PAD4功能的研究進(jìn)展及臨床意義

茍峻琦，劉 茂,唐 鍇，帥 壯，呂 湛

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 南充 637000)

肽?；彼崦搧啺泵?(peptidylarginine deiminases 4，PAD4)是一種在Ca2+存在條件下可將肽酰精氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)殡孽９习彼釟埢男揎椕福堑鞍踪|(zhì)翻譯后重要的修飾方式之一。PAD4參與多種疾病的發(fā)病過程[1]。PAD4首先在白血病中發(fā)揮作用而被發(fā)現(xiàn)[2]，隨后大量的研究發(fā)現(xiàn)其可通過直接作用參與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、自身免疫性疾病以及急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndromes，ACS)發(fā)病過程，同時也可通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)形成在多種疾病中發(fā)揮間接作用[3-5]。NETs由染色質(zhì)與顆粒蛋白質(zhì)構(gòu)成，DNA是NETs的主要結(jié)構(gòu)成分。NETs最初被描述為一種防御細(xì)菌的機(jī)制[6]，研究發(fā)現(xiàn)其在病理血栓形成(包括深靜脈血栓形成[7]和動脈粥樣硬化血栓形成[8])、自身免疫性疾病的發(fā)生、腫瘤的發(fā)生中同樣具有重要作用。因此，PAD4抑制劑或降解NETs的藥物可能成為治療心血管疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病的新方法。現(xiàn)就PAD4的生物學(xué)功能及其臨床意義進(jìn)行綜述，期望對PAD4深入研究、相關(guān)臨床疾病的診斷以及開發(fā)新的藥物提供幫助。

1 PAD4的結(jié)構(gòu)

Chavanas等[9]將位于染色1p35～36上編碼5種人PAD的基因分別稱為PAD1～4與PAD6。Nakashima和Hagiwara[2]首先報(bào)道從人骨髓白血病HL-60細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PAD4，其是由663個氨基酸組成的共價(jià)二聚體，cDNA為2 238 bp，分子量為74 000。PAD4主要分布于巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞與單核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，作用于細(xì)胞核中的組蛋白,它能將帶正電荷的組蛋白精氨酸轉(zhuǎn)化為電中性的瓜氨酸殘基，進(jìn)而減弱組蛋白與負(fù)電荷DNA的相互作用，使染色質(zhì)疏松、核膜破裂，釋放出松散的染色質(zhì)和顆粒蛋白，最終形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Manjula和Masashi[10]研究發(fā)現(xiàn)PAD4是PAD家族中唯一具有核定位模體特性，其能定位于細(xì)胞核且在細(xì)胞分化、發(fā)育和凋亡中發(fā)揮重要作用。當(dāng)PAD4被Ca2+激活時，其能定位于細(xì)胞核，以瓜氨酸作用于H3、H2A、H4[6]。PAD4具有兩個結(jié)構(gòu)域的伸長折疊，N-結(jié)構(gòu)域由氨基酸殘基Met1至Pro300組成，可進(jìn)一步分化為兩個免疫球蛋白樣亞結(jié)構(gòu)域(亞結(jié)構(gòu)域1和2)。亞結(jié)構(gòu)域1(殘基1～118)具有9個b-片層和1個核定位信號，亞結(jié)構(gòu)域2(殘基119～300)有10個b-片層、4個短的α-螺旋和3個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。Asn301至Pro663構(gòu)成C-結(jié)構(gòu)域，C-結(jié)構(gòu)域有5個bbab模塊化結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)以一種假五倍體對稱結(jié)構(gòu)(稱為a/b螺旋片,a/b propeller)環(huán)形排列，形成活性位點(diǎn)裂隙?；钚晕稽c(diǎn)裂隙能容納組蛋白N端肽和兩個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)[11]。PAD4是一種依賴Ca2+活性酶，有5個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，其與Ca2+結(jié)合可引起本身構(gòu)象改變，形成活性位點(diǎn)裂隙。

