劑與儀器奇正白脈軟膏（西藏奇正藏藥股份有限公司，批號：151036）；扶他林軟膏（北京諾華制藥有限公司，批號：VP0756）。脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）；胎牛血清、1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液（100×）、2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化液（法國Biowest公司）；白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（臺灣Arigo公司）；PCR試劑盒（美國Selleck公司）；基質金屬蛋白酶13（MMP13）、磷酸化核因子κBp65（p-NF-κBp65）、Ⅱ型膠原（COL2A1）抗體（美國 MP Biomedicals公司）。SIGMA離心機（德國Sigma公司）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）；TDZ4-WS離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific）；IX41顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3白脈軟膏、扶他林軟膏含藥血漿的制備方法給予大鼠背部剃光毛，將藥膏涂于大鼠背部，大鼠每日藥量依據(jù)文獻[10]按照體表面積折算公式進行換算：大鼠每日藥量=成人（70 kg）每日藥量×0.018=200 g，每日2次，連續(xù)3 d。第3 d第2次涂完1 h后，按每100 g大鼠體質量注射0.15 mL（45 μg/g）的戊巴比妥鈉，深度麻醉后沿腹部正中線打開腹腔，暴露腹主動脈；應用10 mL一次性注射器緩慢抽吸腹主動脈血，轉移到15 mL無菌一次性抗凝離心管中室溫靜置2 h，3 000 r/min離心20 min，吸取上層血漿，-80℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.4滑膜細胞與軟骨細胞的分離與培養(yǎng)將8只新生24 h SD大鼠用體積分數(shù)75%乙醇浸泡5 min后麻醉處死，取出四肢關節(jié)處滑膜、軟骨組織。將滑膜組織剔除脂肪、血塊，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次；將標本移入另一新的培養(yǎng)皿中，剪碎滑膜組織，大小不超過1 mm3，吸取滑膜組織點狀接種于25 cm2培養(yǎng)瓶底壁，均勻排列，將培養(yǎng)瓶豎立放置；加入5 mL完全培養(yǎng)基，蓋上瓶蓋，豎立放于37℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，翻轉培養(yǎng)瓶，水平放置培養(yǎng)；每3 d更換1次培養(yǎng)基，待細胞單層長滿70%～80%后，2.5 g/L胰酶消化，傳代。取3～5代生長較好的細胞用于后續(xù)實驗。軟骨組織采用本研究所已成熟的軟骨細胞培養(yǎng)方法[12]，0.1%的Ⅱ型膠原酶消化1 h，重復3～4次，收集消化的細胞懸液，1 000 r/min，離心10 min后取細胞沉淀，培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。

1.5 LPS誘導滑膜細胞退變及滑膜細胞形態(tài)觀察打開大鼠膝關節(jié)腔，取出滑膜組織，Ⅰ型膠原酶消化2～3 h，1 000 r/min離心10 min，培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。待細胞鋪滿皿底，胰酶消化傳代培養(yǎng)，取第1代（P1）細胞進行實驗。加入LPS（質量濃度為1 μg/mL）誘導滑膜細胞退變，24 h后在倒置顯微鏡下觀察滑膜細胞的密度與形態(tài)。

1.6ELISA檢測滑膜細胞上清IL-1β、TNF-α表達分別設立空白組、模型組、西藥組、白脈組?？瞻捉M：正常滑膜細胞（無LPS誘導）；模型組：退變滑膜細胞（LPS誘導）；西藥組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+扶他林軟膏血漿干預；白脈組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+白脈軟膏血漿干預。收集各組細胞上清液，ELISA檢測IL-1β和TNF-α表達。具體操作步驟：將樣品和配制好的標準品加入96孔板中，標準品及樣品均做復孔，每組設3個復孔，重復1次；36℃溫育1.5 h；Wash Buffer洗滌5次；標準品和樣品孔中分別加入抗體結合物，36℃溫育1 h；重復洗滌5次；加入鏈酶親和素—HRP，36℃溫育30 min；重復洗滌5次；加入TMB試劑，36℃避光溫育15 min；加入終止液，終止反應（孔中溶液由藍色轉為黃色）；立即以450 nm波長依序測量各孔的吸光度；根據(jù)標準品濃度計算出各樣本濃度。

1.7退變滑膜細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)體系及軟骨細胞形態(tài)學觀察LPS誘導滑膜細胞24 h后，撤掉LPS；按常規(guī)細胞共培養(yǎng)技術方法將誘導后的大鼠滑膜細胞與大鼠軟骨細胞分別接種于Transwell小室的上室和下室，再于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別設立空白組、模型組、西藥組、白脈組?？瞻捉M：正?；ぜ毎oLPS誘導）+正常軟骨細胞+正常大鼠血漿干預；模型組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+正常軟骨細胞組+正常大鼠血漿干預；西藥組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+正常軟骨細胞+西藥（扶他林軟膏）血漿組干預；白脈組：退變滑膜細胞（LPS誘導）+正常軟骨細胞+白脈血漿干預。培養(yǎng)24 h后，觀察軟骨細胞形態(tài)。

