lncRNA與miRNA相互調(diào)控作用機(jī)制及其在胃癌中的影響

陳為凱 張亞男 于建平 汪文杰 余穩(wěn)穩(wěn) 徐子鵬 韓博強(qiáng) 劉宏斌

胃癌(gastric cancer，GC)是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因,占全球惡性腫瘤死亡人數(shù)的8.8%[1]。在中國(guó)，2014年GC的病死率為21.48/105，約29.4萬(wàn)人，位居第3位[2]。亞洲是GC高發(fā)地區(qū)，最新數(shù)據(jù)顯示，在2000～2014年我國(guó)GC5年生存率仍低于40%[3]。隨著基因芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人類基因組中僅不到2%的基因具有編碼功能，非編碼基因已獲得廣大專家學(xué)者的高度重視。非編碼微小RNA(micro noncoding RNA，miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long nocoding RNA，lncRNA)已成為腫瘤領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明，二者不僅分別在腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其間還存在諸多交叉調(diào)控。為探討lncRNA與miRNA相互調(diào)控作用及其在GC中的影響，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，現(xiàn)綜述如下。

一、lncRNA與miRNA的相互調(diào)控作用

1.miRNA促進(jìn)lncRNA的衰減：在細(xì)胞中，miRNA可靶向調(diào)控lncRNA，通過(guò)降低lncRNA的穩(wěn)定性而造成其衰減。眾所周知，miRNA是通過(guò)與其靶基因直接結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)靶基因降解和(或)抑制其翻譯過(guò)程。Chen等[4]研究表明，在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中，lncRNA-let與miR-548k的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),miR-548k可直接靶向抑制lncRNA-let的表達(dá)，進(jìn)一步下調(diào)p53和上調(diào)NF90的表達(dá)。miR-548k的高表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及患者生存率顯著相關(guān)。miR-548k能促進(jìn)體外培養(yǎng)的ESCC細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)，而miR-548k對(duì)ESCC的影響則依賴于其對(duì)lncRNA-let的直接結(jié)合并抑制lncRNA-let的表達(dá)。同樣在ESCC中，Wang等[5]利用RNA純化-qPCR法分離染色質(zhì)，發(fā)現(xiàn)miR-196A能與lncRNA Gas5結(jié)合。同時(shí)熒光素酶報(bào)告分析表明miR-196A可與lncRNA Gas5的第7外顯子結(jié)合，且Gas5和miR-196A都能與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)的關(guān)鍵成分Ago 2結(jié)合。提示Gas5在ESCC中起抑癌基因的作用，并受miR-196A參與RISC的調(diào)控。在此之前，多項(xiàng)研究證明在各種病理生理過(guò)程中均存在miRNA誘導(dǎo)的lncRNA表達(dá)抑制，包括lncRNA p21、lncRNA HOTAIR、lncRNA MALAT1、lncRNA LOC85194、lncRNA PTTCC3及l(fā)ncRNA H19等，提示miRNA對(duì)lncRNA的抑制機(jī)制可能是廣泛存在的[6～8]。

2.lncRNA作為miRNA海綿/誘餌:與編碼RNA共享miRNA反應(yīng)元件(microRNA response elements，MRE)的lncRNA可能存在類似的miRNA靶向序列，競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA與mRNA間的相互作用。這些lncRNA被稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，可以作為miRNA的“海綿”或“誘餌”，減少可用miRNA的數(shù)量，并有利于提高目標(biāo)mRNA的翻譯。近來(lái)，Zhou等[9]在探索lnc HAND 2-AS1在結(jié)直腸腫瘤性疾病的作用時(shí)，通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)lnc HAND 2-AS1與miR-1275形成互補(bǔ)堿基。在HCT116細(xì)胞系中，lnc HAND 2-AS1過(guò)表達(dá)可明顯抑制miR-1275的表達(dá)。此外，miR-1275的高表達(dá)抑制了lnc HAND 2-AS1的表達(dá)，而抑制miR-1275的表達(dá)則促進(jìn)了HCT 116細(xì)胞lnc HAND 2-AS1的表達(dá)。為驗(yàn)證lnc HAND 2-AS1是否與miR-1275相互作用，研究者其采用熒光素酶報(bào)告法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1275可以降低pmirGLO-HAND 2-AS1-WT在HCT 116細(xì)胞中的熒光素酶強(qiáng)度。此外，qRT-PCR分析顯示lnc HAND 2-AS1與miR-1275在大腸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此研究表明lnc HAND 2-AS1在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中中充當(dāng)miR-1275海綿。Wang等[10]也使用類似實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXA-AS2同樣作為ceRNA調(diào)控miR-520c-3p的表達(dá)。