2 PAD4的功能

2.1PAD4在ACS中的作用 ACS主要由斑塊破裂引起，斑塊破裂是動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥形成的結(jié)果，炎癥將促進(jìn)壞死核心的擴(kuò)張和纖維帽的變薄。目前全世界主要的治療手段是針對傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)因素，如血漿低密度脂蛋白膽固醇水平、吸煙和高血壓，蝕損斑塊對ACS的影響正在上升。蝕損斑塊的特征是內(nèi)皮細(xì)胞脫落和小血管腔內(nèi)血栓形成，占所有ACS的25%～30%[12]。PAD4通過催化NETs，參與蝕損斑塊形成，進(jìn)而參與ACS發(fā)病過程。NETs可與中性粒細(xì)胞釋放的顆粒蛋結(jié)合，從而在動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。Wang等[13]研究表明活化的中性粒細(xì)胞形成NETs時期，中性粒細(xì)胞表達(dá)高水平PAD4。Franck等[14]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)佛波酯(一種抗生素)刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，用含補(bǔ)體豐富的幼兔血清培養(yǎng)人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞，用C5b-9染色法檢測細(xì)胞上補(bǔ)體沉積量。與單獨(dú)添加幼兔血清相比，添加NETs后，幼兔血清明顯增加了內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)。這一結(jié)果表明，NETs可能以依賴補(bǔ)體的方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞死亡和脫離。同時，他們還發(fā)現(xiàn)血液被急性擾動后，PAD4的缺失或抑制NETs的形成可明顯保留內(nèi)皮屏障功能，防止內(nèi)皮損傷[15]。Stakos等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在ST段抬高型急性心肌梗死患者的梗死相關(guān)冠狀動脈內(nèi)，參與冠狀動脈血栓形成的組織因子的功能需要NETs結(jié)構(gòu)的完整，暴露于NETs上的組織因子，能夠誘導(dǎo)凝血酶的產(chǎn)生，產(chǎn)生的凝血酶可以通過細(xì)胞蛋白酶活化受體進(jìn)一步激活靜止的血小板，從而參與血栓形成。因此，PAD4和NETs可能破壞內(nèi)皮的正常功能，從而成為預(yù)防和治療冠狀動脈粥樣硬化血栓并發(fā)癥的新靶點(diǎn)。

近年來研究表明，PAD4和依賴PAD4的NETs在人和小鼠動脈粥樣硬化形成中發(fā)揮重要作用[4]。巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β是動脈粥樣硬化發(fā)病過程的主要驅(qū)動因子，NETs可啟動巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，激活Th17細(xì)胞，促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊中免疫細(xì)胞的合成。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，使用脫氧核糖核酸酶Ⅰ降解形成的NETs,這種方法降低了野生型小鼠體內(nèi)NETs水平，與未處理的對照組小鼠相比，小鼠體內(nèi)血管斑塊的大小明顯減少。Warnatsch等[18]研究證明了NETs參與動脈粥樣硬化的作用，他們將載脂蛋白E缺陷小鼠與缺乏中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的小鼠雜交以消除NETs,并給予高脂飲食，主動脈根部橫截面積分析顯示，兩組在高脂飲食治療4周后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在高脂飲食治療8周后，載脂蛋白E/中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶/蛋白酶3缺陷小鼠與僅缺乏載脂蛋白E的對照組小鼠相比，斑塊面積減少了75%。同樣，給予高脂飲食喂養(yǎng)的載脂蛋白E缺乏小鼠注射脫氧核糖核酸酶Ⅰ，小鼠的斑塊面積較前減少了75%。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，消除斑塊部位的NETs或阻止NETs形成可能對動脈粥樣硬化有預(yù)防或治療作用。Franck等[14]研究表明，造血細(xì)胞中的PAD4基因缺陷并不能影響動脈粥樣硬化早期病變脂紋的形成、減少斑塊大小或減少炎癥反應(yīng)。他們將8周齡的Ldlr-/-小鼠接受致死性照射，與野生型或PAD4-/-小鼠骨髓重組，給予高脂飲食5或10周后，兩組小鼠血液膽固醇水平相似，兩組小鼠主動脈的脂質(zhì)含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，缺乏PAD4小鼠在高脂飲食5周或10周后，斑塊大小并沒有改變，也沒有改變巨噬細(xì)胞聚集。目前，PAD4的這一作用尚存爭議，仍需進(jìn)一步的研究證明。