1.8實時定量PCR（qPCR）檢測共培養(yǎng)體系中MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9基因表達退變的滑膜細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)24 h后，抽提各組共培養(yǎng)體系中的軟骨細胞總RNA及濃度測定，取2 μg RNA逆轉錄，進行qPCR檢測。每個樣品設置3個復孔，實驗重復3次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，2-△△CT方法可用于定量PCR實驗來計算基因表達的相對變化（p），見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.9Western blot法檢測各組共培養(yǎng)體系中軟骨細胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1的表達情況首先收集蛋白樣品：原代細胞培養(yǎng)24 h后裂解細胞和蛋白濃度測定，蛋白變性后備用。蛋白樣品電泳和轉膜；體積分數(shù)10%BSA室溫封閉1 h；一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次10 min；二抗（1∶20 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min；化學發(fā)光法檢測，X膠片曝光顯影，采用Image J圖像分析管理系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.10統(tǒng)計方法采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1退變滑膜培養(yǎng)及指標檢測

2.1.1 滑膜細胞形態(tài)觀察 培養(yǎng)24 h后，正?；ぜ毎识嘟切危ㄒ妶D1-A），經(jīng)LPS誘導后滑膜細胞形態(tài)明顯變細長，呈長梭形（見圖1-B）。

圖1 倒置顯微鏡觀察滑膜細胞形態(tài)（×100）Figure 1 The morphological features of synoviocytes under inverted microscope（×100）

2.1.2 滑膜細胞上清中IL-1β、TNF-α含量 表2結果顯示：與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組IL-1β、TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05），西藥組僅TNF-α含量降低（P＜0.05）。

表2 各組滑膜細胞上清中IL-1β、TNF-α含量比較Table 2 Comparison of the contents of IL-1β and TNF-α in the synoviocyte supernatant in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各組滑膜細胞上清中IL-1β、TNF-α含量比較Table 2 Comparison of the contents of IL-1β and TNF-α in the synoviocyte supernatant in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別空白組模型組西藥組白脈組F P TNF-α 36.645±9.592 62.793±6.716①43.815±4.904②38.787±7.699②5.283 0.015 IL-1β 38.711±6.209 53.055±7.569①46.599±6.369 40.308±3.278②3.256 0.059

2.2共培養(yǎng)體系中退變滑膜細胞對軟骨細胞的影響

2.2.1 共培養(yǎng)體系中軟骨細胞形態(tài) 共培養(yǎng)24 h后觀察軟骨細胞形態(tài)。圖2結果顯示：與空白組比較，其余3組細胞形態(tài)明顯細長，呈長梭形改變；與模型組比較，白脈組、西藥組軟骨細胞形態(tài)無明顯差異。

2.2.2 共培養(yǎng)體系中軟骨細胞基因表達 qPCR法檢測各組軟骨細胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9 mRNA表達。圖3結果顯示：與空白組比較，模型組軟骨細胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達明顯升高，Sox9 mRNA表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組、西藥組MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達降低，Sox9 mRNA表達升高（P＜0.05）。

圖2 倒置顯微鏡觀察各組軟骨細胞形態(tài)（×100）Figure 2 The morphological features of chondrocytes under inverted microscope（×100）

2.2.3 共培養(yǎng)體系中軟骨細胞蛋白表達 Western blot法檢測各組共培養(yǎng)體系中軟骨細胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1蛋白的表達情況。圖4結果顯示：與空白組比較，模型組MMP13、p-NF-κBp65表達升高，COL2A1表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，白脈組MMP13、p-NF-κBp65表達降低，COL2A1表達升高（P＜0.05），西藥組僅COL2A1表達升高（P＜0.05）。

圖3 各組軟骨細胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4、Sox9 mRNA表達比較Figure 3 Comparison of the mRNA expression levels of MMP3，TNF-α，ADAMTS4，and Sox9 in the chondrocytes of various groups

3 討論

生理情況下，為維持軟骨結構的完整，內環(huán)境中分解性細胞因子和合成性細胞因子共同作用，二者在體內維持著分解代謝與合成代謝的動態(tài)平衡，而滑膜炎癥則打破了內環(huán)境的平衡從而導致進一步的軟骨侵蝕[13]。骨關節(jié)炎進程中的起關鍵作用的細胞因子如IL-1β、TNF-α在滑膜及軟骨處皆檢測出大量表達[13-15]。諸多證據(jù)[4，5]提示，滑膜炎可能先于關節(jié)軟骨的破壞，為骨關節(jié)炎進展的前驅，滑膜退變和軟骨退變互相影響形成“滑膜—軟骨”軸，滑膜退變是骨關節(jié)炎發(fā)病的重要因素。本研究觀察了退變滑膜細胞對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞的形態(tài)、基因表達的影響，在此基礎上進一步觀察了白脈軟膏對“滑膜—軟骨”軸的干預作用。

