牙髓干細(xì)胞來源條件培養(yǎng)基促進(jìn)組織修復(fù)與再生的研究進(jìn)展

秦 杰，王曉春

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科，哈爾濱 150001)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)不僅具有自我更新能力，還具有分化成多種細(xì)胞系的潛能，可從骨髓、脂肪組織、外周血、牙髓等成體組織以及胎盤、臍血、臍帶等圍生期組織中分離[1-3]。骨髓是臨床最常應(yīng)用的MSCs來源，但采集過程痛苦且具有侵襲性，而牙髓的侵入性較低，逐漸成為MSCs的來源。牙髓為結(jié)締組織，是組織再生的最佳選擇。每個牙髓都可以提供大量的牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)，其獲取方便，且適合低溫保存。

MSCs的治療潛力在很大程度上取決于細(xì)胞外環(huán)境中分子和因子的釋放，包括具有旁分泌活性的可溶性因子(蛋白質(zhì)、核酸、脂類)和胞外囊泡[4]。從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 中提取的可溶性因子在再生醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的研究和應(yīng)用。胞外囊泡也逐漸引起越來越多的關(guān)注，可分為凋亡體、微粒子和外泌體[5-6]。有證據(jù)表明，胞外囊泡主要負(fù)責(zé)MSCs的再生，并保留了其母細(xì)胞的歸巢特性[7]。DPSCs胞外囊泡主要存在于DPSCs條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)中?，F(xiàn)就DPSCs-CM促進(jìn)組織修復(fù)與再生的研究進(jìn)展予以綜述。

1 DPSCs

DPSCs具有高增殖潛能，可從附著于塑料培養(yǎng)皿的牙髓組織碎片中分離并擴(kuò)增，并可在不中斷細(xì)胞增殖的情況下轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)皿。人血小板提取物是臨床大規(guī)模制造擴(kuò)增DPSCs的最佳生長補(bǔ)劑。目前，DPSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：①具有依附性；②具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的能力；③在體外表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)志物(CD29、CD90、CD105、CD73和CD44)，但不表達(dá)造血譜系標(biāo)志物(CD14、CD34、CD45)[8]。DPSCs屬于MSCs，可分化為神經(jīng)外胚層細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成牙細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等中胚層來源細(xì)胞，可見，DPSCs具有可塑性[3]。有研究證明，與BMSCs相比，DPSCs的增殖和礦化誘導(dǎo)能力較大[2]。因此，DPSCs在組織再生療法中的廣泛應(yīng)用成為研究的熱點(diǎn)。

2 DPSCs-CM

DPSCs外環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的釋放決定了其治療的潛能，其營養(yǎng)物質(zhì)主要存在于CM中，主要包含大量的細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子以及細(xì)胞外囊泡。與細(xì)胞治療相比，DPSCs-CM不僅可促進(jìn)組織的修復(fù)與再生，還具有高特異性、無細(xì)胞毒性和低免疫原性的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了細(xì)胞治療的缺陷，有望成為代替DPSCs的治療新手段。

2.1DPSCs-CM與牙齒組織損傷 齲病和牙髓病是常見的口腔疾病。對于不可逆性牙髓病主要采用根管治療術(shù)，其主要目的是去除和控制感染。但由于失去了牙髓組織的營養(yǎng)供應(yīng)，根管治療術(shù)后的牙體組織變脆易導(dǎo)致牙體折裂，還可出現(xiàn)牙齒變色影響美觀等現(xiàn)象。因此，DPSCs-CM的作用顯得尤為重要。