2.2PAD4在自身免疫性疾病中的作用 近年來，PAD4在多種自身免疫性疾病中得到廣泛研究，PAD4抑制劑被認(rèn)為是治療自身免疫性疾病的新藥物。PAD4可通過促進(jìn)NETs形成參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的發(fā)病過程[19-20]。PAD4參與中性粒細(xì)胞的特殊死亡過程，并形成特殊產(chǎn)物NETs，NETs中含有自身DNA-抗菌肽復(fù)合物，激活樹突狀細(xì)胞釋放干擾素，刺激自身B淋巴細(xì)胞釋放針對自身抗原的抗體，促進(jìn)SLE患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)和病情發(fā)展[21]。王增玲等[22]抽取SLE發(fā)病期與緩解期患者的靜脈血，并用特定試劑檢測血清PAD4水平。結(jié)果表明，PAD4在SLE患者緩解期和活動期均高表達(dá)，明顯高于正常對照組。同時，SLE患者腎組織中NETs高表達(dá)，浸潤的NETs可參與并加速患者腎臟損傷。PAD4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)中同樣發(fā)揮重要作用。有學(xué)者提出PAD4作為RA特異性較高的一種自身抗原，可作為類風(fēng)濕因子和抗環(huán)瓜氨酸蛋白/肽陰性患者血清學(xué)候選診斷指標(biāo)[23]。PAD4參與RA的發(fā)病過程主要是通過瓜氨酸發(fā)揮作用[24]。瓜氨酸化參與RA患者自身免疫反應(yīng)、關(guān)節(jié)組織侵蝕破壞與血管翳形成。同時，RA患者的關(guān)節(jié)內(nèi)分布著瓜氨酸蛋白的靶抗原，導(dǎo)致慢性疼痛和炎癥反應(yīng)。PAD4過表達(dá)可引起RA患者滑膜液中PAD4 mRNA、PAD4蛋白和瓜氨酸肽的抗原變性而引起病理免疫反應(yīng)[25]。呂卓等[26]選取確診RA的患者活動期24例，緩解期14例，并選取14例正常人作為對照，檢測各組靜脈血中的PAD4水平。結(jié)果顯示，RA患者活動期、緩解期PAD4表達(dá)水平均高于健康對照組，活動期較緩解期表達(dá)升高。Suzuki等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型的DBAⅠ小鼠相比，牛Ⅱ型膠原免疫PAD4基因敲除小鼠的炎癥細(xì)胞因子水平、臨床疾病評分和抗牛Ⅱ型膠原的抗體水平明顯降低，同時牛Ⅱ型膠原可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)PAD4的表達(dá)，因此，PAD4參與膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的發(fā)病過程。

同時，PAD4在多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性小血管炎等其他自身免疫性疾病中同樣具有重要作用。在MS中，髓鞘堿性蛋白是維持髓鞘緊實(shí)和防止降解的關(guān)鍵蛋白，其含有非編碼氨基酸“瓜氨酸”的濃度和比例異常。PAD4通過催化蛋白質(zhì)翻譯后的瓜氨酸，從而參與MS的發(fā)病過程。Wei等[28]選取患有自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型作為模型系統(tǒng)，模擬MS的炎癥狀態(tài)，分別每隔4天注射PAD4的抑制劑，第24天處死小鼠并對脊髓和腦組織進(jìn)行抗CD3染色，結(jié)果在腦組織中治療組的CD3水平較未治療組顯著降低，腦組織中以CD3為主的T細(xì)胞明顯減少。這些研究表明，由于抑制了瓜氨酸的作用，經(jīng)PAD4抑制劑治療后免疫應(yīng)答減弱，PAD4酶抑制劑可以作為MS的靶向藥物。有研究發(fā)現(xiàn)[29]，抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化在體外可誘導(dǎo)NETs的形成，在NETs中存在一些靶向的自身抗原表位，如髓過氧化物酶和蛋白酶3。NETs可以沉積在抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎患者發(fā)炎的腎臟中引起血管炎，促進(jìn)自身對中性粒細(xì)胞成分的免疫反應(yīng)?？傊琍AD4在自身免疫性疾病發(fā)病過程中具有重要影響，PAD4酶抑制劑可能具有潛在的治療作用。

