干細(xì)胞移植用于周圍神經(jīng)再生的研究進(jìn)展

魏全俠，劉建宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，哈爾濱 150000)

周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNI)主要與創(chuàng)傷、腫瘤和醫(yī)源性病變有關(guān)，可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)神經(jīng)功能缺陷和功能障礙。據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國家每年約有PNI新發(fā)病例18/10萬例，而發(fā)展中國家發(fā)病率相對更高[1-2]。

對于無間隙的神經(jīng)不連續(xù)，一期縫合修復(fù)是首選的治療方法。盡管有良好的無張力神經(jīng)修復(fù)，但其最終功能恢復(fù)狀況，如神經(jīng)生長、神經(jīng)支配區(qū)的感覺及運(yùn)動恢復(fù)情況可能受到炎癥、瘢痕形成以及感覺和運(yùn)動軸突再生方向的限制，再生速度約1 mm/d[3]。對于有間隙的神經(jīng)不連續(xù)，可以自體神經(jīng)移植，但受到所獲取神經(jīng)的.可用性和供體部位發(fā)病率的限制。目前，通常不推薦將各種合成導(dǎo)管和脫細(xì)胞同種異體移植物用于間隙>3 cm的神經(jīng)缺損的修復(fù)[4]。先進(jìn)的生物工程可以重建神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)，但缺乏關(guān)鍵的神經(jīng)導(dǎo)管細(xì)胞成分，特別是對再生至關(guān)重要的施萬細(xì)胞。施萬細(xì)胞通過分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，形成有利于軸突再生的微環(huán)境[5]。施萬細(xì)胞與周圍細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，使髓鞘穩(wěn)定于正常狀態(tài)，并在再生過程中轉(zhuǎn)變?yōu)橛H髓鞘表型[6]。神經(jīng)損傷刺激神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進(jìn)軸突生長[7]。但在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中，短時(shí)間內(nèi)無法獲取足夠的施萬細(xì)胞，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。干細(xì)胞作為類施萬細(xì)胞的來源，可駐留在受損神經(jīng)周圍，并通過改善微環(huán)境以及分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來提供穩(wěn)定的促再生環(huán)境?，F(xiàn)就與促周圍神經(jīng)再生相關(guān)的不同類型干細(xì)胞的特征及其促神經(jīng)再生機(jī)制、細(xì)胞遞送以及每種干細(xì)胞促外周神經(jīng)再生策略的應(yīng)用現(xiàn)狀予以綜述，以期促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域的發(fā)展。

1 干細(xì)胞來源

干細(xì)胞指可分化成特殊細(xì)胞類型，并具有自我更新能力的細(xì)胞[1]。根據(jù)發(fā)育階段的不同，可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞。全能干細(xì)胞可以形成包括胚外組織在內(nèi)的整個(gè)胚胎，多能干細(xì)胞可形成中胚層、內(nèi)胚層和外胚層。單能干細(xì)胞或祖細(xì)胞只能分化成一種特定的細(xì)胞類型，干細(xì)胞的分化潛能與其發(fā)育階段有關(guān)，ESCs分化潛能高，而特定組織干細(xì)胞分化潛能較低，完全分化的體細(xì)胞無分化潛能。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced multiripotent stem cell，iPSC)是一種可以直接從成體細(xì)胞中產(chǎn)生的多能干細(xì)胞[3]。Thomson等[1]發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)更多的胚胎表型。

1.1ESCs ESCs是胚胎發(fā)育囊胚期多能干細(xì)胞，可從中胚層、內(nèi)胚層和外胚層分化成體細(xì)胞，并可應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷的治療。為了替代神經(jīng)再生所需的施萬細(xì)胞，Ziegler等[5]研發(fā)出一種由人類ESCs經(jīng)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生施萬細(xì)胞的方案，其效率約為60%。在大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型中，Cui等[6]通過微注射中性誘導(dǎo)的ESCs顯著改善了軸突再生；免疫染色顯示，ESCs存活并分化為類施萬細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷/修復(fù)時(shí)，將ESCs注射到目標(biāo)肌肉中，可防止肌肉發(fā)生去神經(jīng)化改變，并可促進(jìn)受損神經(jīng)恢復(fù)[7]。ESCs也可產(chǎn)生額外的干細(xì)胞系。ESCs可產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，并已用于臨床前動物模型的研究[8]。ESCs具有形成畸胎瘤的潛在危險(xiǎn)，獲得ESCs的人類胚胎來源有限，且存在倫理問題。

