貝類樣品砷含量的測(cè)定方法

孟慶輝，黎飛，何輝，周翔

(浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 310023)

砷(As)是自然界廣泛存在的有毒非金屬元素，易通過(guò)水、食物等途徑被人體攝入[1]。作為國(guó)際癌癥研究所(IARC)等權(quán)威機(jī)構(gòu)公認(rèn)的人類致癌物，無(wú)機(jī)砷進(jìn)入人體能夠?qū)δc胃道、肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性，具有致畸或致突變效應(yīng)[2]。砷元素毒性不僅與含量有關(guān)，還與形態(tài)相關(guān)。無(wú)機(jī)砷毒性遠(yuǎn)大于有機(jī)砷，砷與有機(jī)基團(tuán)結(jié)合越多，毒性越小。一般砷化物毒性：亞砷酸(As Ⅲ)>砷酸(As Ⅴ)>一甲基砷酸(MMA)>二甲基砷酸(DMA)>砷甜菜堿(AsB)>砷膽堿(AsC)，此外還有砷糖、砷脂等[3]。

海產(chǎn)品是人們?nèi)粘Ｉ钪惺称返闹匾M成部分。海產(chǎn)品，特別是貝類，砷元素含量較高。不少研究表明，海產(chǎn)品貝類等的砷主要是毒性較小的有機(jī)砷，且基本以砷甜菜堿和砷膽堿形式存在，也存在一些結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的砷糖、砷脂類化合物等[4-5]。在砷形態(tài)含量分析方面，高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)由于靈敏度高、分離效果好，而得到大面積應(yīng)用。貝類樣品的HPLC-ICP-MS檢測(cè)前處理過(guò)程，一般采用甲醇-水提取體系，但貝類樣品中含有大量的脂肪，而脂肪是疏水性化合物，而且有機(jī)態(tài)砷又分為水溶性砷和脂溶性砷；因此，在砷形態(tài)分析過(guò)程中，如何有效提取不同形態(tài)的砷，并保持其化學(xué)形態(tài)不變，是砷形態(tài)檢測(cè)分析的關(guān)鍵。本文對(duì)HPLC-ICP-MS檢測(cè)貝類樣品砷形態(tài)的前處理過(guò)程進(jìn)行分析，并對(duì)浙江沿海貝類砷含量及砷的存在形態(tài)等問(wèn)題進(jìn)行初步討論。

1 材料與方法

1.1 材料

泥蚶(Tegillarcagranosa)、貽貝(Mytilusedulis)、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、青蛤(Cyclinasinensis)、彩虹明櫻蛤(學(xué)名虹光亮櫻蛤，Moerellairidescens)、香螺(NeptuneacumingiCrosse)、東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)等7種浙江沿海常見(jiàn)貝類，采集于臺(tái)州三門、溫嶺，溫州平陽(yáng)、樂(lè)清等地。

濕樣采集后，冷藏保存，到實(shí)驗(yàn)室后立即取肉，利用不含重金屬的勻漿機(jī)勻漿，-20 ℃保存。干樣由樣品真空濃縮冷凍干燥機(jī)制取，取足夠多的濕樣樣品，放在冷凍干燥機(jī)中干燥，徹底去除水分后，研磨杵研磨成粉狀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

一甲基砷(MMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08669)、二甲基砷(DMA)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08668)、砷甜菜堿(AsB)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08670)、砷膽堿(AsC)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08671)、砷酸根(As5+)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08667)、亞砷酸根(As3+)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08666)等，采購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。阿散酸(ASA)標(biāo)準(zhǔn)品(證書(shū)編號(hào)cas：98-50-0)、硝苯砷酸(NS)標(biāo)準(zhǔn)品(證書(shū)編號(hào)cas：98-72-6)、洛克沙(RxS)標(biāo)準(zhǔn)品(證書(shū)編號(hào)cas：121-19-7)等，采購(gòu)自DR.Ehrenstorfer公司。扇貝成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10024)采購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。硝酸(優(yōu)級(jí)純)采購(gòu)自蘇州晶瑞，甲醇(色譜級(jí))采購(gòu)自美國(guó)TEDIA。0.45 μm過(guò)濾柱(津隆牌)采購(gòu)自天津科億實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

Milli Q Advantage A10超純水儀，上?？茖?dǎo)SK-15GT超聲儀，德國(guó)賽多利斯 BS210S電子天平，美國(guó)Beckman Coulter Allegra X-12離心機(jī)，屹堯科技Preekem TOPEX微波消解儀，屹堯科技Preekem G-400趕酸儀，美國(guó)LABCONCO真空濃縮冷凍干燥機(jī)，Thermo Fisher iCAP Qc ICP-MS，戴安U-3000 HPLC。

