山藥糯性基因Waxy的克隆與分析

吳志剛，姜武，魏余煌，陶正明

(1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005； 2.瑞安市農(nóng)林局，浙江 瑞安 325200)

植物淀粉中有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種形態(tài)，淀粉組成形式的不同直接影響作物的品質(zhì)，如籽粒中不含直鏈淀粉或直鏈淀粉含量很低的小麥稱為全糯質(zhì)小麥[1]。在淀粉合成過(guò)程中，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)是控制直鏈淀粉合成的關(guān)鍵基因，催化產(chǎn)生線狀多聚葡萄糖分子，該基因也稱糯蛋白，由Waxy基因編碼[2]。Waxy基因廣泛存在于大麥、小麥、谷子、玉米等作物中，并已被克隆獲得[3]。

研究表明，作物直鏈淀粉含量在不同品系或種質(zhì)之間的差異很大程度上受其所攜帶的Waxy等位基因的影響[4]。例如，在水稻W(wǎng)x基因表達(dá)調(diào)節(jié)規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，水稻直鏈淀粉含量的高低與Wx基因第1內(nèi)含子的剪接效率關(guān)系密切，而Wx基因第1內(nèi)含子的剪接效率與第1內(nèi)含子中+1位置的堿基是G還是T有關(guān)[5]。山藥是我國(guó)重要的旱糧作物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。淀粉是山藥塊莖的重要組成部分，約占其干物質(zhì)的50%～80%[6]。研究山藥Waxy基因的功能及調(diào)控有助于山藥種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育，本研究通過(guò)克隆獲得山藥Waxy基因，以期為加快分子標(biāo)記輔助選育糯性山藥品種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中的山藥來(lái)源于植物參薯(DioscoreaalataL.)的糯性栽培品系(WCS01)，采自浙江省溫州市文成縣峃口鎮(zhèn)，糯性品質(zhì)經(jīng)支鏈淀粉測(cè)定，其支鏈淀粉占總淀粉的比例達(dá)83%。以植株生長(zhǎng)旺盛期新鮮嫩葉作為提取基因組DNA的試材。

TaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶、dNTP、pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司；植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、TOP-10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。引物由生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與Waxy基因克隆

按照試劑盒方法要求，稱取0.2 g山藥葉片，提取純化分離DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA的完整性。

參照NCBI中番茄(NM_001324528.1)、馬鈴薯(NW_006238976.1)、木薯(JF708948.1)以及玉米(HQ423245.1)等物種的Waxy基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列的保守區(qū)域，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物擴(kuò)增山藥Waxy核心序列(表1)。反應(yīng)體系20 μL，其中PremixTaq聚合酶8 μL，4對(duì)上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共28個(gè)循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR產(chǎn)物連接入pGM-T Vector，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌TOP-10感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆菌液送交生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

表1 本研究中所用的PCR擴(kuò)增引物

1.2.2 山藥Waxy末端序列的克隆

根據(jù)1.2.1節(jié)中獲得的Waxy序列，設(shè)計(jì)10條通用引物序列，并在已知末端設(shè)計(jì)3條嵌套的反向特異下游引物(表1)。采用交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)的上游隨機(jī)簡(jiǎn)并引物AD1-10依次與WAXY-S1、WAXY-S2、WAXY-S3配對(duì)進(jìn)行連續(xù)3輪的TAIL-PCR擴(kuò)增。第1輪反應(yīng)體系為20 μL：PremixTaq聚合酶10 μL，WAXY-S1引物1 μL，AD1-10 4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)結(jié)束后，將一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋500倍用于WAXY-S2引物和AD1-AD10二輪擴(kuò)增，體系如上。將二輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋500倍用于WAXY-S3引物和AD1-AD10三輪擴(kuò)增，體系如上。3輪PCR的反應(yīng)條件見(jiàn)表2。反應(yīng)結(jié)束后將TAIL-PCR產(chǎn)物按照1.2.1節(jié)中的方法電泳回收、克隆及測(cè)序。

1.2.3 序列拼接及生物信息分析

根據(jù)1.2.1和1.2.2節(jié)獲得序列，利用sequencher軟件(5.0版)進(jìn)行拼接，獲得山藥Waxy完整序列。將序列在NCBI中進(jìn)行Blast搜索比對(duì)，確定目的基因。依照西紅柿、馬鈴薯、木薯以及玉米等參考序列對(duì)山藥Waxy外顯子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。應(yīng)用Mega(7.0版)軟件對(duì)山藥Waxy及其同源性序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

表2 Waxy末端特異引物的TAIL-PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥Waxy全長(zhǎng)基因的克隆