1.2神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs) NSCs能夠分化成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并存在于大腦和脊髓正常組織的神經(jīng)發(fā)生過程中。NSCs可從小鼠模型中分離，并可在體外增殖[9]。有研究報(bào)道，NSCs植入對急性和慢性PNI均有益處[10]。然而，NSCs也有其缺點(diǎn)和局限，動物模型顯示，商業(yè)小鼠C17.2 NSCs的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生率高，限制了其臨床應(yīng)用[11]。NSCs存在于大腦的多個(gè)區(qū)域，但很難從大腦中獲得。此外，特定神經(jīng)細(xì)胞系的定向分化較困難，目前的方法僅在有限的情況下有效，還需大量的實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.1MSCs MSCs最初被認(rèn)為是一種不同于造血系的骨髓內(nèi)多能成纖維細(xì)胞，還可由多種非骨髓來源(脂肪組織、外周血、羊水、臍帶、肌腱和毛囊、牙髓和胎兒組織中)分離獲得。MSCs具有分化潛能，并具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等優(yōu)點(diǎn)，易于分離，在組織再生方面具有重要的研究價(jià)值[12]。MSCs天生具有分化成所有中胚層譜系的能力，如脂肪、骨骼、肌肉和軟骨等[12]。在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下，MSCs可以被誘導(dǎo)分化成非間充質(zhì)譜系，如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、類施萬細(xì)胞等，以支持神經(jīng)再生，促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)[13]。

1.2.2胎兒來源的干細(xì)胞 胎兒組織是MSCs最原始的來源，受年齡、環(huán)境和疾病引起的遺傳損傷較少[14]。此外，MSCs還可以從其他多種來源獲得，羊水、羊膜和臍帶等組織均富含MSCs。胎兒出生后，羊水、羊膜和臍帶等組織一般均被遺棄，故胎兒來源的干細(xì)胞足夠多，且不受倫理的束縛，可在非侵入性操作下大量獲取，使其成為非常理想的用于修復(fù)受損周圍神經(jīng)的干細(xì)胞來源。將獲得的細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其增殖并分化，可分化成神經(jīng)表型，從而促進(jìn)受損周圍神經(jīng)的再生修復(fù)[15]。但目前研究仍處于體外階段，還需進(jìn)一步的探索研究。

1.2.3皮膚來源前體干細(xì)胞(skin-derived precursor stem cells，SKP-SCs) SKP-SCs位于真皮，是體細(xì)胞多能細(xì)胞的有效來源。SKP-SCs除具有持久的增殖能力外，還可分化為多種細(xì)胞類型，包括黑素細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞等[16]。在神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1β中培養(yǎng)的SKP-SCs可與施萬細(xì)胞表達(dá)相同的標(biāo)記[17]。此外，未分化和分化的SKP-SCs均表現(xiàn)出神經(jīng)再生加速作用。SKP-SCs治療可顯著增加平均軸突計(jì)數(shù)，減少髓鞘損傷百分比，促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)再生[18]。多項(xiàng)研究表明，SKP-SCs在脫髓鞘、擠壓損傷以及急慢性橫斷損傷等方面均具有較好的療效[17-19]。

1.2.4毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells，HFSCs) HFSCs起源于神經(jīng)嵴，數(shù)量豐富，較易獲取，具有多向分化能力，在培養(yǎng)過程中容易擴(kuò)增，但不能長期保存。此外，HFSCs可以分化為多種細(xì)胞類型，如脂肪細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等。未分化的HFSCs可明顯改善小鼠坐骨和脛骨神經(jīng)擠壓和橫斷損傷模型的功能[20]。向脫細(xì)胞異種移植物中添加HFSCs培養(yǎng)中提取的神經(jīng)元和施萬細(xì)胞，可顯著改善大鼠4 cm坐骨神經(jīng)缺損的預(yù)后[21]。但目前對HFSCs作用機(jī)制的研究仍停留在臨床前試驗(yàn)階段，其確切作用尚需臨床試驗(yàn)的確定。