1.2 砷萃取

為測(cè)定貝類樣品中砷的元素形態(tài)，針對(duì)貝類樣品特點(diǎn)，采用5種前處理方法：方法1，以超純水作為提取劑，稱取樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入40 mL的超純水混勻后，超聲萃取1 h，8 000 r·min-1離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜于5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置10 min，取上清液上機(jī)分析；方法2，以超純水、甲醇體積比1∶2溶液作為提取劑，稱取樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入15 mL的超純水、30 mL的甲醇溶液混勻后，超聲萃取1 h，8 000 r·min-1離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜于5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置10 min，取上清液上機(jī)分析；方法3，以超純水、甲醇體積比1∶1溶液作為提取劑，稱取樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入20 mL的超純水、20 mL的甲醇溶液混勻后，超聲萃取1 h，8 000 r·min-1離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜于5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置10 min，取上清液上機(jī)分析；方法4，以超純水、甲醇體積比2∶1溶液作為提取劑，稱取樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入30 mL的超純水、15 mL的甲醇溶液混勻后，超聲萃取1 h，8 000 r·min-1離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜于5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置10 min，取上清液上機(jī)分析；方法5(對(duì)照)，以超純水、乙酸體積比19∶1溶液作為提取劑，稱取樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入38 mL的超純水、2 mL 3%乙酸溶液混勻后，超聲萃取1 h，8 000 r·min-1離心30 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜于5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置10 min，取上清液上機(jī)分析。

1.3 貝類中總砷含量分析

采用微波消解法[6]測(cè)定樣品中總砷。稱取1.0 g樣品于消解罐中，加入5 mL硝酸、1 mL過(guò)氧化氫。將消解罐放入微波消解系統(tǒng)中消解，消解完全后趕酸，待酸霧消失、消解液剩余約0.5 mL后，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL比色管中，用超純水清洗數(shù)次消解罐，合并液體到比色管中，定容到50 mL，搖勻后靜置。同時(shí)，做空白及扇貝質(zhì)控。用ICP-MS測(cè)定溶液中總砷的含量。

采用濕法消解測(cè)定樣品中總砷。稱取1.0 g樣品于聚四氟乙烯管中，加入15 mL硝酸、4 mL高氯酸、1.25 mL硫酸，靜置3 h，放在電熱板上200 ℃加熱，待樣品殘?jiān)馔耆?，繼續(xù)加熱直至酸霧散盡，繼續(xù)加熱趕酸，定容到50 mL比色管中。同時(shí)，做空白及扇貝質(zhì)控。用ICP-MS測(cè)定溶液中總砷的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及初步分析，運(yùn)用SPSS 16.0做單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝類總砷含量

如表1所示，微波消解法測(cè)定的7種貝類總砷含量為2.21～8.77 mg·kg-1，不同種類的貝類總砷含量差別較大。東風(fēng)螺總砷含量最高，其次是香螺、縊蟶和泥蚶，而彩虹明櫻蛤、貽貝等品種總砷含量較低。濕法消解測(cè)定的7種貝類總砷含量為3.59～14.25 mg·kg-1，相對(duì)含量次序與微波消解法一致。

表1 微波消解和濕法消解測(cè)定的貝類總砷含量 mg·kg-1

實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了扇貝成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中總砷含量，濕法消解測(cè)定含量為4.1 mg·kg-1，微波消解測(cè)定含量為3.04 mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)值為(3.6±0.6)mg·kg-1。整體來(lái)看，兩種方法的測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)，但微波消解法測(cè)定的含量略低。

2.2 不同萃取方法的砷含量

如表2所示，不同前處理方法對(duì)不同貝類的萃取效率不同：縊蟶、貽貝、泥蚶、彩虹明櫻蛤、香螺、東風(fēng)螺等用方法2做前處理時(shí)萃取效率最高，青蛤用方法3做前處理時(shí)萃取效率最高。整體來(lái)看，方法2和方法3的萃取效率較高，方法1與方法5的萃取效率較低。7種貝類添加甲醇提取的前處理方法(方法2～4)測(cè)定的砷元素含量，除香螺方法3外，均高于微波消解和濕法消解。另外，7種貝類最高萃取效率下測(cè)定的砷含量由高到低依次為東風(fēng)螺>泥蚶>香螺>縊蟶>青蛤>貽貝>彩虹明櫻蛤，與7種貝類砷消解含量次序不一致。

表2 不同前處理方法測(cè)定的貝類砷含量 mg·kg-1

2.3 貝類樣品中砷形態(tài)

利用HPLC-ICP-MS測(cè)定貝類樣品中砷主要成分，縊蟶、貽貝等貝類樣品砷主要成分為砷甜菜堿，此外還有少量的二甲基砷、砷膽堿、硝苯砷酸等，無(wú)機(jī)砷含量較低(圖1和2)。與其他研究結(jié)果相近[5,7-8]。