2.3PAD4在腫瘤中的作用 蛋白質(zhì)瓜氨酸化不僅參與調(diào)控基因的表達(dá)，與炎癥、損傷、凋亡等機(jī)體病理生理過程有關(guān)，而且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PAD4在乳腺癌、直腸腺癌、食管腺癌及卵巢癌等多種腫瘤中高表達(dá)[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因p53在應(yīng)激條件下可被激活，其編碼的p53蛋白可轉(zhuǎn)錄激活與細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡有關(guān)的靶基因(如p21)。PAD4可抑制p53靶基因的表達(dá)，從而喪失其抑制腫瘤功能并且激活細(xì)胞生長存活通路。而PAD4抑制劑可引起p21表達(dá)增加，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期停滯[30]。在腫瘤細(xì)胞中，PAD4可通過上調(diào)SESN2(一類抗氧化基因)的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞生長[31]。PAD4可影響腫瘤細(xì)胞的凋亡。PAD4在多種非腺癌組織中與細(xì)胞角蛋白共表達(dá)，細(xì)胞角蛋白8、細(xì)胞角蛋白18和細(xì)胞角蛋白19可被PAD4瓜氨酸化，瓜氨酸化的細(xì)胞角蛋白可拮抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶介導(dǎo)的細(xì)胞骨架解聚過程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[32]。同時，PAD4抑制劑氟脒或氯脒可對乳腺癌MCF7細(xì)胞、白血病HL-60細(xì)胞以及人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[33]。PAD4還可影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵蝕。腫瘤及微環(huán)境產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-8在腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，PAD4可使白細(xì)胞介素-8的第5位精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼?，瓜氨酸化的白?xì)胞介素-8生物活性將明顯下降[34]。同時，晚期腫瘤患者血清中的PAD4可使抗凝血酶瓜氨酸化活性降低，從而使其喪失抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移以及抗血管生成作用[35]。腫瘤相關(guān)性血栓形成同樣與PAD4相關(guān)，其形成通常伴隨有血漿組蛋白高瓜氨酸化。與腫瘤相關(guān)的血栓性微血管病患者血漿中的瓜氨酸化組蛋白水平較健康對照組明顯升高[36]。

同時，研究發(fā)現(xiàn)PAD4催化產(chǎn)生的NETs在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并且與治療效果及預(yù)后相關(guān)[37]。NETs內(nèi)多種組分(如基質(zhì)金屬蛋白酶-9、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G等)可以直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[38-41]。NETs可錨定并包裹體內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的攻擊。NETs及其代謝產(chǎn)物還能抑制機(jī)體免疫細(xì)胞功能[42]。NETs將體內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞錨定，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的黏附，抑制NETs這種作用可顯著減少腫瘤細(xì)胞跨內(nèi)皮滲出和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[43]。NETs也可通過多種途徑參與腫瘤相關(guān)性血栓形成，循環(huán)中的NETs能夠?yàn)檠“屦じ?、聚集提供網(wǎng)狀支架，其組成成分(核DNA、組蛋白和蛋白酶)具有促凝活性。因此，PAD4抑制劑或降解NETs的藥物在腫瘤相關(guān)疾病中具有潛在的治療作用。

3 小 結(jié)

PAD4作為PAD家族中唯一具有核定位特性并作用于細(xì)胞核組蛋白的酶，是調(diào)節(jié)NETs產(chǎn)生必不可少的酶。PAD4首先在白血病中發(fā)揮作用而被發(fā)現(xiàn)，大量研究也表明PAD4在多種類型腫瘤中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并參與腫瘤相關(guān)性血栓形成。隨著對PAD4研究的深入，研究發(fā)現(xiàn)PAD4在ACS、自身免疫性疾病中同樣具有重要作用。其可在ACS中促進(jìn)內(nèi)皮侵蝕、參與血管腔血栓形成和影響動脈粥樣硬化，通過直接作用或催化NETs形成，促進(jìn)病理性免疫性反應(yīng)形成，從而參與SLE、RA、MS等自身免疫性疾病的發(fā)病過程。目前對于PAD4的研究還處于起步階段，大部分研究為實(shí)驗(yàn)性研究，關(guān)于PAD4的詳細(xì)作用機(jī)制及其促進(jìn)NETs形成的具體途徑尚未完全明確，有待進(jìn)行深入研究。PAD4在心血管疾病、腫瘤疾病的作用將是研究的熱點(diǎn)，PAD4可能成為開發(fā)新一代治療心血管疾病、腫瘤和自身免疫性疾病藥物的新靶酶。