1.2.5牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs) DPSCs存在于牙髓組織中，可表現(xiàn)出MSCs的特征，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，還可誘導(dǎo)成包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的多個(gè)譜系。已有研究表明，DPSCs可化學(xué)誘導(dǎo)三叉神經(jīng)節(jié)軸突生長，還可分化成施萬細(xì)胞或滋養(yǎng)施萬細(xì)胞以支持背根神經(jīng)節(jié)軸突的生長，并促進(jìn)髓鞘修復(fù)[22-23]。DPSCs還可分泌多種促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的營養(yǎng)因子[24]。此外，與骨髓基質(zhì)細(xì)胞相比，DPSCs具有更強(qiáng)的增殖能力和更大的克隆生成潛能，并擁有更多的干細(xì)胞/祖細(xì)胞群，由此可見，DPSCs具有強(qiáng)大的臨床適用性。

1.2.6肌源干/祖細(xì)胞(myogenic stem/progenitor cells，MDSPCs) 來源于骨骼肌的MDSPCs是目前研究最多的干細(xì)胞種類，可持續(xù)自我更新，并具有多能分化的潛能。有研究報(bào)道，MDSPCs可以被誘導(dǎo)分化成施萬細(xì)胞、神經(jīng)血管再生所需的神經(jīng)外膜/神經(jīng)內(nèi)膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及周細(xì)胞等，可用于神經(jīng)病變的修復(fù)[25]。周圍神經(jīng)損傷常伴有肌肉骨骼損傷，受損肌肉組織中的MDSPCs可分泌與肌肉組織神經(jīng)再生相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子[26]。MDSPCs可促進(jìn)周圍神經(jīng)再生和預(yù)防肌肉萎縮，但缺乏合適獲取部位，且相關(guān)研究證據(jù)仍有待進(jìn)一步完善。

1.3iPSCs 各型干細(xì)胞均存在自身局限性。人工誘導(dǎo)干細(xì)胞為克服胚胎干細(xì)胞的限制帶來了希望。Takahashi等[3]利用轉(zhuǎn)錄因子成功誘導(dǎo)出小鼠和人成纖維細(xì)胞的多能性。目前，對多種疾病中iPSCs的作用機(jī)制的認(rèn)識逐漸深入，并將iPSCs用于體外藥物篩選和疾病的療效評估[27]。除經(jīng)誘導(dǎo)向體細(xì)胞分化的方法外，學(xué)者還建立了iPSCs沿神經(jīng)譜系分化的方法[28]。iPSCs在分化過程中的效率低，且可變性較強(qiáng)。對中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)損傷動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，iPSCs具有促神經(jīng)再生潛力[29]。iPSC已被用于誘導(dǎo)神經(jīng)球的3-D培養(yǎng)，以維持神經(jīng)或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形成，促進(jìn)神經(jīng)生長及發(fā)育[30]。將組織工程生物可吸收神經(jīng)導(dǎo)管中的iPSCs植入PNI小鼠體內(nèi)，觀察48周發(fā)現(xiàn)，軸突再生和髓鞘化增強(qiáng)，但未形成畸胎瘤，表明iPSCs可應(yīng)用于PNI的修復(fù)和治療[31]。

iPSCs在倫理和免疫抑制方面優(yōu)于ESCs，但臨床應(yīng)用中仍存在染色體畸變、致瘤性等問題。干細(xì)胞移植臨床應(yīng)用的理想來源應(yīng)該具有個(gè)體化、免疫耐受性強(qiáng)、易獲取、非致瘤性、便于整合于宿主神經(jīng)組織以及高效替代等功能。

2 作用機(jī)制

干細(xì)胞移植對PNI的影響主要取決于其分化表型、增強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)作用以及促進(jìn)髓鞘形成的能力。干細(xì)胞可在適當(dāng)內(nèi)環(huán)境下經(jīng)誘導(dǎo)分化為用于周圍神經(jīng)損傷修復(fù)所需的細(xì)胞類型，如對于神經(jīng)生長發(fā)育有重要作用的施萬細(xì)胞。在神經(jīng)生長發(fā)育過程中，神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用不容忽視，微環(huán)境中神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平直接影響著干細(xì)胞移植作用效果。此外，移植干細(xì)胞在適當(dāng)條件下可有效促進(jìn)神經(jīng)髓鞘的形成并加速神經(jīng)損傷的修復(fù)。對干細(xì)胞移植修復(fù)受損周圍神經(jīng)作用機(jī)制的研究，將極大地促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)再生領(lǐng)域的發(fā)展。