3.lncRNA/miRNA與mRNA的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合:非編碼RNA的調(diào)控機(jī)制與蛋白質(zhì)編碼RNA一樣復(fù)雜。一方面，非編碼RNA可能受到多種機(jī)制的調(diào)控，如基因突變、DNA拷貝的改變、轉(zhuǎn)錄缺陷和表觀遺傳改變等。例如，lnc BACE1AS可以與miR-485-5p競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)拮抗miR-485-5p誘導(dǎo)的mRNA降解來(lái)抑制lnc BACE 1的表達(dá)下降[11]。同樣，在使用抗腫瘤藥抑制宮頸癌HELA細(xì)胞內(nèi)源性let-7i后，另一種lncRNA Hox反義RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)仍是富集、穩(wěn)定的[12]。Franklin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼N-ras功能性RNA(NCNRFR)可與let-7競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合含有l(wèi)et-7位點(diǎn)的mRNA，同時(shí)也逆轉(zhuǎn)了let-7對(duì)mRNA的抑制作用。Faghihi等[14]在β-淀粉樣前體蛋白切割酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，Bace 1)的mRNA中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)miR-485-5p結(jié)合位點(diǎn)，lnc Bace 1反轉(zhuǎn)錄本通過(guò)與miR-485-5p競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Bace 1從而阻止miRNA抑制Bace 1。

4.部分miRNA由lncRNA產(chǎn)生:曾有研究報(bào)道,lnc MD1可分別從內(nèi)含子和外顯子生成miR-206和miR-133[15]。同時(shí)，lnc H19已被證實(shí)能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生miR-675[16]。

二、lncRNA與miRNA間相互作用對(duì)GC的影響

lncRNA和miRNA間的相互調(diào)控參與著腫瘤性疾病的各個(gè)病理生理過(guò)程。這里，將根據(jù)現(xiàn)有的lncRNA的主要類型，概述lncRNA-miRNA在GC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要作用。

1.H19：H19是最早報(bào)道的印記基因之一，最初，人們發(fā)現(xiàn)H19在胚胎中有較高水平的表達(dá)，其在進(jìn)化過(guò)程中的高度保守性表明其一定具有重要作用。H19是一個(gè)2.3kb的lncRNA，由位于人類染色體11p15.5上的H19/Igf 2基因簇轉(zhuǎn)錄而成[17]。H19最初被認(rèn)為具有抑制腫瘤的能力，經(jīng)過(guò)一系列研究證實(shí)，H19被確認(rèn)為致癌調(diào)節(jié)因子，在膀胱癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等各種惡性腫瘤疾病中均有明顯的過(guò)表達(dá)，H19可能是腫瘤細(xì)胞或組織特異性基因，但其作為腫瘤進(jìn)展的作用是抑制或促進(jìn)仍有爭(zhēng)議[18,19]。

Liu等[20]在一系列研究中發(fā)現(xiàn)，H19依賴于miR-675來(lái)增強(qiáng)GC AGS細(xì)胞的增殖和侵襲，并且miR-675的表達(dá)與GC患者中的H19呈正相關(guān)。隨后，腫瘤抑制基因結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1(RUNX1)被證實(shí)是H19/miR-675軸的下游分子，因?yàn)镠19或miR-675的過(guò)表達(dá)顯著降低了AGS細(xì)胞中的RUNX1表達(dá)，并且敲除了H19或miR-675后RUNX1表達(dá)量增高。更重要的是，Liu進(jìn)一步證明RUNX1的引入抑制了H19/miR-675誘導(dǎo)的AKT/mTOR途徑的激活。研究者認(rèn)為，RUNX1是H19/miR-675軸與AKT/mTOR信號(hào)通路之間聯(lián)系的關(guān)鍵分子，并且H19/miR-675誘導(dǎo)的GC進(jìn)展中的關(guān)鍵介質(zhì)。同樣，Yan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，作為miR-675的前體，H19/miR-675軸通過(guò)FADD/caspase-8/caspase-3信號(hào)通路促進(jìn)了GC的發(fā)生、發(fā)展。 在GC細(xì)胞株SGC-7901和MKN 45中，Zhou等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-141通過(guò)與H19結(jié)合而抑制其的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致H19的降解。miR-141高表達(dá)后，包括miR-675、IGF1和IGF2在內(nèi)的H19靶點(diǎn)均呈下降趨勢(shì)。同時(shí)，H19還對(duì)miR-141的靶基因Drosha、Dicer以及zeb 1進(jìn)行了調(diào)控。關(guān)于H19臨床意義和作用機(jī)制多種多樣，諸多研究表明H19在不同水平上可能有助于評(píng)估GC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，H19有望成為GC治療的靶點(diǎn)。