圖1 縊蟶砷形態(tài)分析

圖2 貽貝砷形態(tài)分析

3 小結(jié)與討論

不同貝類的總砷含量存在差異，在環(huán)境中對(duì)砷的吸收、排泄和富集能力亦不同。本次測(cè)定的7種貝類，東風(fēng)螺、香螺、縊蟶、泥蚶等總砷含量較高，貽貝、彩虹明櫻蛤、青蛤等總砷含量相對(duì)低一些。這可能與其養(yǎng)殖和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。鐘碩良[9]研究指出，福建沿海灘涂養(yǎng)殖底棲貝類總砷平均含量要高于淺海筏式養(yǎng)殖的貝類。不同生長(zhǎng)環(huán)境下，不同貝類濾水?dāng)z食及體內(nèi)富集情況不同，會(huì)導(dǎo)致不同貝類體內(nèi)總砷含量存在差異。在消解過(guò)程中，可能是由于不同貝類樣品基質(zhì)有差別，在同樣消解方法中，總砷消解率并不相同。

貝類砷形態(tài)主要以有機(jī)砷砷甜菜堿(AsB)為主，砷甜菜堿是貝類樣品中砷最主要的存在形式。Cullen等[10]認(rèn)為，砷甜菜堿化學(xué)性質(zhì)屬于惰性，無(wú)毒且能夠被迅速排泄，不會(huì)對(duì)人體造成傷害。在貝類砷元素研究和評(píng)價(jià)過(guò)程中，區(qū)分出無(wú)機(jī)砷和有機(jī)砷化合物，區(qū)分出有毒的砷形態(tài)(如三價(jià)砷、五價(jià)砷)與無(wú)毒的砷膽堿、砷甜菜堿、砷糖等具有重要意義。

甲醇-水是海產(chǎn)品中運(yùn)用最廣的砷萃取方法，甲醇、水體積比1∶1是應(yīng)用最多的組合，這種處理方法不改變?cè)猩榈男螒B(tài)，可避免不同形態(tài)砷轉(zhuǎn)化帶來(lái)的測(cè)定偏差。但結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，這一比例并不

是除青蛤外其他6種貝類砷形態(tài)分析的最優(yōu)前處理方法，對(duì)于縊蟶、貽貝、泥蚶、彩虹明櫻蛤、香螺、東風(fēng)螺等，超純水、甲醇體積比1∶2才是萃取效率最高的方法。用甲醇-水體系進(jìn)行ICP-MS分析時(shí)，由于電感耦合等離子體質(zhì)譜對(duì)有機(jī)溶劑進(jìn)樣含量要求比較低，需要對(duì)提取液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮或者進(jìn)行一定比例的稀釋才能上機(jī)檢測(cè)，這些操作要么過(guò)程比較復(fù)雜，要么會(huì)增加實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差。超純水、水-乙酸體系進(jìn)行樣品提取前處理與甲醇-水體系提取一樣，可以保持砷形態(tài)的一致性，雖然萃取的效率并不很高，但方法簡(jiǎn)單，不需要蒸發(fā)濃縮稀釋等步驟即可直接上機(jī)分析操作。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，可以根據(jù)樣品對(duì)象特征、檢測(cè)分析要求及實(shí)驗(yàn)條件等選擇不同的前處理方法。

在總砷消解測(cè)定結(jié)果上，微波消解貝類總砷測(cè)定值明顯低于濕法消解，且這兩種消解方法整體低于有機(jī)溶液萃取的砷元素含量。主要原因：一是從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，貝類樣品中砷存在的主要形式是砷甜菜堿、二甲基砷、砷膽堿等有機(jī)砷，這些有機(jī)砷化合物性質(zhì)穩(wěn)定，不易消解成砷離子；二是這兩種消解方法消解溫度都低于200 ℃，微波消解更是只有185 ℃，而消解復(fù)雜有機(jī)砷化物必須保持消化強(qiáng)度的高氧化性和高沸點(diǎn)，微波消解只用硝酸和過(guò)氧化氫，簡(jiǎn)單的消解酸體系使總砷消解效率進(jìn)一步降低，濕法消解溫度可以達(dá)到200 ℃，且消解酸體系使用高氯酸和硫酸等強(qiáng)氧化劑，因而效果好于微波消解。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，扇貝成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由于是加工后狀態(tài)，且可能在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備過(guò)程中加入的都是無(wú)機(jī)砷，因此在消解過(guò)程中比較容易達(dá)到高的消解效率，這與李慧等[11]研究結(jié)果相同。干法消解過(guò)程中的馬弗爐灰化等步驟能更好地分解包含水分、粗蛋白、脂肪、灰分、沉積物及藻類雜質(zhì)等復(fù)雜貝類樣品，充分解離有機(jī)砷化合物。關(guān)于其在檢測(cè)貝類砷含量方法的效果還有待于進(jìn)一步研究。