2.1干細(xì)胞分化表型 干細(xì)胞的自我更新能力使大量目的細(xì)胞作用于損傷部位成為可能。干細(xì)胞遷移到受損神經(jīng)組織后繼續(xù)增殖，并在適當(dāng)微環(huán)境下分化為必要的細(xì)胞類型[32]。約5%的骨髓基質(zhì)細(xì)胞可在無特異性干預(yù)的情況下自發(fā)地轉(zhuǎn)分化為施萬細(xì)胞[33]。通過化學(xué)誘導(dǎo)、生物處理、基因轉(zhuǎn)染或注射前與神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，可有效地促進(jìn)體外干細(xì)胞向理想表型的預(yù)分化。MSCs誘導(dǎo)的代表性方案是接觸或由生長因子轉(zhuǎn)染生長因子β-巰基乙醇和全反式視黃酸，細(xì)胞因子毛喉素、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子等，尤其是骨髓基質(zhì)細(xì)胞可通過轉(zhuǎn)染缺口的跨膜和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域來表達(dá)NSCs標(biāo)志物，或在Noggin轉(zhuǎn)染后分化為神經(jīng)球細(xì)胞[34-36]。有實(shí)驗(yàn)表明，干細(xì)胞需在分化培養(yǎng)基中維持2周，且類施萬細(xì)胞必須與背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元共培養(yǎng)，以維持在近端神經(jīng)元軸索上的穩(wěn)定形態(tài)特征[37]。

通過預(yù)分化，施萬細(xì)胞標(biāo)志物可在治療中增加并維持更長時(shí)間。分化干細(xì)胞移植后，可加速橫斷軸突再生，其恢復(fù)程度可與施萬細(xì)胞移植后觀察到的恢復(fù)程度相當(dāng)，甚至更高[38]。另有研究報(bào)道，預(yù)分化可促進(jìn)移植后的細(xì)胞死亡，可能由于移植后機(jī)體主要組織相容性復(fù)合體的抗原能力增強(qiáng)，或移植后的細(xì)胞增殖能力較低所致[39]。MSCs的致瘤性是其潛在的缺陷之一，C17.2神經(jīng)干細(xì)胞移植大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型已顯示出較高的致瘤率[10]。

2.2神經(jīng)營養(yǎng)增強(qiáng)作用 除分化為細(xì)胞外，干細(xì)胞還可分泌具有生物活性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，并為神經(jīng)細(xì)胞的存活和神經(jīng)再生提供有利微環(huán)境[40]。除支持施萬細(xì)胞分化、成熟和增殖外，干細(xì)胞還可表現(xiàn)出更好地增強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)的性能。脂肪干細(xì)胞可能以神經(jīng)營養(yǎng)依賴的方式抑制胱天蛋白酶3活性，從而減輕背根神經(jīng)節(jié)損失[41]。微環(huán)境中生長因子的水平也會影響移植干細(xì)胞的效果，神經(jīng)損傷刺激神經(jīng)生長因子中和抗體可以消除體外骨髓基質(zhì)細(xì)胞對感覺和交感神經(jīng)軸突生長的刺激作用，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子中和抗體可降低脂肪干細(xì)胞對神經(jīng)再生的影響[42]。