2.HOTAIR:HOTAIR是一種已知的含有2158個(gè)核苷酸的lncRNA，它不編碼任何蛋白質(zhì)，而是通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。HOTAIR被認(rèn)為與多種人類腫瘤性疾病有關(guān)，它的高表達(dá)可以促進(jìn)包括GC在內(nèi)大多數(shù)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等病理生理過(guò)程[23]。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，GC組織HOTAIR的表達(dá)量較高，miR-217表達(dá)量較低，且miR-217的低表達(dá)及HOTAIR的高表達(dá)與GCTNM分期相關(guān)。同時(shí)，miR-217的表達(dá)與HOTAIR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 HOTAIR的異常表達(dá)促進(jìn)了GC細(xì)胞增殖和遷移，抑制了miR-217表達(dá)并增強(qiáng)了GPC5和PTPN14的表達(dá)。此外，研究者還證明了HOTAIR的過(guò)表達(dá)提高了GC細(xì)胞紫杉醇和阿霉素的耐藥，miR-217的過(guò)表達(dá)則相反。這些數(shù)據(jù)表明HOTAIR的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制miR-217表達(dá)從而增強(qiáng)了GC細(xì)胞中的紫杉醇和阿霉素的耐藥。Cheng等[25]同樣發(fā)現(xiàn)在GC細(xì)胞中，HOTAIR可直接與miR-34a結(jié)合并通過(guò)PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控GC細(xì)胞的順鉑耐藥性。

3.MEG 3:lncRNA MEG 3位于人類染色體14q32.3上，是一種在許多正常組織中表達(dá)的lncRNA。然而，在許多腫瘤和腫瘤衍生細(xì)胞系中，它經(jīng)常丟失、突變或降低。適當(dāng)恢復(fù)MEG 3表達(dá)水平可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬[26]。這些發(fā)現(xiàn)提示MEG 3是具有抑癌活性的lncRNAs之一。Dan等[27]在GC組織和細(xì)胞系(MKN74、MKN45、SGC7901、AGS)中觀察到MEG 3表達(dá)量較低。Dan通過(guò)pcDNA3.1-MEG 3轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的MEG 3顯著抑制了GC細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)揭示MEG 3和miR-21之間存在靶向關(guān)系。在GC組織和細(xì)胞系中觀察到過(guò)表達(dá)的miR-21。熒光素酶報(bào)告測(cè)定的結(jié)果表明miR-21是MEG 3的靶基因，并且實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明miR-21的表達(dá)受MEG 3的負(fù)調(diào)節(jié)。此外，過(guò)表達(dá)的miR-21可促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。然而，pcDNA3.1-MEG 3轉(zhuǎn)染可以抵消miR-21模擬物對(duì)GC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，表明MEG 3通過(guò)抑制miR-21表達(dá)影響GC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。最后，小鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)的MEG 3還可以通過(guò)抑制miR-21的表達(dá)來(lái)抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Dan的研究揭示了MEG 3/miR-21軸在GC進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用，并為GC治療提供了新的潛在治療策略。2015年，Peng等[28]經(jīng)研究證實(shí)，在GC組織中MEG 3的表達(dá)水平與正常組織比較降低并與GC患者密切相關(guān)，MEG 3作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-181a調(diào)控Bcl-2的表達(dá)從而抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

4.GAPLINC:GAPLINC是一種新發(fā)現(xiàn)的924bp的lncRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)域含有MRE。Diao等[29]在GC組織中發(fā)現(xiàn)GAPLINC和MAPK 1之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。GAPLINC依賴于MAPK 1從而對(duì)GC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的促進(jìn)作用。最后，Diao等[29]首次證明了GAPLINC充當(dāng)miR-378分子海綿，從而促進(jìn)了MAPK 1的表達(dá)。

