芥菜種質資源分子聚類分析

宋慧，任錫亮，張香琴

(寧波市農業(yè)科學研究院蔬菜研究所 寧波市瓜菜育種重點實驗室,浙江 寧波 315040)

芥菜(Brassicajuncea)是十字花科蕓薹屬草本植物，是全國各地普遍栽培的常用蔬菜，特別是南方地區(qū)，芥菜是當?shù)氐奶厣Y源和支柱型產業(yè)，對增加當?shù)剞r民的經(jīng)濟收入有重要作用。同時，我國是芥菜的原產地，擁有1 000多份各具特色的芥菜種質[1]，這為培育豐產優(yōu)質、成熟期短、抗病蟲、耐逆、適應性強的優(yōu)質芥菜品種提供了豐富的育種材料[2-3]。旦巴等[4-6]和宋偉林等[7]先后利用隨機擴增多態(tài)性DNA(polymerase chain reaction，RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)和相關序列擴增多態(tài)性(sequence—related amplified polymorphism，SRAP)等標記對西藏地區(qū)野生芥菜資源進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)西藏特殊的地理環(huán)境和復雜的地貌使得當?shù)刭Y源變異豐富，分子聚類結果與種質地理位置密切相關。蒲曉斌等[8]和徐愛遐等[9]對我國西南、西北、西部及北部地區(qū)芥菜資源和品種進行資源評估，聚類結果遵循地理和生態(tài)環(huán)境規(guī)律，為芥菜種質資源搜集提供了依據(jù)。喬愛民等[10]和陳發(fā)波等[11]研究表明，芥菜變種間存在遺傳多樣性，并呈現(xiàn)地域分布規(guī)律。

寧波市農業(yè)科學研究院自開展芥菜遺傳育種以來，除了搜集江浙一帶農家品種，還引進大量芥菜資源，經(jīng)過歷年繁育配組，材料品目繁多、來源模糊、表型鑒定工作繁重，極不利于親本選配。曾川等[12]在對三峽庫區(qū)芥菜品種聚類分析后，認為試驗材料來源比較狹窄或者模糊的情況下，分子標記能夠更準確地區(qū)分材料間遺傳距離。本研究利用分子標記技術對寧波市農業(yè)科學研究院芥菜種質資源進行聚類分析，梳理材料間親緣關系，為進一步鑒定和利用種質材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

寧波市農業(yè)科學研究院蔬菜研究所十字花科課題組保存的41份優(yōu)質特異芥菜種質資源。

1.2 DNA提取

取芥菜幼葉，利用CTAB法提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸濃度測定儀(K5600)檢測DNA濃度和質量，要求電泳條帶清晰無彌散，A260/280為1.7～1.8。

1.3 RAPD和SSR擴增與檢測

RAPD引物參考蒲曉斌等[8]，SSR引物參考巴旦等[6]和陳發(fā)波等[11]報道的序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用康為世紀生物科技有限公司2×TaqMasterMix(Day)PCR混合液，按照說明書調整反應體系為10 μL：5 μL 2×TaqMasterMix(Day)、0.4 μL引物(5 mmol·L-1)、1 μL DNA(10 ng·μL-1)，加ddH2O至10 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，37 ℃(RAPD)/55 ℃(SSR) 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。RAPD和SSR的PCR產物分別用1%普通瓊脂糖凝膠和2%MS-6高分辨率瓊脂糖凝膠(Takara)電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增產物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果，統(tǒng)計條帶清晰、樣品間有多態(tài)性的位點，相同遷移位點擴增出條帶的記為“1”，無條帶記為“0”，建立0和1矩陣。計算標記多態(tài)信息量，利用NTSYS-pc2.10e軟件處理數(shù)據(jù)，繪制聚類圖。多態(tài)性比例=(多態(tài)性位點/擴增位點)×100%。

2 結果與分析

2.1 差異引物的多態(tài)性

試驗共使用48個RAPD和98對SSR標記，分別擴增395和462個位點，平均每個引物擴增8.2和4.7個條帶。篩選到8個RAPD和10個SSR差異引物，在41份芥菜種質中擴增出30個多態(tài)性位點，2種標記的多態(tài)性比例分別為3.04%和3.90%，SSR標記多態(tài)性比RAPD的高(表1，圖1)。

表1 RAPD和SSR標記在41份芥菜種質中的多態(tài)性

圖1 SSR引物在41份芥菜材料中的擴增

2.2 41份芥菜種質聚類

通過計算41份材料間的遺傳相似系數(shù)繪制聚類圖，結果(表2，圖2)表明，材料間遺傳相似系數(shù)為0.31～1.00，以0.78為閾值，可以將供試材料分作9種類型。其中，第Ⅲ類包含芥菜種質最多，有16份，第Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ類分別只包含1份芥菜，其他各類包含2～7個芥菜材料。第Ⅸ類與第Ⅰ類遺傳距離最遠，差別最大；第Ⅸ類中的9號材料與其他各類相似系數(shù)均較小(0.56～0.62)，是41份芥菜材料中差異最大的材料，9號與第Ⅰ類37號相似系數(shù)最小(0.31)、遺傳距離最大。根據(jù)分析結果，可以選擇不同類型、遺傳相似系數(shù)小的芥菜相互配組，利用雜種優(yōu)勢選育品種。

表2 供試41份芥菜種質聚類結果

圖2 41份芥菜種質材料的聚類

3 小結

遺傳多樣性是反映育種材料遺傳變異的重要指標[13]，遺傳多樣性豐富，說明種質類型多樣，遺傳差異較大，在品種選育及改良中有更多可選擇和利用的基因。利用聚類分析明確作物種質資源的遺傳多樣性及其變化趨勢，有助于正確選擇親本，較好地利用種質資源。分子標記技術在芥菜品種親緣關系[14-17]和種質遺傳多樣性[18-19]分析中應用廣泛。陳發(fā)波等[11]利用SSR標記檢測到16份芥菜變種間的遺傳相似系數(shù)為0.41～0.75，平均值為0.6，說明芥菜變種間存在一定的遺傳多樣性；Qi等[20]利用40對AFLP引物對中國芥菜16個變種的親緣關系進行分析，其遺傳相似系數(shù)為0.63～0.88。本試驗利用RAPD和SSR引物檢測到41份芥菜種質間遺傳相似系數(shù)為0.31～1.00，材料間遺傳變異較豐富，說明寧波市農業(yè)科學研究院近年來搜集引進的芥菜種質差異較大，蘊含豐富的遺傳基因。在實際應用中，4、13、14和28等4份材料，由于收集的時間、地點和獲得途徑不同，雖然外觀表型相似，但不能完全確定是否是同一個材料，對用作親本一直存在疑慮。本實驗將這4份材料聚為一類，有效地解決了這個問題，如此可以避免使用同類材料配組，減少育種消耗。此外，我們選擇14號轉育成的雄性不育系為母本，分別與來自不同類群的8號和11號雜交，育成了甬雪3號[浙(非)審蔬2012008]和甬雪4號[浙(非)審蔬2014002]雪里蕻。這2個品種表現(xiàn)生長勢強、產量高、抗病毒病，雜種優(yōu)勢非常明顯，顯示了根據(jù)聚類結果選配親本的優(yōu)勢。甬雪3號和甬雪4號雪里蕻雜交新品種的推廣應用，受到了種植基地的歡迎。