Waxy基因全長(zhǎng)一般為4 000 bp左右，根據(jù)NCBI上番茄、馬鈴薯、木薯以及玉米等作物設(shè)計(jì)4對(duì)核心引物(表1)，3組重復(fù)的山藥基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在約4 000 bp處具有明顯的條帶(圖1)。通過(guò)測(cè)序并比對(duì)，獲得該基因第1～11號(hào)外顯子以及翻譯起始點(diǎn)前400 bp的序列。由于末端序列保守性較差，為獲得該基因全部序列，我們進(jìn)一步利用3條嵌套式引物(表1)，經(jīng)過(guò)連續(xù)3輪TAIL-PCR擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)序獲得序列與上述核心序列進(jìn)行拼接，獲得山藥Waxy基因序列3 994 bp。該序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站與其他作物同源性在線比對(duì)后，具有高度同源性，確定為山藥的Waxy基因。

圖1 山藥Waxy核心序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 山藥Waxy基因的結(jié)構(gòu)特征

以番茄、馬鈴薯、木薯以及玉米的Waxy基因?yàn)閰⒖夹蛄羞M(jìn)行注釋，結(jié)果顯示，山藥Waxy基因全長(zhǎng)DNA序列中共含有13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，整個(gè)編碼區(qū)1 785 bp。該基因外顯子的長(zhǎng)度變化幅度為64～291 bp，內(nèi)含子的長(zhǎng)度變化幅度為72～153 bp(圖2)。外顯子與內(nèi)含子的剪切都符合GT-AG原則。內(nèi)含子中(A+T)的量為58.86%～72.64%，(G+C)的量為27.16%～39.87%，(A+T)的量顯著高于(G+C)的量，與非編碼區(qū)中較高的(A+T)含量相一致。

圖2 山藥Waxy基因結(jié)構(gòu)特征

2.3 同源性序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用山藥Waxy序列在NCBI核酸比對(duì)結(jié)果顯示，Waxy編碼序列與金縷梅屬(Hamamelis)、銀縷梅屬(Parrotia)植物中的金縷梅(AF248628.1)、北美金縷梅(AF248630.1)、日本金縷梅(AF248626.1)、墨西哥金縷梅(AF248627.1)、銀縷梅(EF456728.1)、白縷梅(EF456727.1)，以及中國(guó)蓮(XM 019199716.1、XM 019198814.1、XM 010253872.2、NM 001302856.1、EU938541.1)和美國(guó)蓮(EU649747.1)，油棕(XM 010942532.2、XM 010942531.2、XM 019855455.1)等物種的序列具有高度相似性，相似度在85%以上。此外，利用Mega系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示(圖3)，山藥Waxy序列單獨(dú)成一支，與油棕親緣關(guān)系較近。與其他物種不能歸為一類，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 山藥Waxy序列進(jìn)化樹(shù)分析

3 小結(jié)與討論

分析鑒定Waxy基因的組成對(duì)作物淀粉品質(zhì)評(píng)價(jià)和遺傳改良具有重要意義。在玉米、水稻、高粱、小麥等作物中，Waxy基因已被克隆，部分成果已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出功能性分子標(biāo)記，用于糯性品種的選育[3]。Hirano等[7]研究表明，水稻中Waxy基因全長(zhǎng)5 499 bp，含有13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子。本研究中，我們創(chuàng)新利用PCR和TAIL-PCR相結(jié)合的方法獲得山藥Waxy序列3 994 bp，含有13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，整個(gè)編碼區(qū)1 785 bp，內(nèi)含子的長(zhǎng)度變化幅度為72～153 bp，與其他物種的Waxy結(jié)構(gòu)類似。進(jìn)化關(guān)系顯示，山藥Waxy基因與蓮、油棕、金縷梅屬和銀縷梅屬植物的同類基因具有高度相似性。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子輔助選擇育種對(duì)加快育種進(jìn)程發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。Waxy基因與直鏈淀粉關(guān)系密切，周屹峰等[8]曾采用直鏈淀粉含量Waxy基因功能性標(biāo)記“484/485”對(duì)13份常用秈型保持系進(jìn)行多態(tài)性鑒定，明確這些材料相應(yīng)分子標(biāo)記譜帶特性，篩選出具有明顯中等直鏈淀粉含量的PCR圖譜帶型優(yōu)質(zhì)保持系。張晶等[9]構(gòu)建Waxy基因分子檢測(cè)的多重PCR體系，鑒定了6個(gè)STS標(biāo)記并用于小麥分子標(biāo)記輔助選擇，大大提高了選育的效率。我國(guó)山藥具有豐富的遺傳多樣性，其淀粉含量變異大[10-11]，因而在山藥Waxy基因鑒定分析基礎(chǔ)上，建立高效的鑒定方法和體系，并應(yīng)用于山藥育種改良和種質(zhì)資源快速評(píng)價(jià)，將具有廣泛的應(yīng)用前景。