DPSCs-CM可促進(jìn)成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、DPSCs等細(xì)胞的增殖和遷移，其作用效果較BMSCs-CM和脂肪干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ASCs)-CM顯著[9-11]。Hayashi等[12]比較DPSCs-CM、BMSCs-CM和ASCs-CM的再生能力的研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs-CM誘導(dǎo)再生組織的區(qū)域更多，再生區(qū)域的細(xì)胞密度更大，其促進(jìn)作用可隨細(xì)胞微環(huán)境的變化而變化。Nakayama等[9]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子處理的DPSCs-CM對細(xì)胞遷移、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡、內(nèi)皮分化和神經(jīng)突延長均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用?；瘜W(xué)試劑乙二胺四乙酸與DPSCs-CM結(jié)合可增強(qiáng)細(xì)胞增殖和遷移以及成牙細(xì)胞的分化能力，并強(qiáng)調(diào)了DPSCs-CM對成牙細(xì)胞分化的有益作用[10]。DPSCs-CM中高水平的細(xì)胞因子(如神經(jīng)營養(yǎng)素-3和骨形態(tài)發(fā)生蛋白)的促進(jìn)作用可以參與成牙細(xì)胞分化[13]。DPSCs向成牙細(xì)胞分化過程中，神經(jīng)營養(yǎng)素-3的表達(dá)上調(diào)，可加速牙髓細(xì)胞的分化[14-15]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是發(fā)育過程的多效功能轉(zhuǎn)化生長因子，可促進(jìn)成牙細(xì)胞分化[16]。Huang等[17]指出，體內(nèi)DPSCs-CM對成牙細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用，尤其是DPSCs-CM中的外泌體。外泌體由DPSCs分泌，參與細(xì)胞間通訊以及受損組織的保護(hù)和再生[18]。對異位牙移植模型的研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)DPDCs誘導(dǎo)組相比，DPSCs-CM來源外泌體組的牙源性分化基因(牙本質(zhì)涎磷蛋白)的表達(dá)更強(qiáng)烈[17]。綜上所述，與BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM在牙胚細(xì)胞分化方面的效率更高，為DPSCs-CM在牙組織再生方面的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。

2.2DPSCs-CM與血管疾病 新血管生成和缺血范圍是評估缺血類疾病危險性的主要因素。目前，治療缺血性疾病的方法較多，但尚未找到有效的治療方法。DPSCs-CM可以對內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，與BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM的抗凋亡能力較強(qiáng)，此抗凋亡能力可應(yīng)用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞[9,19-20]。DPSCs-CM主要通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化或管狀網(wǎng)絡(luò)形成來誘導(dǎo)肌細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞的血管生成，這種血管生成的刺激主要與CM中血管生成因子[如單核細(xì)胞趨化因子-1、血管內(nèi)皮生長因子、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-8、胰島素樣生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、粒細(xì)胞集落刺激因子]的存在有關(guān)[21-22]。將注射DPSCs-CM的離體牙根移植入裸鼠皮下的體內(nèi)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與注射BMSCs-CM和ASCs-CM的離體牙組相比，DPSCs-CM可促進(jìn)更多新生血管的形成[12]。Iohara等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs-CM可使大鼠后肢缺血區(qū)域的血流增加，并形成高密度血管。綜上所述，DPSCs-CM可促進(jìn)血管新生和減少缺血，對心血管和缺血性疾病發(fā)揮積極作用。

2.3DPSCs-CM與骨關(guān)節(jié)疾病 肌肉骨骼和骨關(guān)節(jié)疾病可影響患者的日常生活，但目前尚未找到有效的治療方法[23]。關(guān)節(jié)炎癥疾病(如關(guān)節(jié)炎)的對癥治療(服用消炎藥物)會引起許多不良反應(yīng)，DPSCs-CM所包含的調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境的因子可有效治療關(guān)節(jié)炎癥。

體外DPSCs-CM可促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化表型轉(zhuǎn)換，使其處于M2型巨噬細(xì)胞抗炎狀態(tài)。在DPSCs-CM處理的細(xì)胞中，M1型巨噬細(xì)胞的特異性基因(如腫瘤壞死因子、IL-1、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-9)表達(dá)下調(diào)，而M2型巨噬細(xì)胞的特異性基因(精氨酸酶-1和缺氧誘導(dǎo)分化因子-1)表達(dá)上調(diào)[24]。DPSCs-CM具有誘導(dǎo)抗炎環(huán)境的能力，可增加IL-10的表達(dá)[25]。此外，DPSCs-CM還具有成骨分化的潛能，可用于骨缺損(如骨不連)的再生。Alkharobi等[26]發(fā)現(xiàn)，DPSCs-CM中的生長因子可使DPSCs分化為成骨樣細(xì)胞，并檢測到胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3兩種特異性因子的存在。DPSCs分化為成骨樣細(xì)胞后，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2表達(dá)水平升高，而胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3表達(dá)水平降低，可見，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3以及DPSCs-CM均參與了DPSCs分化的調(diào)控。Ma等[27]通過細(xì)胞年齡對DPSCs-CM性能影響的研究發(fā)現(xiàn)，幼年DPSCs-CM誘導(dǎo)的成年供體DPSCs增殖增強(qiáng)，但成骨分化能力下降；而成年DPSCs-CM誘導(dǎo)的幼年供體DPSCs增殖減弱，但成骨分化能力增強(qiáng)。由此可見，DPSCs-CM對減少與骨關(guān)節(jié)疾病有關(guān)的組織破壞和誘導(dǎo)新的成骨組織形成有重要的作用，可為肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)疾病的治療提供新的選擇。