2.3髓鞘化 髓鞘化也是決定PNI再生質(zhì)量和功能恢復(fù)的重要因素，多種類型的體細(xì)胞干細(xì)胞在體外表現(xiàn)出類施萬細(xì)胞的相關(guān)功能，并促進(jìn)受損神經(jīng)再髓鞘化[42]。通過合成大量髓鞘蛋白，如髓鞘堿性蛋白、P0和PMP22，對髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)起關(guān)鍵作用。與施萬細(xì)胞類似，分化成類施萬細(xì)胞的干細(xì)胞在體內(nèi)也具有支持再生神經(jīng)髓鞘生成的能力[43]。向自體靜脈導(dǎo)管注射骨髓基質(zhì)細(xì)胞，通過增強(qiáng)髓鞘因子信使RNA的表達(dá)，顯著增加了有髓軸突數(shù)量，改善了面神經(jīng)功能恢復(fù)[38]。牙齦源性MSCs和誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的移植可促進(jìn)周圍神經(jīng)的修復(fù)/再生，可能是通過拮抗髓鞘形成負(fù)性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(c-Jun)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Krox 20/EGR2)的調(diào)控，促進(jìn)施萬細(xì)胞的再髓鞘化作用[44]。

3 干細(xì)胞遞送

干細(xì)胞可以通過多種方式遞送。懸浮在培養(yǎng)基中的干細(xì)胞，可直接微注射到神經(jīng)末梢，但微注射可能對干細(xì)胞和精細(xì)的神經(jīng)內(nèi)結(jié)構(gòu)造成創(chuàng)傷，導(dǎo)致細(xì)胞分布異常；還可將干細(xì)胞懸浮在纖維蛋白基質(zhì)中，在修復(fù)位點(diǎn)周圍注射基質(zhì)[45]。在導(dǎo)管修復(fù)中，干細(xì)胞可注射在導(dǎo)管腔內(nèi)或?qū)Ч芑|(zhì)上。Tse等[46]通過表性分析利用噴墨打印法打印神經(jīng)細(xì)胞，打印后立即檢測發(fā)現(xiàn)，90%以上的膠質(zhì)細(xì)胞存活。三維打印的目的是在支架內(nèi)創(chuàng)建具有多種細(xì)胞類型的組織，用于模擬天然組織，提供所需的幾何形狀(如多通道、分叉和個(gè)性化結(jié)構(gòu))，允許定制神經(jīng)導(dǎo)管，精確匹配患者的特定神經(jīng)缺損。

靜脈、動脈等天然導(dǎo)管中富含膠原、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，有助于細(xì)胞黏附和軸突導(dǎo)向。商業(yè)天然導(dǎo)管通常充滿膠原和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。人工導(dǎo)管主要由聚乙醇酸、絲素蛋白、聚ε-己內(nèi)酯、聚羥基丁酸酯、硅酮管等合成。近年來，生物和納米纖維導(dǎo)管的發(fā)展迅速，但其在基于細(xì)胞治療的周圍神經(jīng)損傷以及廢物降解和降解速度等方面的應(yīng)用仍面臨諸多問題。天然材料可以無毒的方式降解，且降解速度較快；而部分合成聚合物在降解過程中會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，不利于微環(huán)境和細(xì)胞活性[47]。中空腔管由組織有序的多纖維海綿或秩序較差的膠原海綿組成，與中空腔管相比，基底膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)更有利于軸突再生。進(jìn)一步完善干細(xì)胞遞送系統(tǒng)可改善細(xì)胞分布，提高其用于神經(jīng)損傷修復(fù)的療效。

4 小 結(jié)

周圍神經(jīng)再生是動態(tài)的過程。目前，干細(xì)胞移植仍處于臨床前研究階段，尚未應(yīng)用于臨床實(shí)踐。干細(xì)胞移植過程中基因操作、細(xì)胞不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生、干細(xì)胞的歸巢和遷移仍是重要的亟待解決的問題。干細(xì)胞移植的簡單應(yīng)用已初顯成效，但與傳統(tǒng)神經(jīng)修復(fù)技術(shù)相比，其治療效果仍較差，尚需要大量的臨床前研究對不同類型干細(xì)胞的作用進(jìn)行比較。此外，最佳的施萬細(xì)胞分化方式、確切的潛在作用機(jī)制等仍不確定，故難以得出明確的結(jié)論。骨骼肌來源干細(xì)胞擁有理想種子細(xì)胞的所有優(yōu)點(diǎn)，且其取材容易、增殖穩(wěn)定、具有多向分化潛能。隨著組織工程學(xué)的迅速發(fā)展，干細(xì)胞移植治療周圍神經(jīng)損傷將有廣闊的應(yīng)用前景。