5.NNT-AS1:lncRNA NNT-AS1在多類腫瘤中具有癌基因的作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等多種病理生理過(guò)程。近來(lái)，Chen等[30]深入地研究了NNT-AS1在GC發(fā)生中的生物學(xué)作用。結(jié)果表明，與癌旁正常組織和正常細(xì)胞系比較，GC組織和細(xì)胞系中NNT-AS1的表達(dá)水平明顯上調(diào)。NNT-AS1異位高表達(dá)提示GC患者預(yù)后不良。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NNT-AS1基因敲除抑制了GC細(xì)胞的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)GC細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。在體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)中，NNT-AS1沉默抑制了GC細(xì)胞的生長(zhǎng)。生物信息學(xué)在線程序預(yù)測(cè)miR-424的目標(biāo)是NNT-AS1的3′UTR。Chen通過(guò)熒光素酶報(bào)告法、RNA免疫沉淀法(RIP)和RNA下拉法證實(shí)了NNT-AS1和miR-424之間的分子結(jié)合，從而共同形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。證實(shí)了E2F1是NNT-AS1/miR-424的靶基因，NNT-AS1以“海綿”的形式作用于miR-424/E2F1從而促進(jìn)了GC的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。

6.BLACAT1:lncRNA膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物-1(bladder cancer associated transcript-1，BLACAT1)，又被稱為lnc UBC 1，位于人類染色體1q32.1上，其轉(zhuǎn)錄本為2616kb，只有一個(gè)外顯子，首次被報(bào)道為與膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后負(fù)相關(guān)。Wu等[31]研究了BLACAT1在GC化學(xué)治療耐藥中的作用和潛在調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果顯示，與奧沙利鉑敏感GC組織和親代細(xì)胞系比較，奧沙利鉑抗性GC組織和細(xì)胞中BLACAT1表達(dá)上調(diào)。在體外，BLACAT1敲除降低了耐藥相關(guān)基因和ABCB1蛋白的表達(dá)水平。此外，BLACAT1敲除顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡、侵襲和奧沙利鉑的IC50值。在體內(nèi)，敲出BLACAT1可抑制GC細(xì)胞的生長(zhǎng)。生物信息學(xué)工具和熒光素酶測(cè)定表明，miR-361均可與BLACAT1和mRNA ABCB1的3′-UTR特異性結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了BLACAT1/miR-361/ABCB1調(diào)節(jié)途徑。其研究結(jié)果表明，BLACAT1可通過(guò)靶向調(diào)控miR-361促進(jìn)ABCB1蛋白表達(dá)，加速了奧沙利鉑對(duì)GC的耐藥性，為GC的化學(xué)治療耐藥提供了新的見(jiàn)解。

三、展 望

綜上所述，非編碼RNA作為多水平調(diào)控基因表達(dá)的中心分子，可以影響細(xì)胞分裂、增殖、分化、衰老和凋亡等各個(gè)方面。非編碼RNA調(diào)控異常參與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展，通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨著腫瘤的發(fā)展，不同種類的非編碼RNA，特別是lncRNA和miRNA之間的相互作用也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。本文綜述了GC中l(wèi)ncRNA與miRNA之間的相互調(diào)控機(jī)制，著重討論了它們?cè)贕C發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。上述研究表明，lncRNA可以通過(guò)多種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制充當(dāng)miRNA的調(diào)控者或效應(yīng)者，共同調(diào)控基因表達(dá)，最終影響GC的進(jìn)展。雖然現(xiàn)有研究對(duì)非編碼RNA的探索已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，但筆者對(duì)GC中l(wèi)ncRNA-miRNA相互作用機(jī)制的了解還不夠充分，還需要在以下幾方面進(jìn)行更深入的探索：(1)深度分析國(guó)內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，充分利用生物信息學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步揭示lncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)意義。(2)加強(qiáng)實(shí)施大樣本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，推進(jìn)lncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的實(shí)際應(yīng)用。(3)對(duì)lncRNA相關(guān)miRNA進(jìn)行系統(tǒng)分析，充分闡明lncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。lncRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的明確或許可為GC提供全新的臨床診療策略。