2.4DPSCs-CM與神經(jīng)疾病 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種類很多，如神經(jīng)退行性疾病(帕金森病、阿爾茨海默病)、周圍神經(jīng)損傷、缺血性腦損傷等，但目前尚無有效的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。一項體外研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs-CM可誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，并招募神經(jīng)元細(xì)胞，可將DPSCs-CM的治愈能力用于腦再生治療方法的開發(fā)[28]。

在阿爾茨海默病的體外模型中，DPSCs-CM通過抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡，提高細(xì)胞活力，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[29]。DPSCs-CM可以使神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤因子-2 (一種抗凋亡蛋白)的表達(dá)顯著升高，凋亡啟動子蛋白表達(dá)顯著降低。有研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs-CM含有腦啡肽酶，能夠降解誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的β-淀粉樣肽[29]。與BMSCs-CM和ASCs-CM相比，DPSCs-CM中可以檢測到更多的神經(jīng)保護(hù)因子、血管內(nèi)皮生長因子和抗凋亡因子。DPSCs-CM提供的神經(jīng)保護(hù)環(huán)境可為腦缺血提供神經(jīng)保護(hù)治療。Song等[30]對缺氧缺血性腦損傷體外模型的研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs-CM可通過減少反應(yīng)性膠質(zhì)化和促炎細(xì)胞因子(IL-1β)的表達(dá)，對星形膠質(zhì)細(xì)胞起保護(hù)作用，但BMSCs-CM并未引起類似的結(jié)果。此外，DPSCs-CM可通過抑制IL-1β和激活I(lǐng)L-10的表達(dá)產(chǎn)生抗炎作用，并伴隨行為測試的顯著恢復(fù)，表明DPSCs-CM可改善損傷的腦部功能。周圍神經(jīng)損傷的體外模型的研究也報道了DPSCs-CM的神經(jīng)保護(hù)作用。Yamamoto等[31]對移植入DPSCs的大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型的研究發(fā)現(xiàn)，有髓纖維可在移植缺損處再生，但DPSCs并未直接分化為施萬細(xì)胞表型，而是在施萬細(xì)胞附近定位誘導(dǎo)多種營養(yǎng)因子(如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子)，營養(yǎng)因子使施萬細(xì)胞凋亡減少，促進(jìn)軸突再生以及血管生成。Mead等[32]對視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷體外模型的研究顯示，與BMSCs-CM或ASCs-CM相比，DPSCs-CM可保護(hù)神經(jīng)，并可促進(jìn)由神經(jīng)保護(hù)因子和促血管生成因子介導(dǎo)的神經(jīng)生成。

綜上所述，與BMSCs-CM、ASCs-CM等相比，DPSCs-CM含有較多的神經(jīng)保護(hù)因子和促血管生成因子。DPSCs-CM在阿爾茨海默病、帕金森病、缺氧缺血性腦損傷、周圍神經(jīng)損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組織保護(hù)和再生中起主導(dǎo)作用，為神經(jīng)損傷類疾病的治療提供了新的思路[29-30]。

2.5DPSCs-CM與實(shí)體器官衰竭 實(shí)體器官(肝臟或肺臟)衰竭可導(dǎo)致機(jī)體功能衰竭，常危及生命。衰竭器官的功能細(xì)胞由纖維化組織取代，并與炎癥反應(yīng)相關(guān)，因此，抑制炎癥是治療的關(guān)鍵因素。