圖4 各組軟骨細胞MMP13、p-NF-κBp65、COL2A1蛋白表達比較Figure 4 Comparison of the protein expression levels of MMP13，p-NF-κBp65，and COL2A1 in the chondrocytes of various groups

IL-1β和TNF-α是與骨關節(jié)炎密切相關的炎癥指標[16]。本研究結果顯示，經(jīng)LPS誘導的滑膜細胞在形態(tài)上出現(xiàn)明顯的成纖維樣改變，滑膜細胞上清中IL-1β和TNF-α含量升高，白脈含藥血漿可有效下調IL-1β和TNF-α含量。表明LPS誘導后加重了滑膜細胞炎癥反應，其形態(tài)變化亦與滑膜細胞退變進程符合，而白脈含藥血漿能抑制滑膜細胞炎癥反應以及退變進程。

骨關節(jié)炎發(fā)病機制復雜，涉及關節(jié)及周圍組織多種病理改變，這些病變相互影響并促進了疾病的發(fā)展，為了研究其病理機制尚需要提供與體內環(huán)境相似的細胞培養(yǎng)環(huán)境。細胞共培養(yǎng)體系可模擬體內環(huán)境，常應用于骨科相關病理基礎研究中[17]。軟骨基質的主要成分有水、膠原和蛋白多糖。Ⅱ型膠原（COL2A1）是關節(jié)軟骨的主要結構成分，MMP3與MMP13皆屬于基質降解酶，MMP13被證實為Ⅱ型膠原最有效的降解酶，而IL-1β、TNF-α是軟骨降解的有效激活物[16]。聚蛋白多糖酶家族（ADAMTS）為A-can退變的重要影響因素，ADAMTS4被證實與骨關節(jié)炎的發(fā)展密切相關[18]。Sox9基因能調控軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多聚糖的表達，抑制軟骨降解的作用[19]。NF-κB是廣泛存在于真核細胞內的一個核轉錄因子，其在骨關節(jié)炎炎癥反應及疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，與軟骨降解和關節(jié)損傷密切相關[20，21]。退變滑膜細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)實驗結果顯示，與空白組比較，模型組軟骨細胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)變化，細胞逐漸細長，呈長梭形改變。軟骨細胞失去原有形態(tài)特征，這與骨關節(jié)炎病程中關節(jié)軟骨發(fā)生成纖維化與肥大化改變一致。與模型組比較，西藥組、白脈組軟骨細胞的形態(tài)無明顯差異。提示軟骨細胞與退變滑膜細胞共培養(yǎng)后發(fā)生退變，扶他林軟膏、白脈軟膏含藥血漿對此形態(tài)變化未顯示出明顯的抑制作用。PCR結果顯示：與空白組比較，模型組軟骨細胞MMP3、ADAMTS4、TNF-α mRNA表達上調，Sox9mRNA表達下調；與模型組比較，白脈組軟骨細胞明顯抑制MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表達，并上調Sox9 mRNA表達。說明退變滑膜細胞促進了軟骨細胞退變，加重了骨關節(jié)炎的病理進展，提示“滑膜—軟骨”軸對骨關節(jié)炎起促進作用，而白脈含藥血漿對此病理過程有明顯抑制作用。Western blot結果顯示：與空白組比較，模型組MMP13、p-NF-κBp65蛋白表達上調，明顯抑制COL2A1蛋白表達；與模型組比較，白脈組MMP13、p-NF-κBp65表達上調，COL2A1表達下調。表明白脈軟膏含藥血漿可能通過抑制p-NF-κBp65表達，減輕骨關節(jié)炎炎癥反應，調控“滑膜—軟骨”軸，從而抑制軟骨破壞。提示白脈軟膏有明顯的軟骨保護作用，對“滑膜—軟骨”軸起抑制作用。

從白脈軟膏配方組成來看，姜黃破血行氣、通經(jīng)止痛，肉豆蔻溫中止痛，甘松行氣止痛，麝香活血止痛，干姜、茴香散寒止痛，藏菖蒲散熱消腫，花椒散寒祛痹，陽起石補虛祛痹，甘草調和諸藥、緩急止痛。諸藥合制，共奏活血止痛、舒筋消腫之效。其舒筋活絡止痛的功效亦與骨關節(jié)炎中醫(yī)臨床治療相對應。

綜上所述，“滑膜—軟骨”軸中滑膜細胞的變化在滑膜病變中起著重要作用，其退變可影響軟骨細胞形態(tài)及基因表達，滑膜的退變可促進骨關節(jié)炎的發(fā)展。白脈軟膏對“滑膜—軟骨”軸有著明顯的抑制作用，其作用機制可能與減輕滑膜細胞炎癥反應，抑制軟骨細胞NF-κB活化，降低“滑膜—軟骨”軸中各降解性細胞因子的表達有關。