與BMSCs-CM相比，DPSCs-CM可以促進(jìn)肝細(xì)胞增殖并清除慢性炎癥。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶與肝功能顯著相關(guān)。與其他器官相比，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶在肝臟中表達(dá)水平更高，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與肝臟活動有關(guān)，而堿性磷酸酶與細(xì)胞增殖有關(guān)。血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平升高是肝細(xì)胞破膜釋放酶的重要標(biāo)志。Kumar等[33]對DPSCs-CM和BMSCs-CM中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，3種酶在DPSCs-CM中的檢測結(jié)果較高，并可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。DPSCs-CM可誘導(dǎo)抑制纖維化標(biāo)志物(如α-平滑肌肌動蛋白)的表達(dá)，并可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎表型向抗炎表型轉(zhuǎn)化來減少纖維化，同時還可抑制促炎細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子-α、IL-1β)的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了受損組織的再生[34]。生長阻滯特異性蛋白-6與肝再生有關(guān)，其存在于DPSCs-CM中，但不存在于BMSCs-CM中，故BMSCs-CM中未觀察到以上反應(yīng)。由此可見，DPSCs-CM旁分泌機(jī)制對實(shí)體器官纖維化具有重要的治療作用，DPSCs-CM可能成為治療肝臟或臟肺等實(shí)質(zhì)器官衰竭的有效工具。

2.6DPSCs-CM與糖尿病 糖尿病是機(jī)體胰島素作用或分泌受損而引起的慢性代謝性疾病。使用分化的干細(xì)胞或胰島β細(xì)胞移植來補(bǔ)充丟失的產(chǎn)胰島素細(xì)胞，可能是替代傳統(tǒng)胰島素治療糖尿病的新方法[35]。此外，糖尿病常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，如周圍神經(jīng)病變、血管病變。手術(shù)治療是目前糖尿病并發(fā)癥的主要治療方法。

DPSCs不僅具有向胰島樣聚集物分化的能力，還可以葡萄糖依賴的方式釋放胰島素[36-37]。DPSCs-CM可通過對胰島β細(xì)胞的保護(hù)和增殖作用促進(jìn)胰島素分泌，并減少細(xì)胞死亡，改善體外糖尿病模型的高血糖狀態(tài)，可見，DPSCs-CM對胰島β細(xì)胞的生存和功能都有影響[38]。Kanafi等[39]的研究證實(shí)，DPSCs-CM可使小鼠血糖達(dá)到正常水平。大量研究證明，DPSCs可通過旁分泌作用分泌神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子，有助于減少糖尿病導(dǎo)致的周圍神經(jīng)病變和血管病變[19,31-32]。

DPSCs-CM治療較DPSCs移植治療的不良反應(yīng)少，且不需要使用免疫抑制劑，可見DPSCs-CM是一種更安全、侵入性更小的治療糖尿病的方法，其治療效果較BMSCs-CM更明顯。但是，DPSCs-CM治療糖尿病的具體臨床作用機(jī)制和有效性仍有待進(jìn)一步的研究。

3 小 結(jié)

DPSCs較其他組織來源的MSCs具有巨大的優(yōu)勢?？谇唤M織分離的MSCs來源于胚胎，是神經(jīng)嵴源性細(xì)胞[40-41]。DPSCs可分化為中胚層，也可分化為非中胚層組織細(xì)胞(神經(jīng)源細(xì)胞、肌源細(xì)胞、角化細(xì)胞、肝細(xì)胞、黑素細(xì)胞)，并表現(xiàn)出神經(jīng)功能[3]。MSCs-CM進(jìn)一步發(fā)揮了MSCs的再生誘導(dǎo)能力，DPSCs-CM也受到了廣泛關(guān)注。DPSCs-CM在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的組織修復(fù)和再生具有巨大的應(yīng)用潛力，其優(yōu)越性將成為無細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)的新標(biāo)準(zhǔn)，并成為修復(fù)組織缺損與再生的新手段，期待DPSCs-CM的進(jìn)一步臨床研究和應(yīng)用為再生醫(yī)學(xué)做出貢獻(xiàn)。